硼替佐米对伊马替尼耐药细胞株K562的凋亡作用及机制

目的 探讨硼替佐米对伊马替尼耐药细胞株K562(K562R)的诱导凋亡作用及机制.方法 采用浓度梯增法建立耐伊马替尼K562细胞系.应用CCK-8法检测不同浓度硼替佐米分别作用K562和K562R细胞24 h、48 h后,对细胞的增殖抑制的效果.使用流式细胞术方法分别检测硼替佐米单独或联合伊马替尼作用于K562R细胞48 h后的细胞凋亡.应用Western blotting检测不同浓度硼替佐米作用K562R细胞48 h后,Mcl-1、Bcl-2、Bcr/Abl蛋白表达的异同.结果 成功将对伊马替尼敏感的K562细胞诱导为K562R,耐药倍数为31.8;硼替佐米对K562及K562R细胞的增殖抑制呈浓度、时间依赖(P均<0.05);随着硼替佐米浓度增加,对K562R细胞的诱导凋亡作用增强,且硼替佐米与伊马替尼联合具有协同作用(P<0.05);硼替佐米可抑制K562R细胞Mcl-1,Bcr/Abl蛋白的表达,Bcl-2无变化.结论 硼替佐米具有对K562R细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用,其机制可能与下调K562R细胞Bcr/Abl和MCL-1的表达以及促进MCL-1发生切割有关.     

慢性粒细胞白血病细胞株伊马替尼耐药与MDR1基因表达相关性探讨

目的 探讨慢性粒细胞白血病细胞株伊马替尼耐药与MDR1基因表达相关性.方法 采用Real-time PCR检测MDR1 mRNA表达,Western-blot检测P-gp蛋白表达,MTS法检测细胞药物敏感性.结果 耐伊马替尼细胞株K562/G01MDR1的mRNA表达明显上调,P-gp表达明显上调,维拉帕米能部分逆转K562/G01细胞株对伊马替尼的耐药.结论 MDR1基因参与伊马替尼耐药机制,P-gp抑制剂能改善伊马替尼临床疗效.     

伊马替尼、柔红霉素和硼替佐咪对两种Ph(+)白血病细胞株抗肿瘤效应的比较研究

目的 比较研究化疗药物伊马替尼、柔红霉素和硼替佐咪对两种Ph(+)白血病细胞株K562(髓系白血病细胞株,表达P210蛋白)和SUP-B15(急性淋巴细胞白血病细胞株,表达P190蛋白)的抗肿瘤效应.方法 采用MTT法测定不同浓度的伊马替尼、柔红霉素与硼替佐咪分别作用72 h后两种细胞株的增殖活性,并计算3种化疗药物对两种细胞株作用的半数抑制浓度(IC50);RT-PCR法检测不同浓度伊马替尼作用48 h后两种细胞株bcr-abl基因表达的改变.结果 ①不同浓度伊马替尼、柔红霉素与硼替佐咪分别作用K562和SUP-B15细胞株72h,其对细胞株的IC50值分别为(0.286±0.060)μmol/L、(0.303±0.009)μmol/L、(22.127±3.592)nmol/L和(1.387±0.180)μmol/L、(0.117±0.017)μmol/L、(12.35±0.740)nmol/L,提示伊马替尼对K562细胞敏感性明显高于SUP-B15细胞,而柔红霉素对SUP-B15更敏感,硼替佐咪对两种细胞的敏感性无差异;②伊马替尼0、0.35、1.0μmol/L作用48 h后,两株细胞bcr-abl基因表达均无明显变化.结论 伊马替尼、柔红霉素、硼替佐咪对Ph(+)细胞株K562和SUP-B15均有较好的抗肿瘤效应,伊马替尼对K562更敏感,而柔红霉素和硼替佐咪对SUP-B15均有较好的抑制作用,短时间伊马替尼作用后不影响bcr-abl基因的表达.     

