SOX7基因在胰腺癌细胞株的表达及其启动子区甲基化状态的研究

目的:检测SOX7基因在胰腺癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态,初步探讨两者之间的关系?方法:采用RT-PCR检测SOX7基因在胰腺癌细胞株BXPC-3?CFPAC-1?PANC-1和SW1990中的表达水平?重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP)和结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法 (combined bisulfite restriction analysis,COBRA)检测启动子区域甲基化状态?采用去甲基化药物5-氮杂胞苷(5-aza-2-adeoxycytidine,5-aza-dC)处理各细胞株后,检测SOX7基因的mRNA表达和甲基化状态变化?结果:在胰腺癌细胞株BXPC-3?CFPAC-1中SOX7基因的mRNA呈阳性表达,而在PANC-1和SW1990中SOX7基因表达沉默;与BXPC-3?CFPAC-1相比,PANC-1和SW1990中SOX7基因启动子区甲基化率较高?经过去甲基化处理后,PANC-1与SW1990中SOX7启动子区的甲基化率下降,基因重新表达?结论:胰腺癌细胞株PANC-1和SW1990中的SOX7基因表达与启动子区甲基化状态有关,启动子区的高甲基化导致PANC-1? SW1990中SOX7基因的表达沉默?     

5-脱氧杂氮胞苷诱导肝癌细胞株p16基因高表达

目的 研究５－脱氧杂氮胞苷对肝癌细胞株ｐ１６基因表达的影响及其机制。方法 肝癌细胞株ＳＭＭＣ－７２２１、ＨｅＰＧ２用５－脱氧杂氮胞苷处理,处理前后采用ＲＴ－ＰＣＲ和免疫组织化学染色法观察和分析其ｍＲＮＡ和蛋白表达变化。结果 经５－脱氧杂氮胞苷处理的肝癌细胞株ｍＲＮＡ和蛋白表达均明显增强。结论 ５－脱氧杂氮胞苷可使ｐ１６基因在转录水平和翻译水平表达增高,其机制可能是通过去甲基化使ｐ１６基因表达恢复。     

5-Aza-CdR体外诱导人肺癌细胞株p16基因去甲基化

目的观察人肺癌细胞株H719p16基因启动子区甲基化状态,并探讨去甲基化制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)诱导H719细胞株高甲基化失活的pl6基因重新表达的可能性。方法MSP法检测体外培养的人肺癌细胞株p16基因启动子区甲基化状态,并应用不同浓度的5-Aza-CdR处理人肺癌细胞株H719,MSP法检测用药后细胞中p16基因的甲基化状态,并用RT-PCR方法及Western Blot方法检测用药前后细胞中p16基因mRNA和蛋白水平变化。结果p16基因在人肺癌细胞株H719中启动子区呈甲基化状态,经过5-Aza-CdR处理后,p16基因启动子区呈去甲基化状态,并且其mRNA及蛋白恢复表达。结论启动子区异常甲基化是人肺癌细胞株p16基因失活的可能原因,5-Aza-CdR能逆转p16基因甲基化状态。     

脊髓DNA甲基化对吗啡在神经病理性疼痛中作用的影响

目的:探讨吗啡(morphine)在神经病理性疼痛中作用下降的表观遗传学机制。方法:42只SD雄性大鼠鞘内置管后随机分为6组(n=7):假手术组(Ⅰ组),坐骨神经慢性卡压(CCI)+生理盐水(NS)1组(Ⅱ组),CCI+5氮杂胞苷(5-aza)组(Ⅲ组),CCI+NS2组(Ⅳ组),CCI+NS+morphine组(Ⅴ组),CCI+5-aza+morphine组(Ⅵ组)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ组手术后0-14d每日鞘内注射10μlNS,Ⅲ、Ⅵ组0-14d每日鞘内注射10μl5-aza(10μmol)。CCI后21d取Ⅰ-Ⅲ组脊髓腰膨大检测总体甲基化和μ阿片受体(MOR)mRNA水平;Ⅳ-Ⅵ组鞘内注射10μlNS(Ⅳ组)和30μg吗啡(Ⅴ、Ⅵ组),注射后0,15,30,45,60min测定机械和热痛阈。结果:Ⅱ组脊髓甲基化水平高于Ⅰ、Ⅲ组,MOR表达水平低于Ⅰ、Ⅲ组,Ⅰ、Ⅲ组之间无差异;Ⅴ、Ⅵ组鞘内给予吗啡后30min机械痛阈和热痛阈明显升高,均高于Ⅳ组,Ⅵ组最高。结论:DNA甲基化可能降低了CCI大鼠脊髓MOR表达,从而影响了阿片药物的镇痛作用。     

