含尿嘧啶DNA糖基化酶的聚合酶链反应检测血清HBV DNA

为探讨含ｄＵＴＰ／尿嘧啶ＤＮＡ糖基化酶（ｄＵＴＰ／ＵＤＧ）ＰＣＲ试剂（抗污染ＰＣＲ试剂，ＰＣＲ－ｄＵＴＰ／ＵＤＧ）抗ＰＣＲ产物污染的能力及其在临床检测中的应用，采用该试剂检测２０４份病毒性肝炎患者血清中ＨＢＶ ＤＮＡ，并与普通ＰＣＲ试剂比较。结果显示：抗污染ＰＣＲ试剂有较强的抗污染能力，至少可阻止１００ｎｇ的ＰＣＲ产物的污染。该试剂与地伐辛素探针分子杂交所测结果的符合率（８９．３２％）高于普通ＰＣ     

尿嘧啶DNA糖苷酶防止PCR产物污染及其对核酸杂交的影响

目的 采用ＰＣＲ微板核酸杂交ＥＬＩＳＡ分析脲嘧啶ＤＮ糖苷酶（ＵＮＧ／ＵＤＧ）防止ＰＣＲ产物污染及其对ＰＣＲ扩增效率的影响。探讨在不同Ａ／Ｔ含量的微生物中含尿嘧啶的ＰＣＲ产物对核酸杂交的影响。方法 以３组ｄＵＴＰ含量不同的ＰＣＲ产物作模板，抗污染组用ＵＮＧ处理，直接进行再次扩增。用微板核酸杂交ＥＬＩＳＡ检测第二次ＰＣＲ扩增的结果。结果 抗污染组中含ｄＵＴＰ的ＰＣＲ产物作模板，结果为阴性，而以不含ｄＵ     

用尿嘧啶－DNA－糖基化酶控制聚合酶链反应的产物污染

聚合酶链反应（ＰＣＲ）灵敏度极高，痕量的ＰＣＲ产物能污染新的ＰＣＲ体系（称为产物污染）导致假阳性结果，我们通过在所有的ＰＣＲ扩增中掺入ｄＵＴＰ使ＰＣＲ产物含“ｄＵ”，在以后的ＰＣＲ扩增前用尿嘧啶－ＤＮＡ糖基化酶（Ｕｒａｃｉｌ－ＤＮＡ－Ｇｌｙｃｏｌａｓｅ，ＵＤＧ）处理，然后加热去除ＵＤＧ活性防止了产物污染。ＵＤＧ切割磷酸糖骨架上的尿嘧啶，可阴止ＤＮＡ聚合酶对它的复制，而对普通ＤＮＡ（即含”ｄＴ”）无影响。因为ＵＤＧ不与ｄＵＴＰ反应，而且在ＰＣＲ扩增前加热变性失活，使含尿嘧啶的污染物的污染得到很好控制。     

用尿嘧啶—DNA—糖基化酶控制聚合酶链反应的产物污染

聚合酶链反应灵敏度极高，痕量的ＰＣＲ产物能污染新的ＰＣＲ体系导致假阳性结果。我们通过在所有的ＰＣＲ扩增中渗入ｄＵＴＰ使ＰＣＲ产物含“ｄＵ”，在以后的ＰＣＲ扩增前用尿嘧啶－ＤＮＡ糖基化酶处理，然后加热去除ＵＤＧ活性防止了产物污染。     

双带PCR提高检测血清HBV—DNA质量的意义

应用双带ＰＣＲ方法（ＤＢ－ＰＣＲ）检测了２４０份血清中ＨＢＶ－ＤＮＡ。该方法能直接观察和判断假阴性和假阳性结果，提高了检测的准确性，与国内其它ＰＣＲ试剂比较，符合率分别为９４．０５％（ＤＢ－ＰＣＲ／华美产品）和９５．２８％（ＤＢ－ＰＣＲ／长城产品），ＨＢｅＡｇ阳性的血清，经ＤＢ－ＰＣＲ检测ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性者达９３．５５％（２９／３１）ＰＣＲ产物Ｓｏｕｔｈｅｍｂｌｏｔ后能与ＨＢＶ－ＤＮＡ探针杂交。     

