血管内皮生长因子C靶向RNA干扰重组载体的构建和效应检测

目的:构建针对人血管内皮生长因子C小干扰RNA表达载体,并观察其在胃癌细胞中的干扰效果。方法:实验于2006-02/2007-02在河南省分子医学重点学科开放实验室完成。①实验材料:小干扰RNA表达载体pSilencer3.1为美国Ambion公司产品;胃癌细胞SGC7901为河南省分子医学重点学科开放实验室保存;血管内皮生长因子C基因的干扰片断和聚合酶链反应引物(152bp)由上海生工生物公司合成。②实验过程:根据pSilencer3.1-H1载体要求设计靶向血管内皮生长因子C基因的两对小干扰RNA,退火后连接入载体相应位点,构建重组表达质粒。经酶切和测序鉴定后分别转染胃癌细胞株SGC-7901,经G418筛选,获得稳定表达的细胞株。③实验评估:采用反转录-聚合酶链反应和Westernblot法检测血管内皮生长因子CmRNA和蛋白水平的表达。结果:①重组质粒的酶切、核苷酸序列分析结果:经酶切和测序鉴定证实成功构建了血管内皮生长因子C小干扰RNA表达载体,建立了稳定转染细胞株。②稳定转染的细胞株中血管内皮生长因子CmRNA和蛋白表达:反转录-聚合酶链反应和Western blot显示转染后血管内皮生长因子C表达与对照组相比有不同程度的降低,以pSilencer3.1-neo-VEGF-C1尤为明显,抑制血管内皮生长因子C表达,不影响细胞的生长。结论:成功构建了血管内皮生长因子C小干扰RNA表达载体及稳定转染的胃癌细胞株。     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞☆

背景:血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义.目的:克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建 pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性.方法:采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和 DNA 测序的方法对提取和重组 DNA 进行鉴定.pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定.结果与结论:构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165 cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段.提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性.     

靶向人血管内皮生长因子-C基因的shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建靶向人血管内皮生长因子-C(VEGF-C)基因的shRNA真核表达载体并检测其对靶基因的沉默效应.方法:根据靶基因VEGF-C序列,设计、合成编码其shRNA的互补寡核苷酸序列,克隆至线性化的pSIREN-RetroQ载体中并对重组质粒进行酶切分析及测序鉴定;脂质体介导重组质粒转染乳腺癌MCF-7细胞株,荧光定量PCR及Westen-blot检测其对靶基因VEGF-C表达的影响.结果:酶切及测序鉴定重组质粒pSIREN-VEGF-C的序列正确;转染重组质粒后乳腺癌MCF-7细胞中VEGF-C mRNA及蛋白表达均明显下调,抑制率分别为95%及100%(P＜0.05).结论:成功构建了靶向人VEGF-C基因的shRNA真核表达载体,并在乳腺癌MCF-7细胞中高效、特异地发挥靶基因沉默作用.     

靶向血管内皮生长因子基因的微小RNA真核表达载体的构建

背景:有研究表明微小RNA及潜在靶基因在肝癌中起重要作用,但具体机制仍不清楚。目的:构建靶向血管内皮生长因子基因微小RNA真核表达载体,评估其转染人肝癌细胞株HepG2后血管内皮生长因子基因的干扰效果。方法:根据血管内皮生长因子序列设计合成4对微小RNA不同干扰片段,克隆到pcDNA6.2-GW/EmGFP-微小RNA真核表达载体上,测序分析鉴定插入序列的完整性;并将其转染至HepG-2细胞株中。采用实时荧光定量聚合酶链式反应分析血管内皮生长因子微小RNA干扰效果,蛋白印迹技术测定重组体对血管内皮生长因子基因蛋白表达情况。结果与结论:构建的4组重组体插入片段的碱基序列完全正确,重组体能干扰肝癌细胞HepG2细胞血管内皮因子基因的表达,4组重组体基因的mRNA的表达水平和蛋白表达水平与阴性对照组相比明显降低(P<0.05),其中血管内皮生长因子微小RNA-3表达水平最低,抑制率87%。结果证实,实验成功构建血管内皮生长因子微小RNA表达载体,在体外能有效抑制HepG2细胞血管内皮生长因子基因表达。     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞

背景：血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义。目的：克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性。方法：采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和DNA测序的方法对提取和重组DNA进行鉴定。pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定。结果与结论：构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段。提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性。     