3种胃癌细胞株中GSTP1基因表达及其启动子区甲基化状态的研究

目的研究候选基因GSTP1在胃癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态,初步探讨胃癌细胞株GSTP1基因表达水平与其启动子区甲基化的相关性。方法采用RT-PCR和Western blot技术分别检测GSTP1在人胃癌细胞株MGC803、BGC823和SGC7901中的mRNA和蛋白表达水平。甲基化特异性PCR(MSP)法检测启动子区域甲基化状态。分别用不同浓度的去甲基化药物5-氮杂胞苷处理GSTP1基因启动子区高甲基化状态细胞后,再检测GSTP1基因蛋白表达水平。结果人胃癌细胞株BGC823和SGC7901中GSTP1 mRNA和蛋白呈阳性表达,MGC803中mRNA和蛋白呈阴性表达;BGC823和SGC7901细胞GSTP1基因启动子区域未发生甲基化,而MGC803细胞启动子区呈高甲基化状态;经5-氮杂胞苷药物干预后,MGC803细胞的GSTP1蛋白表达明显增强。结论胃癌MGC803细胞株中GSTP1基因表达沉默与启动子区高甲基化状态有关。     

甲基化抑制剂5-杂氮胞苷对T淋巴细胞株程序性死亡受体-1基因启动子区域甲基化水平及其表达的影响

目的:以T淋巴细胞株Molt-4细胞为模型,探讨甲基化抑制剂5-杂氮胞苷(5-azacytidine,5-Zac)对淋巴细胞表面程序性死亡受体-1(programmed death receptor 1,PD-1)基因启动子的去甲基化作用及其诱导的PD-1基因表达的改变,并进一步研究去甲基化作用与PD-1基因表达之间的...     

5-氮杂胞苷对HL60细胞P16、DAPK及MGMT基因甲基化状态影响

目的:通过检测5-氮杂胞苷作用于急性早幼粒细胞白血病细胞系(HL60)细胞前后P16、死亡相关蛋白激酶(Death associated protein kinase,DAPK)及6-氧-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O-6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)基因甲基化状态的改变及基因表达的变化情况,探讨5-氮杂胞苷对髓系白血病细胞系作用的相关机制.方法:采用常规细胞培养,加入5-氮杂胞苷培养48 h后,以甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR,MSP)检测基因甲基化状态,以RT-PCR检测药物作用前后基因表达水平.     

5-氮杂-2′-脱氧胞苷诱导胃癌细胞系中p16和MGMT基因去甲基化并激活其表达

目的观察5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-dC)对体外培养的胃癌细胞MGC-803中p16和MGMT基因启动子区DNA甲基化状态及表达的影响,探讨胃癌细胞p16和MGMT基因失活的机制及去甲基化制剂对p16和MGMT基因表达的调控。方法5-Aza-dC处理体外培养的胃癌细胞MGC-803后,甲基化特异性PCR(MSP)法检测用药前后细胞中p16和MGMT基因的甲基化状态,RT-PCR法检测用药前后细胞中p16和MGMTmRNA表达的变化。结果胃癌细胞系MGC-803中p16和MGMTmRNA表达缺失,其启动子区域表现为DNA甲基化。5-Aza-dC不但能使MGC-803细胞中p16和MGMT基因发生DNA去甲基化,而且能使表达缺失的p16和MGMTmRNA重新表达。结论启动子区高甲基化是胃癌细胞p16和MGMT基因失活的主要原因之一,去甲基化制剂-5-Aza-dC能逆转p16和MGMT基因甲基化状态,从而调控p16和MGMT基因表达。     