用PCR技术标记双链DNA探针

利用ＰＣＲ技术制备生物素或地高辛标记的ＤＮＡ探针，经原位杂交试验及敏感性和特异性检测，均取得满意效果，ＰＣＲ标记法具有经济，快速，简易和标记量大等优点，实践中发现Ｂｉｏ／Ｄｉｇ－１１－ＵＴＰ的质量，ｄＴＴＰ和Ｄ－１１－ｄＵＴＰ的比例及起始ＤＮＡ模板浓度是标记成败的关键。     

小鼠α2(Ⅰ)胶原基因DNA结合蛋白研究

目的：初步分析小鼠α２（Ⅰ）胶原基因上游５‘－ＵＴＲ近端８００ｂｐ（－７８０￣５４ｂｐ）序列的ＤＮＡ结合蛋白。方法：ＰＣＲ扩增小鼠α２（Ⅰ）胶原基因－２５８￣＋５４ｂｐ,－５１９￣－２４８ｂｐ,－７４１￣－５０１ｂｐ片段,Ｄｉｇ－ｄＵＴＰ末端标记ＰＣＲ产物,与经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ并转印至膜上的胶原产生细胞的核抽提物进行ＤＮＡ－蛋白质结合反应,以抗Ｄｉｇ抗体检测结合反应信号。结果：Ⅰ型胶原基因上游５’     

随机扩增多态DNA技术在地高辛标记HCMV DNA探针中的应用研究

应用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ技术结合地高辛非放射性标记系统制备了人巨细胞病毒ＤＮＡ探针，并与常规随机引物法进行对照。ＲＡＰＤ－ＰＣＲ制备的ＨＣＭＶＤＮＡ探针长度呈多态性，扩增过程中不需合成特异引物，探针特异性强，产量高，用５０ｎｇＨＣＭＶＤＮＡ模板即可制备８．０μｇ探针；标记体系中ＲＡＰＤ－ＰＣＲ方法Ｄｉｇ－ｄＵＴＰ浓度为５．２％。表明ＲＡＰＤ－ΡＣＲ技术可用于少量ＤＮＡ模板制备大量ＤＮＡ探针，适用于原位杂交等需高浓度探针的核酸杂交及临床大量标本的测试，是一种经济方便的探针制备技术     

随机扩增多态DNA技术在地高辛标记HCMV DNA探针中的应用研究

应用ＲＥＡＰＤ－ＰＣＲ技术结合地高辛非放射生标记制备了人巨细胞病毒ＤＮＡ探针，并与常规随机引物法进行对照。ＲＡＰＤ－ＰＣＲ制备的ＨＣＭＶ ＤＮＡ探针长度呈多态性，扩增过程中不需合成特异引物，探针特异性强，产量高，用５０ｍｇ ＨＣＭＶ ＤＮＡ模板即可制备８．０μｇ探针；标记体系中ＲＡＰＤ－ＰＣＲ方法Ｄｉｇ－ｄＵＴＰ浓度为５．２％。     

人IL—3cDNA探针制备及应用

采用多聚酶连反应（ＰＣＲ）扩增人ＩＬ—３ｃＤＮＡ片段,以地高辛（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ—１１—ｄＵＴＰ）为标记物,随机引物法标记ＩＬ—３ｃＤＮＡ探针。探针经斑点杂交和核酸原位杂交证明：用制备ＩＬ—３ｃＤＮＡ探针检测细胞ＩＬ－－３ｍＲＮＡ表达具有特异性强,灵敏度高,使用简便,杂交结果直观,探针可较长时间保存和无放射性污染等优点。     