小干扰RNA靶向血管内皮生长因子基因抑制胆囊癌细胞的增殖体内外实验

背景:已有研究发现RNA干扰可通过抑制血管内皮生长因子基因表达抑制肿瘤细胞增殖,但目前关于应用RNA干扰胆囊癌血管内皮生长表达的研究国内外尚无相关报道.目的:构建并筛选靶向血管内皮生长因子的shRNA,观察RNA干扰血管内皮生长因子的效果及对胆囊癌细胞增殖的影响.方法:设计VEGF-shRNA片段,连接到pCYU6/GFPINeo-shRNA质粒载体上.shRNA转染胆囊癌细胞.建立裸鼠胆囊癌模型,随机分成空白组、阴性对照组、实验组(干扰pShRNA-VEGF2),每组6只.瘤内注射shRNA.荧光显微镜观察细胞生长状态,半定量反转录-聚合酶链反应法与实时荧光定量聚合酶链反应检测RNA干扰效果,观察胆囊癌裸鼠模型肿瘤体积变化. 结果与结论:RNA干扰血管内皮生长因子后,胆囊癌细胞细胞变圆,皱缩,部分细胞死亡脱落.ShRNA片段血管内皮生长因子2、血管内皮生长因子1均可抑制VEGF mRNA表达,抑制率可达86%,82%.裸鼠肿瘤模型中实验组肿瘤与对照组、阴性组相比明显变小,且生长缓慢(P<0.05),而对照组和阴性组在肿瘤大小及生长趋势上没有明显的差别.实验构建的hVEGF-shRNA质粒表达载体通过抑制血管内皮生长因子的表达,抑制胆囊癌细胞增殖,从而达到间接治疗肿瘤的目的.     

人可溶性血管内皮生长因子受体1基因克隆及真核表达载体的构建

背景;血管内皮生长因子在肿痛新生血管的形成中发挥着关键的作用,可溶性血管内皮生长因子受体1能竞争性地抑制血管内皮生长因子诱导新生血管形成的生物学功能.目的:克降人可溶性血管内皮生长因子受体基因1,尝试构建可溶性血管内皮牛长因子受体1基因的真核表达载体.设计、时间及地点:基因表达载体构建实验,于2006-1012007-11在中山大学附属第一医院外科实验室完成.材料:人脐静脉内皮细胞、pMD-18T载体及pcDNA3载体.方法:提取人脐静脉内皮细胞总RNA,使用反转录一聚合酶链反应的方法扩增获得到可溶性血管内皮生长因子受体1基因cDNA,并将其克隆至pMD-18T载体中,经酶切及测序证实.然后应用聚合酶链反应的方法从pMD-18T可溶性血管内皮生长因子受体1重组载体中克隆可溶性血管内皮生长因子受体1基因,再将其定向亚克降至真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达重组体pcDNA3-可溶性血管内皮生长因子受体1,提取质粒进行双酶切、聚合酶链反应及测序鉴定.主要观察指标:可溶性血管内皮生长因子受体1基因反转录一聚合酶链反应情况及pcDNA3-可溶性血管内皮生长因子受体1真核重组体的构建与鉴定结果.结果:构建的真核表达重组体pcDNA3-可溶性血管内皮牛长因子受体1经过双酶切及聚合酶链反应鉴定,证实其中含有目的可溶性血管内皮生长因子受体1基因;测序结果经比对分析,证实与预期设计的编码区cDNA一致.结论:应用反转录-聚合酶链反应方法成功从人脐静脉内皮细胞中克隆出可溶性血管内皮生长凼子受体1基因,成功构建出了可溶性血管内皮生长因子受体1基因真核表达载体.     