5-杂氮胞苷对成人T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域甲基化水平的影响

目的：研究DNA低甲基化对穿孔素基因mRNA和蛋白表达的影响。方法：密度梯度离心分离正常成人的外周血淋巴细胞，磁珠分离CD4和CD8细胞后进行细胞培养，DNA甲基化抑制剂5-杂氮胞苷（5-azaC）处理。分别提取DNA、RNA和蛋白质。亚硫酸氢钠处理DNA，巢式PCR进行扩增、转化入大肠杆菌，挑取克隆测序。实时定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测穿孔素mRNA的表达，Western印迹检测穿孔素蛋白量的变化。结果：5-azaC处理后的CD4细胞和CD8细胞穿孔素mRNA和蛋白表达显著高于未处理的CD4和CD8细胞组（P〈0．05）。测序结果显示5-azaC处理后的CD4细胞和CD8细胞DNA穿孔素启动子区域的甲基化水平降低，与未处理的CD4和CD8细胞组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：5-azaC处理后CD4和CD8细胞穿孔素mRNA的表达和蛋白的表达都有显著的增高，这种增高与CD4和CD8细胞穿孔素基因启动子区域出现的低甲基化有关。     

炭疽毒素受体2表达受miR-145-5p调控在胰腺癌的作用机制研究

目的：探讨炭疽毒素受体2(anthrax toxin receptor 2,ANTXR2)在胰腺癌组织和细胞中的表达、临床意义和细胞功能,验证miR-145-5p在胰腺癌细胞中调控ANTXR2的作用机制。方法：分析GEO和TCGA数据库中胰腺癌的转录数据和临床数据。通过CCK-8实验、流式细胞术、划痕实验和Transwell实验进行细胞功能验证。采用miRNA靶点预测数据库反向预测可能通过ceRNA机制抑制ANTXR2表达的miRNA,并使用双荧光素酶报告实验进行验证。结果：ANTXR2在胰腺癌组织和细胞中的表达均上调（均P<0.05）,ANTXR2上调预示着原发肿瘤等级（P<0.05）、肿瘤细胞分化等级（P<0.05）和总体生存期（P<0.05,HR=1.72）均较差。ANTXR2可以促进胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭（均P<0.05）。ANTXR2是miR-145-5p下游的靶标（P<0.01）,miR-145-5p可以通过抑制ANTXR2的表达抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。结论：ANTXR2在胰腺癌组织和细胞中过表达,促进胰腺癌细胞增殖、迁移和侵...     

过表达miR-199-3p/5p诱导胰腺癌细胞BxPC-3、Panc-1铁死亡的作用机制

目的探讨过表达miR-199-3p/5p诱导胰腺癌细胞BxPC-3和Panc-1铁死亡的作用机制。 方法瞬时转染miR-199-3p/5p模拟物和抑制物至BxPC-3、Panc-1细胞中。qRT-PCR检测细胞中miR-199-3p/5p表达水平;Western blotting检测SCL7A11、BTRC、TFRC蛋白水平。谷胱甘肽(GSH)、Fe2＋、脂质过氧化物(LPO)试剂盒检测细胞GSH、Fe2＋、LPO水平。免疫共沉淀检测BTRC、TFRC泛素化水平。双荧光素酶报告实验检测miR-199与靶基因的相互作用。 结果转染miR-199-3p/5p模拟物后,胰腺癌BxPC-3、Panc-1细胞株中miR-199-3p/5p、TFRC蛋白水平显著上调;SLC7A11、BTRC蛋白水平显著降低;LPO、Fe2＋含量升高,GSH含量降低。过表达BTRC能够显著降低TFRC蛋白水平。miR-199-3p靶向结合SLC7A11,miR-199-5p靶向结合BTRC。 结论过表达miR-199-3p/5p诱导胰腺癌细胞BxPC-3和PANC-1铁死亡,可能与靶向抑制BTRC、SLC7A11促进LPO累积有关。     