Wistar雄性大鼠DNA基因组的多态性分析

使用一种随机引物“Ｐ２（ＣＧＧＣＣＧＧＴＡ）对正常Ｗｉｓｔａｒ雄性大鼠ＤＮＡ基因组进行ＲＡＰＤ－ＰＣＲ分析，扩增产物呈现出多态性ＤＮＡ图谱，其中ＤＮＡ片段分子大小依次为：１４３９、１３３４、１１２２、７０８、５７５、５３７、４７９、３１６ｂｐ。ＲＡＰＤ－ＰＣＲ技术简便、快速。     

双色FISH检测21号染色体及DSCR Cosmid克隆制图

应用Ｂｉｏｔｉｎ－１６－ｄＵＴＰ和Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－１１－ｄＵＴＰ分别标记人２１／１３号染色体着丝粒区ＤＮＡ探针（Ｄ１３ＺＩ／Ｄ２１ＺＩ）和Ｄｏｗｎ综合征核心区（ＤＳＣＲ）ＣｏｓｍｉｄＤＮＡ探针，与人类正常二倍体染色体进行原位杂交（ＩＳＨ），并用相应的免疫荧光系统检测杂交信号，在两条１３号和两条２１号染色体着丝粒区显示绿色（ＦＩＴＣ）信号；在两条２１号染色体长臂（２１ｑ２２）显示红色（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）信号。双色ＦＩＳＨ为检测２１号染色体数目和结构异常提供了可靠的手段，为基因在染色体上制图提供了有效的方法。     

PCR法检测淋球菌,沙眼衣原体及解脲支原体感染

目的：评价聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术对性病性尿道炎及宫颈炎诊断的临床实用价值。方法：采用ＰＣＲ法、淋球菌（Ｎｇ）涂片／培养、沙眼衣原体直接免疫荧光检查（ＣｔＤＩＦＡ）和解脲支原体（Ｕｕ）培养平行检测了１１９例患者的１８９份尿道／宫颈拭子标本。结果：以Ｎｇ涂片／培养、ＣｔＤＩＦＡ和Ｕｕ培养为对比标准，ＮｇＰＣＲ、ＣｔＰＣＲ和ＵｕＰＣＲ的敏感性分别为１００％（２８／２８）、９６９％（３１／３２）和９３３％（４２／４５），特异性分别为９４５％（８６／９１）、９１９％（８０／８７）和９４６％（７０／７４）。治疗结束后１周～２周内复查仍有２５９％（２１／７０）患者ＰＣＲ未阴转。结论：ＰＣＲ技术可以敏感、特异地检测泌尿生殖道标本中的ＮｇＤＮＡ、ＣｔＤＮＡ和ＵｕＤＮＡ，具有简便、快速的优点，然而对治疗后短期内复诊患者，似不宜仅以ＰＣＲ阳性结果作为重复治疗的依据。     

用PTVS检测t（14；18）PCR产物的DNA序列

为确定聚合酶链反应（ＰＣＲ）和地高辛（ＤＩＧ）系统检测ｔ（１４；１８）的特异性，我们采用ＰＧＥＭ－Ｔｖｅｃｔｏｒ系统（ＰＴＶＳ）和双脱氧链终止技术克隆并测定了ＲＬ细胞系和一个ＮＨＬ患者－Ａｍｂｒｏｓｅｎ的ｔ（１４；１８）ＰＣＲ产物的ＤＮＡ序列。结果表明两者的ＰＣＲ扩增产物均为ｂｃｌ－２－ＪＨ融合基因片段，证实ＰＣＲ－ＤＩＧ系统是一种特异的检测ｔ（１４；１８）的方法。同时还表明用ＰＴＶＳ对ＰＣＲ。产物进行克隆测序优于直接用双脱氧法测序。     

用PCR检测人淋巴组织中弓形虫

将淋巴结病理组织提取ＤＮＡ后，用Ｔｇ－ＤＮＡＰＣＲ药盒体外扩增弓形虫ＤＮＡ。结果显示，１２０例淋巴结病理标本中，７例可检出２１０ｂｐ的扩增产物，其中３例ＨＤ（３／３２），２例ＮＨＬ（２／４１），２例ＣＬ（２／４７）。取ＰＣＲ扩增产物进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔ杂交试验（ＰＣＲ－ＳＢＨ），发现除原有７例阳性外，ＣＬ患者中另１例阳性；总检出率为６．６７％（８／１２０）。ＨＤ，ＮＨＬ及ＣＬ的阳性率分别为９．３８％，４．８８％和６．３８％。     