人骨形态发生蛋白2与血管内皮生长因子165双基因真核表达质粒的构建及体外表达

目的:构建人骨形态发生蛋白2与血管内皮生长因子165双基因真核表达质粒。方法:实验于2005-03/2005-10在华中科技大学同济医学院公共实验平台完成。①通过聚合酶链反应对pcDNA3.1-BMP2及pUC-CAGGS-VEGF165的目的基因片段亚克隆并引入新的酶切位点,将其分别定向连入真核双表达载体pIRES,构建同时表达两个目的基因的双顺反子,通过聚合酶链反应、酶切分析及DNA序列测定鉴定重组质粒。②重组质粒经脂质体介导体外转染小鼠骨髓基质细胞,通过反转录-聚合酶链反应检测骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165mRNA的表达。结果:①pIRES-BMP2-VEGF165双基因表达质粒的构建和鉴定:将重组质粒pIRES-BMP2-VEGF165分别作XhoI/MluI和XbaI/NotI双酶切,经10g/L琼脂糖凝胶电泳可见1.2kbp的人骨形成蛋白2条带和592bp的血管内皮生长因子165条带,酶切条带与聚合酶链反应产物电泳带处于相同位置。经聚合酶链反应、酶切分析及DNA序列测定证实,目的基因插入片段方向正确,DNA序列无突变。②骨形成蛋白2、血管内皮生长因子165mRNA的表达:以转染pIRES空质粒为阴性对照,48h后提取转染细胞的RNA分别用P1,P2和P3,P4作为引物进行反转录-聚合酶链反应。结果表明转染pIRES-BMP2-VEGF165的小鼠骨髓基质细胞扩增出1.2kbp及592bp两条带。证实该重组质粒能在体外同时表达骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165mRNA。结论:成功构建了可同时表达骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165的双基因真核表达质粒,为进行联合基因治疗骨缺损的实验研究奠定了基础。     

靶向转酮醇酶样基因1 siRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建针对转酮醇酶样基因1(TKTL1)特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达载体并检测其沉默效应。方法采用人U6 SnRNA启动子,分别把被9 bp序列间隔的19 bp长短的TKTL1靶序列的反向重复序列,置于pEGFP-C1-U6质粒载体中,构建成TKTL1短发夹环RNA,产生重组质粒pEGFP-C1-U6/TKTL1,分别用PstⅠ和SalⅠ酶切鉴定及测序分析,并将重组质粒转染人结肠癌细胞株LoVo,通过RT-PCR检测TKTL1基因表达水平的变化。结果酶切鉴定与DNA测序分析证明,TKTL1基因的siRNA表达载体构建正确,RT-PCR结果表明转染重组质粒的LoVo细胞TKTL1基因的表达水平明显降低。结论成功构建了针对TKTL1基因的siRNA表达载体,转染LoVo细胞后可显著抑制TKTL1基因表达。     

应用RNA干扰技术抑制白血病细胞血管内皮生长因子基因表达及功能的研究

目的探讨用RNA干扰技术下调血管内皮生长因子(VEGF)基因表达对白血病细胞生长的影响。方法设计3段分别针对VEGF第3~5外显子的短发夹状RNA(shRNA)并构建其表达载体,分别转染人白血病细胞株NB4,用实时定量PCR及Western blot方法观察3段shRNA对细胞内VEGF基因表达的影响。抗性筛选稳定抑制VEGF表达的永久细胞克隆,应用MTT法、甲基纤维素半固体培养法及细胞周期动力学检测了解VEGF基因缄默对白血病细胞生长的影响。结果成功构建分别携带3段shRNA及对照随机片段的重组质粒pGenesil-VR1,2,3和pGenesil-con,3种shRNA重组质粒中pGenesil-VR3可明显降低细胞内VEGF mRNA的丰度及VEGF蛋白表达,筛选出的NB4-VR3细胞株增殖能力明显下降,细胞集落形成率为(13.3±3.8)%,与NB4-con的(21.3±6.4)%和NB4组的(24.5±5.2)%相比,差异有统计学意义(P<0.05),细胞周期阻滞于G1期,3组细胞G1期比例分别为(53.2±4.6)%、(42.7±5.9)%和(40.5±5.3)%。结论应用RNA干扰技术能筛选出特异而高效阻断VEGF基因表达及功能的shRNA,VEGF基因表达下调能明显抑制白血病细胞生长。     