塞来昔布对K562白血病细胞的细胞毒作用及与伊马替尼的协同效应

目的 研究塞来昔布（Celecoxib）对K562细胞增殖、早期凋亡的影响及Rb蛋白质（PRb）、P27^Kip蛋白质表达变化,观察Celecoxib和伊马替尼联用对K562细胞增殖抑制和凋亡诱导是否具有协同效应.方法将K562细胞用不同浓度的Celecoxib（0、10、20、40、80及160μmol/L）作用36 h,四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）测定细胞活力;磷脂结合蛋白Ⅴ分析检测K562细胞早期凋亡;Western印迹检测不同浓度Celecoxib对K562细胞PRb和P27^Kip蛋白质表达的影响;用40 μmol/L Celecoxib、0.2μmol/L伊马替尼分别或联合作用K562细胞,观察药物对细胞活力和凋亡诱导是否具有协同作用.结果Celecoxib能明显抑制细胞活力,并呈药物剂量依赖性：随着Celecoxib浓度增高,K562细胞凋亡百分率相应增高,在160μmol/L浓度,凋亡率达25.92%,蛋白质印迹结果显示,Celecoxib可使K562细胞PRb蛋白质表达呈浓度依赖性下调;P27^Kip蛋白质呈浓度依赖性上调.Celecoxib与伊马替尼联用,抑制K562细胞活力为对照组的27.68%.结论Celecoxib能以浓度依赖性方式抑制K562细胞增殖,诱导细胞凋亡;其抗增殖效应可能与PRb表达下调及P27^Kip表达上调有关.Celecoxib与伊马替尼联用,在抗白血病细胞增殖作用上具有显著的协同效应.     

STAT5-ROS信号通路介导K562细胞伊马替尼耐药的机制研究

目的 探讨信号转导与转录因子5-氧化物(STAT5-ROS)细胞信号转导通路在慢性髓细胞白血病细胞(K562)伊马替尼(IM)耐药中的作用机制.方法 以浓度递增的方法诱导K562对IM产生耐药, CCK-8法检测其耐药性.RT-PCR方法定量测定K562/G细胞中STAT5A和STAT5B mRNA表达.流式细胞术测定ROS和细胞凋亡水平.Western blot法检测细胞中总STAT5和p-STAT5蛋白表达.结果 实验成功诱导K562/G耐药细胞,CCK-8法测定耐药倍数为80倍.细胞生长曲线显示20 μmol/L IM作用于K562/G细胞48 h,活细胞数量减半.0.1 μmol/L IM作用于K562细胞24 h,活细胞数量几乎为零.流式细胞检测K562/G细胞内ROS水平明显高于K562细胞(P=0.000 1),相同浓度IM作用于两株细胞相同时间,K562/G细胞凋亡比例低于K562(P<0.05).RT-PCR结果显示K562/G细胞中STAT5A和STAT5B水平均高于K562(P=0.000 1、0.017 0).Western blot结果表明K562/G细胞中STAT5蛋白水平显著升高(P=0.009 0).结论 STAT5在慢性髓细胞白血病中高表达,STAT5-ROS通路的活化与K562细胞IM耐药密切相关.     

棘霉素对耐伊马替尼K562细胞SPK及P-gp表达的影响

目的研究棘霉素对耐伊马替尼K562细胞SPK及P-gp表达的影响。方法 MTT法检测细胞存活率,同位素掺入检测SPK的活性,流式细胞术检测细胞的P-gp表达。结果棘霉素对K562和耐伊马替尼细胞的IC50分别为0.82μg/L和0.87μg/L;棘霉素对耐药细胞中的SPK和P-gp活性有抑制作用;通过抑制SPK的活性可以下调P-gp的表达。结论棘霉素对敏感及耐药K562细胞均有较强的抑制作用,抑制K562/Ima存活的机制可能与影响细胞中SPK的表达,并通过下调SPK进一步影响P-gp的表达,从而增加药物在细胞内的累积浓度有关。     