MicroRNA-590-5p、microRNA-103、microRNA-34c-5p、Dicer 及BRMS -1 基因在肺癌中的表达研究

目的 探讨microRNA -590-5p（miR -590-5p ）、miR -103、miR -34c -5p 、Dicer 及BRMS -1 在肺 癌中表达及相互间关系。方法 选取47 例肺癌患者的癌组织及癌旁正常组织,利用Trizol 提取总RNA,实 时荧光定量聚合酶链反应检测基因的相对表达量。结果 肺癌组织与癌旁正常组织miR -103、miR -34c -5p 、 Dicer 及BRMS -1 基因表达水平比较,差异有统计学意义（P <0.05）,miR -34c -5p 与P53 呈正相关（P <0.05）, miR -103 与多药耐药相关蛋白呈正相关（P <0.05）,Dicer 与miR -34c -5p 、miR -103 及miR -590-5p 呈负相 关（P <0.05）。结论 在肺癌组织中Dicer 基因表达与miR -34c -5p 呈负相关,可能通过抑制癌基因的表达, 抑制肺癌的发生。     

miRNA"海绵"重组质粒的构建及对miR-483-5p的敲减

目的 建立microRNA失功能(loss of function)研究模型,为功能研究提供实验材料.方法 针对miR-483-5p成熟体序列设计含6个拷贝反义序列的DNA片段,称为"S-483",将其连接入含CAG启动子的pCAGGs载体中,构建pCAGGs-S-483重组质粒.利用脂质体技术瞬时转染Hep1-6细胞...     

miR-205-5p在卵巢癌患者血清中的表达及其预后价值

目的探讨miR-205-5p在卵巢癌患者血清中的表达水平及其与预后的关系。方法选取卵巢癌患者98例为卵巢癌组,健康体检女性98例为健康组。采用实时定量聚合酶链反应检测血清miR-205-5p表达水平。ROC曲线分析miR-205-5p对卵巢癌的诊断价值,多因素Cox回归分析卵巢癌患者预后的相关影响因素。结果术前卵巢癌组miR-205-5p表达水平高于健康组,卵巢癌组术后miR-205-5p低于术前(P＜0.05)。ROC曲线结果显示,miR-205-5p诊断卵巢癌的曲线下面积为0.810,最佳截断值为6.28,灵敏度为89.79%,特异度为86.73%。与miR-205-5p低表达者比较,高表达者的肿瘤分化程度和淋巴结转移率均增高,生存时间降低(P＜0.05)。多因素Cox回归分析显示,低肿瘤分化、有淋巴结转移和miR-205-5p高表达均为卵巢癌患者预后的危险因素(P＜0.05)。结论血清miR-205-5p高表达与卵巢癌患者的预后密切相关,miR-205-5p高表达可提示其预后不良,有望成为临床诊断及预后评价的生物学标志物。     

lncRNA MNX1-AS1通过调控miR-218-5p影响非小细胞肺癌细胞的增殖、凋亡及迁移

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)MNX1-AS1通过调控miR-218-5p的表达对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法qRT-PCR检测MNX1-AS1和miR-218-5p在肺癌细胞系及肺正常上皮细胞系中的表达;采用双荧光素酶报告基因实验和RNA pull down实验验证MNX1-AS1和miR-218-5p之间的靶向关系;干扰A549细胞中MNX1-AS1和miR-218-5p的表达后,MTT、流式细胞术和Transwell实验检测MNX1-AS1靶向miR-218-5p对癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响。结果与肺正常上皮细胞系相比,肺癌细胞系中MNX1-AS1表达升高,miR-218-5p表达降低(P＜0.05);荧光素酶报告基因实验显示,MNX1-AS1可与miR-218-5p结合导致荧光素酶活性显著降低(P＜0.05);RNA pull down实验证实miR-218-5p能特异性结合MNX1-AS1(P＜0.05);抑制A549细胞中MNX1-AS1的表达后,miR-218-5p水平上调,细胞的增殖、迁移和侵袭能力均显著降低,凋亡率显著升高;与MNX1-AS1抑制剂组相比,共抑制MNX1-AS1和miR-218-5p的细胞增殖、迁移、侵袭能力升高,凋亡率下降(P＜0.05)。结论MNX1-AS1可以通过靶向下调miR-218-5p的表达影响非小细胞癌的增殖、凋亡、迁移和侵袭。     