抑制人BI-1基因表达shRNA重组慢病毒表达载体的构建

背景: 慢病毒介导的RNAi技术以其专一性、抑制效率高、作用持久等优点已广泛应用于基因功能研究中.该技术病毒包装、转染、以及shRNA序列设计都会对抑制效率产生影响.因此实验以人的Bax抑制子1 (BI-1)为目的基因进行RNA干扰实验来探讨其影响因素.目的:为了利用慢病毒Lentivirus介导的RNAi技术寻找抑制人BI-1基因表达的siRNA.设计、时间及地点:单一样本观察,于2007-09/2008-12在北京大学医学部基础医学院医学遗传学系完成.材料:293T细胞、SH-SY5Y细胞为实验室保存;用Ambion公司(www.ambion.com)提供的网络在线工具设计了4个shRNA.方法:构建带有绿色荧光蛋白(EGFP)标签的、针对人BI-1基因不同区域设计的shRNA重组表达载体,然后与包装蛋白表达载体共转染293T细胞以包装成4种shRNA病毒粒子.通过流式细胞仪检测GFP的表达情况来摸索最佳包装条件.Real-time PCR以β-肌动蛋白mRNA被用作内参,将4种重组病毒和对照组病毒上清液侵染SH-SY5Y,检测内源性BI-1基因的敲低效率,筛选到最佳RNAi有效序列.主要观察指标:被不同包装病毒侵染的细胞内GFP的表达率.结果:pLentiLox3.7、rev、vsvg、rre等4质粒包装系统的最佳包装比例为2∶1:1∶1,包装48 h收获的病毒粒子的感染效率最高,并且在包装后的24 h之后换液会提高包装效率.靶定到人BI-1基因-2-17核苷酸(起始编码区域)的shRNA RNA干扰效率最高.能够抑制40%正常基因表达.结论:实验摸索出Lentivirus介导的RNAi技术病毒包装的重要影响因素.为建立稳定的人BI-1基因表达敲低的神经细胞模型和研究BI-1异常表达参与的神经元凋亡疾病的病理研究打下基础.     

短发夹RNA对肝癌细胞细胞间粘附分子-1基因表达的影响

目的利用小片段干扰RNA（siRNA）在肝癌细胞内诱导RNA干扰（RNAi），抑制细胞间粘附分子-1（ICAM-1）基因表达，在体外进行RNAi对肝癌治疗的实验研究。方法根据ICAM-1基因设计shRNA片断，构建pGenesil-1／ICAM-1表达载体，转入E．coli菌，并用Lipofectamine tm2000转染HepG2细胞，通过MTT方法检测细胞活性状态，应用免疫组织化学的方法检测肝癌细胞中ICAM-1基因蛋白质表达抑制情况。结果本实验已成功构建了针对ICAM-1基因的pGenesil-1／ICAM-1质粒，免疫组织化学结果显示：RNA干扰（RNAi）能特异而有效地抑制HepG2细胞中ICAM-1基因的表达。结论构建的pchlesd-1／ICAM-1重组质粒能有效抑制ICAM-1基因在肝癌细胞株HepG2中的表达和瘤细胞增殖。     

小发夹RNA对白血病K562细胞血管内皮生长因子受体Fit-1基因表达的抑制作用

本研究观察小发夹RNA对白血病细胞血管内皮生长N子受体flt-1基因表达的抑制作用并探讨其对白血病细胞侵袭能力的影响及作用机制。采用脂质体介导的方法将构建的人flt-1基N特异性shRNA真核表达载体转染入K562细胞,用（3418抗性筛选获得阳性克隆;抽提基因组DNA,用PCR方法验证shRNA基因对K562细胞的转染;以RT—PCR和免疫印迹反应检测flt-1mRNA和蛋白表达量的变化;用Boyden小室体外侵袭实验检测白血病细胞的侵袭能力;RT～PCR方法检测白血病细胞MMP-2和MMP-9的表达。结果表明,flt-1基因特异性shRNA真核表达载体转染入白血病细胞株K562,G418筛选2周获得阳性克隆;PCR检测证实shRNA基因整合入白血病细胞基因DNA;携有shRNA的flt-1基因能明显下调白血病细胞内flt-1基因mRNA表达水平;设计的2种不同flt-1shRNA序列能不同程度干扰flt—1基因和蛋白在细胞中的表达,两纽阳性细胞中flt-1基因表达抑制率分别为46．1％和65．4％;flt—1 shRNA转染白血病细胞系K562细胞后,MMP-2和MMP-9mRNA表达水平均较转染前明显下降;阳性细胞穿透人工重组基底膜的能力（4．3±1．2）％较对照组（12．7±1．9）％及（9．6±1．7）％明显降低（P〈0．01）。结论：VEGF受体flt-1特异性shRNA的真核表达载体能够高效转染入白血病细胞株K562,有效抑制flt-1基因的表达,并使白血病细胞体外侵袭能力减弱,MMP-2和MMP-9mRNA表达水平下降。这提示VEGF可能通过与其受体结合调控MMP-2和MMP-9的方式,参与白血病细胞的转移。     

靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体质粒,为利用RNA干扰技术探索EZH2基因的作用的研究做准备。方法根据EZH2 mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并连接入pGenesil-2载体,并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体中,经测序证明与设计相同。结论成功构建靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体,为进一步研究EZH2基因在肿瘤细胞中的作用机制及后续的体内外RNAi实验研究奠定了基础。     

靶向AATF基因shRNA表达载体的构建及其稳定表达的白血病U937细胞系的建立

本研究旨在构建靶向AATF基因的短发夹RNA（shRNA）真核表达载体,获得干扰质粒稳定转染的人白血病U937细胞系。根据GenBank数据库提供的AATF mRNA序列,以228～249、303～324、443～464位序列作为RNA干扰位点,排除同源可能,合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆至经BamHⅠ、HindⅢ双酶切线性化的pSilencer 3.1人H1启动子干扰载体中,利用测序鉴定所构建的重组载体是否正确,经电穿孔将3个重组载体（pSA-1、pSA-2、pSA-3）转染人白血病U937细胞系,G418（500 mg/L）有限稀释法持续筛选8周后,扩增获得稳定表达的细胞系;RT-PCR、Western blot分别检测稳定转染细胞系的AATF mRNA和AATF蛋白表达。结果表明,AATF干扰序列及读码框完全正确。稳定转染细胞AATF mRNA表达下调,AATF蛋白表达量下降（P〈0.05）。结论：成功地构建AATF shRNA真核表达载体及AATF表达稳定抑制的白血病U937细胞系,为以AATF基因为靶点的人白血病进一步研究奠定了实验基础。     

靶向TNF-α基因shRNA干扰片段的筛选和重组体的构建

本研究利用RNA干扰技术，筛选出可以高效、特异性抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的小发夹状RNA（shRNA）片段，设计并构建重组质粒，进行序列分析，为探索TNF-α相关疾病的基因治疗提供新途径。取原代培养小鼠腹腔巨噬细胞，置于15％ DMEM中，调细胞浓度为2×10^7／L，接种于6孔板，3ml／well；细胞用脂多糖（LPS）激活，ELISA法测不同时间培养上清中TNF—α的浓度；将针对TNF-α基因的5段shRNA干扰片段的表达框经PCR扩增、纯化后，与转染试剂混合转染入巨噬细胞，细胞用LPS激活24小时后用ELISA法测培养上清中TNF-α的浓度，RT—PCR法测细胞TNF-α mRNA的表达；将最有效抑制TNF-α表达的干扰片段插入质粒载体，转化Ecoli DH5α感受态菌株，提取质粒，进行测序分析。结果表明：LPS刺激巨噬细胞24小时后，细胞分泌TNF—α达高峰；转染了干扰序列1的细胞培养上清中TNF—α浓度与对照组相比下降最明显（P〈0．05），达59．46％，TNF—α mRNA的表达被抑制了61．2％；将干扰序列1DNA序列克隆到载体上，经测序鉴定确实为所需序列。结论：成功筛选出靶向TNF-α基因的shRNA干扰片段并构建重组质粒，可进一步利用克隆所得到的shRNA干扰TNF-α mRNA的表达，为TNF—α相关疾病的基因治疗提供新手段。     

PPAR-γ基因RNA干扰质粒的构建与鉴定

目的构建表达细胞转录因子PPARγ的RNA干扰（RNAi）质粒,为研究PPARγ参与的细胞信号通路以及PPAR吖为靶点的基因治疗提供稳定转染的RNA干扰质粒。方法选取PPARγ基因的19nt特异性序列,设计针对PPARγ的shRNA序列,应用基因重组技术克隆到pSilencer1．0-U6表达载体中,用EcoRI、ApaI进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆,在脂质体的介导下将包含PPARγ基因的RNAi重组载体转染前列腺癌细胞Pc．3。转染48h后,收集细胞裂解液,Westem blotting分析对照组与转染组PPARγ蛋白的表达水平。结果双酶切证实shRNA正确插入pSilencer1．0-U6质粒,DNA测序证实插入的序列正确;含PPARγ基因的RNAi载体转染前列腺癌细胞PC-3细胞成功;Western blotting结果显示,与空质粒对照组相比,转染组细胞PPARγ表达下调。结论成功构建含人PPARγ基因的RNAi载体,为研究PPARγ参与的细胞信号通路提供了稳定转染的RNA干扰质粒。同时,阻断PPARγ的信号通路将为基因治疗提供一个较好的靶点,研究结果为以PPARγ为靶点的基因治疗提供了有利工具。