RHBDF2基因过表达慢病毒载体的构建和稳定表达RHBDF2细胞系的建立

目的：构建RHBDF2基因过表达慢病毒载体,建立稳定表达RHBDF2的EA.hy926细胞,为RHBDF2基因过表达慢病毒载体的构建和稳定表达RHBDF2细胞的建立提供依据。方法：根据NCBI提供的RHBDF2基因序列,设计并合成引物,PCR扩增RHBDF2基因后通过Gateway克隆技术将目的基因克隆至入门载体,再亚克隆至慢病毒载体pLV[Exp]-EGFP,构建重组慢病毒质粒pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2;将慢病毒表达载体质粒pLV[Exp]-EGFP和重组慢病毒质粒pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2分别与慢病毒辅助包装质粒共转染HEK293T细胞,包装慢病毒并测定慢病毒滴度;将感染pLV[Exp]-EGFP-control的EA.hy926细胞作为对照组,感染pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2的EA.hy926细胞作为实验组,利用嘌呤霉素筛选出稳定表达RHBDF2的EA.hy926细胞;荧光定量PCR （qPCR）和Western blotting法检测对照组和实验组EA.hy926细胞中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平。结果：酶切电泳和测序检测,实验组过表达慢病毒载体的基因序列与设计合成的序列完全一致;对照组包装的慢病毒滴度为1×10⁸ TU·mL^-1,实验组慢病毒的滴度为3×10⁸ TU·mL^-1;荧光显微镜下慢病毒成功感染EA.hy926细胞,感染率达95%以上;qPCR检测,实验组EA.hy926细胞中RHBDF2 mRNA表达水平较对照组明显升高（P<0.01）;Western blotting法检测,实验组EA.hy926细胞中RHBDF2蛋白表达水平较对照组明显升高（P<0.05）。结论：成功构建RHBDF2过表达慢病毒载体,利用pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2慢病毒建立了稳定上调RHBDF2表达的EA.hy926细胞系。     

含HIV-1 Vif基因重组慢病毒表达载体的构建及其对KSHV裂解性周期复制影响的初探

目的:利用慢病毒表达载体将HIV-1Vif基因导入原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞BCBL-1中使之持续表达目的蛋白Vif,并检测Vif对其中潜伏KSHV裂解性周期复制的影响。方法:自表达质粒pCI-neo-Vif中扩增出Vif基因,插入到pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen中构建成慢病毒载体pHAGE-Vif,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞。荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达情况;收集培养上清经0.45μm滤器过滤后即获得病毒悬液。梯度稀释法测定病毒滴度,感染293T细胞,48h或72h后进行RT-PCR和Western blot检测Vif基因的转录和表达情况。以MOI为1.0的病毒量感染靶细胞BCBL-1,利用Westernblot技术检测Vif蛋白的表达,同时检测KSHVvIL-6和Rta的蛋白表达水平,初步探讨Vif对KSHV复制的影响。结果:限制性内切酶检测和基因测序证实成功构建了携带Vif基因的慢病毒表达载体,滴度为4×107efu/ml。以MOI为1.0的重组慢病毒感染靶细胞BCBL-172h后,能够检测到外源基因Vif的...     

稳定表达人类疱疹病毒6型U94基因血管内皮细胞株的建立及U94对内皮细胞增殖和血管生成能力的影响

目的:构建人类疱疹病毒6型U94基因慢病毒载体,研究U94基因对血管内皮细胞增殖及血管生成的影响?方法:以质粒pSR2PH－U94为模板,PCR扩增U94－6×His片段,克隆至慢病毒载体pLenti6.3－MCS－IRES2－EGFP,经酶切和测序鉴定后,将重组质粒与慢病毒辅助包装元件质粒共转染293T细胞,获得含U94－6×His基因的重组慢病毒?重组慢病毒感染血管内皮细胞EA.hy926,经Blasticidin筛选,RT－PCR和Western blot鉴定,获得稳定表达细胞株?CCK－8和小管形成实验研究U94基因对血管内皮细胞的增殖及血管生成能力的影响?结果:成功构建含U94基因的慢病毒表达载体pLenti－U94－IRES2－EGFP,重组慢病毒经包装?纯化后测得滴度为2.35 × 107 TU/ml?重组慢病毒感染血管内皮细胞EA.hy926,获得能稳定表达U94基因的细胞株EA.hy926－U94?CCK－8及小管形成实验结果显示EA.hy926－U94细胞与阴性对照细胞EA.hy926－NC?正常EA.hy926细胞相比,细胞增殖活性明显降低,小管形成能力变差?结论:成功建立了慢病毒介导的稳定表达U94基因的血管内皮细胞株,研究表明U94可以抑制内皮细胞的增殖及血管生成?     