Glut5在Ph+急性淋巴细胞白血病伊马替尼耐药中的机制研究

目的采用费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病（Ph+ALL）伊马替尼耐药细胞株SUP-B15/R研究伊马替尼耐药的可能机制。方法通过基因芯片分析法对比找出伊马替尼耐药株SUP-B15/R与敏感株SUP-B15/S之间表达差异的基因,筛选出可能与耐药相关的基因SLC2A5,分别采用实时荧光定量PCR（qPCR）和Western blot进一步验证SLC2A5及其编码蛋白葡萄糖转运体5（Glut5）在SUP-B15/R与SUP-B15/S之间表达的差异。采用MTT实验检测果糖对SUP-B15/S细胞伊马替尼敏感性的影响,以及qPCR检测相关信号通路的改变,探究Glut5表达增加在SUP-B15细胞伊马替尼耐药中的作用。结果基因芯片结果发现,与细胞代谢相关的SLC2A5基因在SUP-B15/R中高表达,qPCR和Western blot实验进一步验证了上述结果。而果糖处理后SUP-B15/S细胞对伊马替尼的敏感性下降,IC50由（44.50±2.38 ）μmol/L增加到（64.71±1.69） μmol/L,同时Glut5、PI3K、AK mRNA表达增强。结论SUP-B15/R细胞高表达SLC2A5,Glut5高表达促进细胞对果糖的吸收,激活伊马替尼作用下受到抑制的PI3K/AKT信号通路,导致SUP-B15细胞对伊马替尼耐药。     

STAT3蛋白表达水平的高低对慢性粒细胞白血病伊马替尼治疗敏感性的影响

目的 升高或者降低信号转导因子与转录激活因子3(STAT3)的表达,分析其变化对于细胞的增殖分化以及敏感性有何意义.方法 构建重组质粒真核表达载体siRNA-STAT3,将重组表达质粒用脂质体Lipofactamine 3000转染人慢性粒细胞白血病K562细胞,通过嘌呤霉素持续单克隆筛选,Western blot法鉴定,进而筛选出稳定低表达组(低表达对照组、低表达1组、低表达2组)和高表达组(高表达对照组、高表达组)STAT3细胞株.将正处于增殖周期的细胞经不同浓度的伊马替尼作用后,MTT法检测细胞生长抑制率,绘制细胞增殖曲线.同时检测转染后细胞株BCR/ABL融合基因相关蛋白的表达变化.结果 与低表达对照组相比,低表达STAT3(低表达1组、低表达2组)的K562细胞组使用伊马替尼治疗有着较高的抑制率,在不同浓度作用下,其抑制率差异有统计学意义(P＜0.05).过表达STAT3后,与高表达对照组相比,在相同浓度梯度伊马替尼作用下,其抑制率差异有统计学意义(P＜0.05).低表达对照组与高表达对照组中伊马替尼抑制率差异无统计学意义.伊马替尼治疗靶向基因BCR/ABL相关蛋白中的P53、HAUSP和PTEN蛋白表达趋势和STAT3基本一致.结论 低表达STAT3蛋白可加强K562细胞对伊马替尼的敏感性,抑制STAT3蛋白有望提高伊马替尼对慢性粒细胞白血病的疗效.     

蛋白酶体抑制剂联合伊马替尼对K562细胞livin基因表达的影响

目的 研究蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomib,BOR)单独或联合伊马替尼(imatinib,IM)对慢性髓性白血病(chro-nic myelogenous leukemia,CML)急变期细胞株K562中livin mRNA表达的影响.方法 不同浓度BOR(2.5,5,10 nmol/L)和IM(0.25 μmol/L)单药或分别联合处理K562细胞,分别于药物作用12,48,72 h后采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法 检测livin mRNA的表达.结果 BOR或IM单药组K562细胞中livin mRNA的表达下调,而且随着药物浓度的增加表达降低,且在药物作用48 h时达最高.联合作用后,livin mRNA的下降水平显著增加.结论 BOR单药或联合IM可以下调K562细胞中livin mRNA的表达,并可能通过此机制来诱导其凋亡,两药联合具有协同作用.     