Inhibitory effects of miR-146b-5p on cell migration and invasion of pancreatic cancer by targeting MMP16

Previous studies have shown that miRNAs participate in a wide range of biological functions and play important roles in various human diseases including cancer.We found miR-146b-5p significantly dysregulated in human pancreatic cancer cells by qRT-PCR.To demonstrate its function and regulation mechanism,we overexpressed miR-146-5p by transfecting the mimics.Our data showed that miR-146b-5p overexpression significantly reduced the abilities of migration and invasion of MIA PaCa-2 pancreatic cancer cells.Furthermore,we found that matrix metalloproteinase 16(MMP16) was a downstream target of miR-146b-5p by dual-luciferase reporter assay.Altogether,our findings suggest that miR-146b-5p may be involved in pancreatic cancer cell migration and invasion by targeting MMP16,and miR-146b-5p may be a potential therapeutic target for the pancreatic cancer.     

MiR-199a-3p在胰腺癌中的表达水平及生物信息学分析

目的:探讨miR-199a-3p在胰腺癌中的表达水平及作为胰腺癌的诊断指标的意义,并进行生物信息学分析。方法:从GEO数据库收集胰腺癌和正常胰腺组织中miR-199a-3p的数据。汇总数据绘制受试者工作特征曲线,进行Meta分析,采用生物信息学方法预测miR-199a-3p的靶基因,并对靶基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。结果:收集到6个GEO数据,4个数据的ROC曲线表现出显著的诊断意义,Meta分析结果显示miR-199a-3p在胰腺癌中表达水平高于正常胰腺组织,差异有统计学意义（P<0.001）。预测到221个miR-199a-3p潜在的靶基因,其功能主要富集在基因表达的调控,细胞代谢的调控,蛋白质域特异性结合等生物学过程（P<0.001）,KEGG分析结果显示主要集中在PI3K-Akt通路、黏着斑、肌动蛋白细胞骨架调控、癌症通路、Hippo通路、鞘脂通路、ErbB通路、MAPK通路等通路（P<0.05）。结论:相比正常胰腺组织,miR-199a-3p在胰腺癌为高表达,可作为胰腺癌的一个潜在诊断指标,并可能在胰腺癌的发生发展中起到重要作用,为胰腺癌的研究和治疗提供了新的方向。     

miR-17-5p在非小细胞肺癌患者中的表达及其与临床病理特征的相关性

目的探讨miR-17-5p在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中的表达差异及其与临床病理特征的相关性。 方法利用数据库分析miR-17-5p在NSCLC肿瘤组织与正常组织中的表达差异。分析60例NSCLC患者和60例健康受试者血清miR-17-5p表达,并结合临床资料分析其表达差异的临床意义;分析miR-17-5p、CEA、CYFRA21-1和CA125与临床病理特征的相关性。 结果数据库和临床分析发现,miR-17-5p在NSCLC组织和血清中的表达均显著高于健康对照组(P＜0.05),并且高表达患者的预后要比低表达患者差。通过AUC曲线测量的miR-17-5p诊断准确性为0.746,大于CEA、CYFRA21-1和CA125。临床分析发现,血清miR-17-5p高表达与患者的淋巴结转移相关。 结论血清miR-17-5p可作为潜在的NSCLC诊断和预后评价的分子标志物。NSCLC患者血清miR-17-5p表达升高,且与患者的预后关系密切。