KSHV抗凋亡蛋白vFLIP编码基因的克隆表达及抗vFLIP多克隆抗体的制备与鉴定

目的： 制备由卡波济肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi′s sarcoma associated herpesvirus,KSHV）编码的病毒FLICE抑制蛋白（viral FLICE inhibitory protein,vFLIP）的多克隆抗体,通过vFLIP重组蛋白对该抗体特异性进行鉴定,并将此抗体初步应用于天然病毒vFLIP蛋白表达的检测。方法： 对vFLIP蛋白抗原表位进行预测分析,设计并合成3条多肽,将合成肽与载体蛋白钥孔戚血蓝素（KLH）偶联作为抗原,免疫新西兰白兔,制备抗vFLIP的多抗;以pCDH-vFLIP质粒为模板扩增vFLIP片段,插入到真核表达载体pEF-MCS-Flag-IRES/Puro中,构建pEF-vFLIP表达载体,利用脂质体将其转染HEK293T细胞,并在其中表达vFLIP。采用ELISA、蛋白质印迹法鉴定vFLIP多克隆抗体的效价及特异性,将该抗体用于天然病毒vFLIP的检测。结果： 经限制性内切酶鉴定和核酸序列测定证实成功构建了重组质粒pEF-vFLIP,Flag抗体可以特异性识别该质粒在HEK293T和EA.hy926细胞内表达的vFLIP-flag融合蛋白。进一步的ELISA结果显示,制备的兔抗vFLIP多克隆抗体效价为1∶11 000以上。该抗体不但与HEK293T和EA.hy926细胞内表达的重组vFLIP-flag融合蛋白反应,而且能够特异性识别PEL细胞中天然的病毒vFLIP蛋白。结论： 构建了含vFLIP基因的重组真核表达载体;采用人工合成肽作为半抗原制备的抗KSHV vFLIP多抗,可以成功地检测重组vFLIP蛋白和天然病毒蛋白。     

HIV-1假病毒的构建及对人原发性渗出性淋巴瘤细胞系的感染研究

目的:分离、克隆水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)的包膜糖蛋白(VSV-GP)编码基因,包装人类免疫缺陷病毒1型human immunodeficiency virus-1,HIV-1)假病毒,并研究其对人原发性渗出性淋巴瘤细胞系 BCBL-1 细胞的感染状况.方法:根据GenBank登记的VSV-GP基因核苷酸序列设计1对PCR引物,其5'端分别引入HindⅢ和BamH Ⅰ酶切位点.以质粒 pHCMV-G为模板,PCR扩增VSV-GP基因,经双酶切后定向克隆进真核表达载体 PcDNA3.1( )中,构建重组真核表达质粒 pVSV-GP.重组质粒经酶切鉴定、核酸序列测定和分析后与含包装和复制功能缺陷的 HIV-1 基因组重组质粒 pNL4-3.Luc.R-E-共转染人胚肾HEK 293T细胞.收获细胞进行Western blot,检测HIV-1 p24蛋白的表达;收获HIV-1假病毒感染 BCBL-1 细胞,进行虫荧光素酶(Luciferase)报告基因活性检测以及用ELISA的方法检测感染后细胞上清中 HIV-1 p24蛋白的含量.结果:PCR分离、克隆的 VSV-GP 序列全长1 536 bp,序列经过核酸分析证实;Western blot在 HIV-1 p24 蛋白预期位置检测到特异性条带;HIV-1 假病毒感染 BCBL-1 细胞后上清可以检测到HIV-1 p24蛋白,并且测得 Luciferase 活性值较对照组显著增高(P<0.05).结论:成功包装了 HIV-1 假病毒,并且该病毒可以感染 BCBL-1细胞.     

miR-186海绵载体的构建及其在EA.hy926细胞株中的表达

目的：构建微小RNA-186（miR-186）基因的海绵载体,建立稳定敲减miR-186的EA.hy926细胞株。方法：化学合成miR-186海绵体序列,并克隆到慢病毒FV040表达载体上;采用lipofectamine 2000共转染FV040-miR-186-sponge载体和慢病毒辅助包装质粒到HEK293T细胞,包装慢病毒,测定病毒滴度;FV040-control慢病毒作为对照组,FV040-miR-186-sponge作为实验组,分别感染EA.hy926细胞,筛选稳转细胞株;采用荧光定量PCR （qPCR）法检测空白对照组、FV040-control对照组及FV040-miR-186-sponge实验组中EA.hy926细胞miR-186的相对表达水平。结果：测序结果显示克隆的目的基因序列与设计的miR-186海绵体序列完全一致。在感染的EA.hy926细胞中观察到绿色荧光蛋白（GFP）的表达。FV040-control包装的慢病毒滴度为2×10⁸ TU·mL^-1,FV040-miR-186-sponge组慢病毒滴度为6×10⁸ TU·mL^-1;成功建立了稳定表达miR-186-sponge的EA.hy926细胞株,感染效率达95%;qPCR检测,与空白对照组和FV040-control组比较,FV040-miR-186-sponge组EA.hy926细胞中miR-186相对表达水平降低（P<0.01）。结论：成功构建了miR-186基因的海绵载体,建立了稳定下调miR-186表达的EA.hy926-miR-186-sponge细胞株。     