伊马替尼敏感及耐药K562细胞P-糖蛋白、缺氧诱导因子和鞘氨醇激酶表达的比较

目的:比较伊马替尼敏感及耐药K562(K562/Ima)细胞P-糖蛋白、缺氧诱导因子1α和鞘氨醇激酶表达的差异。方法:取对数生长期的K562和K562/Ima细胞,采用不同质量浓度的伊马替尼分别处理48h,应用MTT法计算耐药倍数;另取上述2种细胞,分别采用Western blot、RT-PCR及同位素掺入等方法检测2种细胞中P-糖蛋白、缺氧诱导因子1α和鞘氨醇激酶的表达。结果:相对于K562细胞,K562/Ima细胞的耐药倍数为24。在K562/Ima细胞中,P-糖蛋白、缺氧诱导因子1α和鞘氨醇激酶的表达均高于K562细胞。结论:K562/Ima的耐药机制与P-糖蛋白、缺氧诱导因子、鞘氨醇激酶等基因的表达上调有关。     

三氧化二砷对耐药白血病细胞血管内皮生长因子和P-糖蛋白表达的影响

目的:研究三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)对K562/A02细胞表达血管内皮生长因子(vascular endo- thelial growth factor,VEGF)和P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gP)的影响,并对VEGF和P-gp的相关性进行探讨。方法:用甲基噻唑基四唑(MTT)法检测ATO对K562/A02细胞的增殖抑制率,酶联免疫吸附双抗体夹心法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定上清VEGF含量,流式细胞术测定P-gP表达率。结果:0.05μmol/L ATO对K562/A02细胞的增殖和VEGF的表达无明显影响;0.4、3.2μmol/L ATO则对K562/A02细胞有明显的增殖抑制作用和下调VEGF的作用(P<0.05)。P-gP经0.05、0.4μmol/L ATO处理24、48、72h后无明显变化(P>0.05),3.2μmol/L ATO处理48、72 h后可显著下调P-gP表达(P<0.05)。结论:ATO逆转K562/A02细胞多药耐药(multidrug resistance,MDR)的作用可能与其调控P-gP和VEGF的水平有关;K562/A02细胞VEGF水平与P-gP的表达率可能有一定的相关性。     

Arsenic trioxide inhibits p-glycoprotein expression in multidrug-resistant human leukemia cells that overexpress the MDR1 gene

Objective To investigate the effects of arsenic trioxide (As2O3) on the apoptosis and p-glycoprotein (P-gp) expression of multidrug-resistant human leukemia cells.Methods Human multidrug-resistant leukemia cell line K562/ADM overexpressing the MDR1 gene, was used as the target cells. The cell proliferating activity was assessed using the MTT colorimetric assay. Cytomorphology was investigated under light, confocal and electron microscopes. DNA fragmentation was examined using agarose gel electrophoresis, while p-gp expression, cell cycle status and sub-G1 cells were determined using flow cytometry.Results Zero point five to 20 μmol/L As2O3 inhibited the proliferation of K562/ADM cells, and K562/ADM cells were more sensitive to As2O3 than the parental K562 cells. As2O3-induced apoptosis of K562/ADM cells was determined by the observance of typical morphological changes and the appearance of DNA ladder and sub-G1 cell populations. As2O3 significantly inhibited the P-gp expression of K562/ADM cells, and synergistically enhanced the sensitivity of the drug-resistant cells to adriamycin.Conclusions As2O3 induces growth-inhibition and apoptosis, down-regulates P-gp expression and exerts a synergistic effect in combination with adriamycin in multidrug-resistant leukemia cells.     