地高辛标记核酸探针的应用

本工作中以肿瘤多药耐受基因ＭＤＲ－１的ｃＤＮＡ的限制片段（５Ａ）为模板ＤＮＡ，把模板ＤＮＡ用随机引物法标记上地高辛标记的脱氧尿苷三磷酸ＤＩＧ－ｄＵＴＰ。将此地高辛标记的核酸探针与变性的同源质粒及部分头颈肿瘤组织ＲＮＡ进行点杂交后，用抗地高辛－碱性磷酸酶及其底物进行酶联免疫分析，探讨了应用这种非放射性地高辛标记的ＤＮＡ探针及其检测系统的敏感性以及应用价值。     

PCR扩增杂交试验检测HCV-RNA

目的：评价ＰＣＲ扩增杂交试验（ＰＣＲ－Ｈｙｂ）在ＨＣＶ－ＲＮＡ检测中的应用。方法：对２８例丙型肝炎患者和５例非丙型肝炎患者采用ＰＣＲ扩增杂交（ＰＣＲ－Ｈｙｂ）试验、套式ＲＴ－ＰＣＲ及ｂＤＮＡ信号扩增试验检测ＨＣＶ－ＲＮＡ。结果：三种方法的阳性率分别为７１．３４％（２０／２８）、７８．５７％（２２／２８）、１００％（２７／２７）。ＰＣＲ－Ｈｙｂ与套式ＲＴ－ＰＣＴ的阳性符合率为９３．９３％（３１／３３），与ｂＤＮＡ结果呈现较好的相关性（ｒ＝０．８０８３）。结论：ＰＣＲ－Ｈｙｂ具有较好的特异性和敏感性，并在抗病毒治疗时的动态观察有一定价值。     

荧光探针定量PCR及其临床应用

荧光探针定量ＰＣＲ（ＦＱ－ＰＣＲ）由ＰＣＲ与荧光素标记的探针杂交技术相结合，可用来检测临床标本中各种病原微生物的ＲＮＡ／ＤＮＡ。具有快速、简便、敏感、特异之优点。因其在单一试管内进行ＰＣＲ扩增，可避免普通ＰＣＲ由于污染所造成的假阳性，并可定量检测各种病原微生物的ＲＮＡ／ＤＮＡ含量。     

地高辛标记核酸探针的应用

本工作中以肿瘤多药耐受基因ＭＤＲ－１的ｃＤＮＡ的限制片段（５Ａ）为模板ＤＮＡ，把模板ＤＮＡ用随机引物法标记上地高辛标记的脱氧尿苷三磷酸ＤＩＧ－ｄＵＴＰ。将此地高辛标记的核酸探针与变性的同源质粒及部分头颈肿瘤组织ＲＮＡ进行点杂交后，用抗地高辛－碱性磷酸酶及其底物进行酶联免疫分析，探讨了应用这种非放射性地高辛标记的ＤＮＡ探针及其检测系统的敏感性以及应用价值。     

地高辛掺入法检测HCV RNA含量在肝病诊断中的应用

目的;研究血清ＨＣＶ ＲＮＡ含量与ＨＣＶ感染者肝病程度的关系。方法：应用地高辛掺入法检测血清ＨＣＶ ＲＮＡ含量。在ＰＣＲ过程中将ＤＩＧ－ｄＵＴＰ掺入到ＰＣＲ产物叶地用ＰＣＲ ＥＬＩＳＡ法检测ＰＣＲ产物,结合标准参考样本而达定量目的。结果;丙肝后肝硬化组血清ＨＣＶ ＲＮＡ含量显著高于丙型肝炎组。