人类免疫缺陷病毒-1 Rev蛋白调控卡波济肉瘤相关疱疹病毒的裂解性周期复制与潜伏感染

目的:研究人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)Rev蛋白的表达水平对原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞BCBL-1中卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)裂解性周期复制与潜伏的影响?方法:自表达质粒pCI-neo-Rev中扩增出Rev基因,插入到pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen中构建成慢病毒载体pLenti-Rev,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞?荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白(IZsGreen)表达;收集培养上清经0.45 μm滤器过滤后即获得病毒悬液?梯度稀释法测定病毒滴度并感染细胞,RT-PCR和Western blot检测Rev在293T细胞中的表达?用慢病毒感染BCBL-1细胞,同时将表达质粒pCI-neo-Rev转染该细胞,采用Western blot分别检测Rev以及KSHV Rta和vIL-6蛋白的表达;Real-time PCR进一步从mRNA水平上定量验证Rev对KSHV复制的影响?结果:限制性内切酶酶切反应和基因测序证实成功构建了携带Rev基因的慢病毒表达载体,病毒滴度为2×107 TU/ml?重组慢病毒感染BCBL-1细胞72 h后,能够检测到Rev蛋白的表达?Western blot结果显示,低水平表达的Rev能够上调KSHV裂解期蛋白Rta?vIL-6的表达,而高水平表达的Rev则能够抑制Rta和vIL-6的表达?Real-time PCR进一步验证了该结果,表明高水平表达的Rev能够显著抑制BCBL-1中Rta的mRNA转录,96 h尤为明显?结论:成功构建了含Rev基因的慢病毒表达载体,获得的病毒能够有效感染BCBL-1细胞,并在其中大量表达Rev蛋白?Rev蛋白的表达水平对KSHV的复制与潜伏可能起到复杂的调控作用?     

Notch1蛋白胞内段重组慢病毒载体的构建及其在原发性渗出性淋巴瘤细胞中的功能验证

目的: 构建含Notch1胞内段（intracellular Notch1,ICN）基因的重组慢病毒载体,并检测其对Notch信号通路以及卡波氏肉瘤病毒（Kaposi′s sarcoma associated herpesvirus,KSHV）潜伏感染的原发性渗出性淋巴瘤（primary effusion lymphoma,PEL）细胞增殖能力的影响。方法: 从真核表达质粒 pIP Flag ICN中扩增出ICN基因片段,并将其插入慢病毒载体pHAGE CMV MCS IzsGreen（pHAGE）质粒中以构建重组质粒pHAGE ICN。在人胚肾上皮细胞293T细胞中共转染重组质粒pHAGE ICN、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G,获得表达ICN的重组慢病毒,采用病毒梯度稀释法测定病毒滴度。以ICN重组慢病毒感染PEL细胞系BCP 1细胞,通过蛋白质印迹法检测ICN以及Notch信号通路下游靶蛋白的表达,采用细胞计数法检测过表达ICN对BCP 1细胞增殖能力的影响。结果： 质粒双酶切鉴定以及核酸测序比对结果证实重组质粒pHAGE ICN构建成功。通过慢病毒三质粒包装系统成功包装携带ICN基因的重组慢病毒,并经梯度稀释法测得病毒滴度约为2×107 TU/mL。以ICN重组慢病毒感染BCP 1细胞,蛋白质印迹证实ICN蛋白获得有效过表达,并且能够促进Notch信号通路下游靶蛋白Hes 1的表达。细胞计数结果显示,过表达ICN能显著增强BCP 1细胞的增殖能力。 结论： 成功构建了含ICN基因的重组慢病毒载体,重组慢病毒介导的ICN过表达能够增强Notch信号通路活性,并增强PEL细胞的增殖能力。     

Math1基因重组慢病毒的构建及其在293T细胞中的表达

目的 构建携带Math1基因的重组慢病毒载体,检测其滴度,检测其在293T细胞中的表达.方法 PCR扩增Math1基因,将其连入慢病毒栽体pLenti-GFP中;在感受态细胞DH5α中培养扩增,并行Math1基因的测序鉴定;将重组的慢病毒四质粒共转染293T细胞,收获并浓缩病毒;感染293T细胞和提取细胞DNA后用实时定量PCR法检测病毒滴度.用逆转录PCR和westem blot法检测Mathl基因在感染病毒的293T细胞中的表达.结果 构建的慢病毒载体pLenti-Math1-GFP经测序分析证实基因序列正确.四质粒共转染293T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光.包装后慢病毒测定滴度约为3X10"Tu/L.逆转录PCR和Western blot法均能检测Math1基因在感染病毒的293T细胞中的表达.结论 成功构建携带Math1基因的重组慢病毒,并能在293T细胞中表达.     