汉防己甲素逆转白血病细胞株K562/A02耐药的机制

目的:研究汉防己甲素（TTD）对白血病细胞株K562/A02多药耐药(MDR)逆转的机理。方法：以白血病细胞系K562及其耐药细胞系K562/A02为TTD作用的靶细胞。细胞水平检测实验分5组（K562组、K562/A02组、K562+ADM组、K562/A02+ADM组和K562/A02+TTD+ADM组）,采用MTT法检测TTD对K562和K562/A02细胞的非细胞毒性剂量,流式细胞术检测细胞内阿霉素(ADM)的浓度,基因、酶学、蛋白水平检测实验分3组（K562组、K562/A02组和K562/A02+TTD组）,采用RT-PCR法检测mdr1 mRNA的表达,免疫细胞化学方法检测谷胱甘肽S转移酶π（GST-π）和拓扑异构酶Ⅱ（Topo Ⅱ）的表达水平,Western-blotting法检测P-糖蛋白（P-gp）和bcl-2表达。结果：1.562 5 mg•L^-1的TTD处理K562/A02细胞后,细胞内ADM的浓度较单用ADM组明显提高（P<0.01）;与空白对照组比较,K562/A02细胞内mdr1 mRNA/P-gp的表达量减少（P<0.01）;GST-π和TopoⅡ表达无明显变化;凋亡抑制基因bcl-2的表达量减少（P<0.01）。结论:TTD主要通过增加细胞内ADM浓度,下调mdr1/P-gp和bcl-2表达逆转耐药。     

微波对白血病耐药细胞株K562/MDR的影响

目的 研究微波对白血病耐药细胞株K562／MDR耐药性的影响。方法 使用流式细胞仪测量K562／MDR细胞内罗丹明（Rh123)含量及多药耐药基因产物P－糖蛋白（P－gp)的表达，使用DPH标记的荧光分光光度计法测量K562／MDR细胞膜流动性。结果 微波处理后，K562／MDR细胞内罗丹明含量增加，P－gp糖蛋白表达下降，细胞膜流动性增加。结论 微波能对白血病耐药细胞株K562／MDR的耐药性起一定的逆转作用。     

甲基莲心碱在K562/A02细胞对STI 571敏感性中的作用

目的:研究甲基莲心碱(Nef)在多药耐药白血病细胞K562/A02对STI 571敏感性中的作用，并探讨其逆转耐药的机制。方法:MTT法比较STI 571单独或与Nef联合应用对K562/A02细胞的抑制作用；RT-PCR法检测mdr1 mRNA转录水平及Western Blot法检测P-gp表达水平。结果:Nef与STI 571联合应用对K562/A02细胞增殖的抑制作用明显增强。单独应用STI 571对K562/A02细胞的IC50为3.02μmol/L，加Nef后,IC50为0.689μmol/L，逆转倍数为4.38倍(P＜0.05）。STI 571与Nef联合应用使mdr1 mRNA转录水平下调(45.4±2.5)%(P＜0.01)，使P-gp的表达下调40.58%(P＜0.05)。结论:甲基莲心碱能增强K562/A02细胞对STI 571的敏感性，下调其mdr1 mRNA的转录和阻断P-gp的表达，从而逆转白血病的多药耐药性。     

脉冲磁场对多药耐药细胞K562/ADR的逆转作用

目的:研究脉冲磁场(PMF)对多药耐药(MDR)肿瘤细胞K562/ADR的逆转作用及机制。方法:MTT法测定敏感株K562/S和耐药株K562/ADR对多柔比星(ADR)的IC50,观察PMF对肿瘤细胞增殖的影响。测定不同频率PMF照射的K562/ADR耐药细胞株对ADR的IC50,分析PMF的逆转效果。用流式细胞术(FCM)检测细胞内ADR的浓度。结果:K562/ADR细胞的耐药倍数为29.36,PMF对耐药株肿瘤细胞增殖无影响。相同磁场强度、不同频率的PMF对耐药株K562/ADR的IC50影响不同,在相同的时间里,70 Hz的PMF影响作用最明显。70 HzPMF处理的K562/ADR细胞中药物浓度高于对照组。结论:PMF可通过提高细胞内的药物浓度,对肿瘤细胞K562/ADR的MDR具有逆转作用;逆转作用的大小与脉冲磁场的频率有关,低频率的PMF比高频率的PMF的逆转效果更明显。