分泌性HIV-1 Nef-EGFP融合蛋白表达载体的构建与鉴定

目的： 构建含有人类免疫缺陷病毒I型（human immunodeficiency virus type I,HIV-1）负性调节因子（negative regulation factor,Nef）和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因的重组融合蛋白分泌性表达载体,并检测该融合蛋白在真核细胞中的表达及其在培养上清中分泌情况,为进一步研究Nef功能奠定基础。方法： 利用PCR扩增出HIV-1 Nef和EGFP基因,插入到分泌性表达载体pSecTag2B中。构建的pSecTag2B-Nef-EGFP融合蛋白表达质粒,转染293T细胞,荧光显微镜下观测细胞中Nef-EGFP融合蛋白的表达。收集细胞及上清液,蛋白质印迹和ELISA法分别检测Nef-EGFP融合蛋白的表达及其分泌。结果： 限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列测定证实,成功构建了含有Nef-EGFP基因的分泌性表达载体,该质粒转染293T细胞后,蛋白质印迹法能够检测到Nef EGFP融合蛋白的表达条带,ELISA法检测上清液中目的蛋白分泌量为1.7 ng/ml。结论： 成功构建含有Nef-EGFP的融合蛋白表达质粒,融合蛋白Nef EGFP在293T细胞中获得表达,并能分泌到胞外。     

iRhom2及其突变基因重组慢病毒的包装和稳定表达细胞系的建立

目的：通过重组慢病毒感染,建立iRhom2及其突变基因的Vero细胞稳定细胞表达系,用于iRhom2的功能研究。方法：将iRhom2 及其突变基因克隆到慢病毒载体Lenti-OE-Flag,构建重组慢病毒载体Lenti-OE-iRhom2和Lenti-OE-iRhom2mut,将重组质粒瞬时转染HEK-293T包装细胞,获得重组慢病毒。将重组病毒感染Vero细胞,利用puromycin进行加压筛选,获得二者的重组表达细胞系。 结果：构建了iRhom2及其突变基因的逆转录病毒载体,并获得了重组逆转录病毒病毒,并利用该病毒获得了二者的稳定表达细胞系Western-blot实验证实,二者能够在Vero细胞内稳定表达。结论：利用重组逆转录病毒感染,成功获得了iRhom2及其突变系的Vero细胞稳定表达株,为进一步研究iRhom2的生物学功能及其机制奠定了良好的基础。     

Construction and identification of recombinant lentivirus-mediated gene transfer system for rat transducer of regulated CREB activity 1

Objective:To construct a recombinant lentivirus vector which carries SD rat transducer of regulated CREB activity-1(TORC1) gene and examine its ability to express the TORC1 gene in vitro.Methods:The coding sequence of SD rat TORC1 gene was amplified using PCR and cloned into pGC-FU vector.293T cells were transfected using Lipofectamine 2000 and packaged for the recombinant lentivirus particles.When the cloned sequence was identified to be right,the recombinant lentivirus particles were amplified in a large quantity.The titer of virus was determined by real-time PCR and the level of TORC1 expression was examined by Western blot. Results:The recombinant lentivirus vector carrying TORC1 was constructed successfully and could express TORC1 at a high level in 293T cells in vitro,and the titer determined by real-time PCR was 2×108 TU/ml.Conclusion:The recombinant lentivirus vector could express TORC1 gene at a high level,and was very helpful in the study of exploring the effect of TORC1 on spinal cord injury.     

人膜连蛋白A2基因重组慢病毒载体的构建及其在肝癌细胞株中的表达

目的:构建重组慢病毒载体pWPT-ANXA2-Flag,并检测其在小鼠肝癌细胞系Hepa 1-6的表达情况。方法:利用DNA重组技术将人膜连蛋白A2(annexin A2,ANXA2)基因克隆入慢病毒表达载体pWPT中,通过酶切、测序验证后,将重组慢病毒载体pWPT-ANXA2-Flag与包装质粒pCMV-dR8.91、pCMV-VSV-G共转染人胚肾上皮细胞株293T,包装重组慢病毒LV-ANXA2-Flag,并感染小鼠肝癌细胞株Hepa 1-6,用RT-PCR检测ANXA2 mRNA转录水平,Western blot法检测ANXA2-Flag蛋白的表达情况,应用流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果:经酶切及测序结果证实,构建了重组慢病毒载体pWPT-ANXA2-Flag;RT-PCR及Western blot结果显示慢病毒感染Hepa 1-6细胞后,ANXA2基因能够在细胞内正确的转录、翻译并稳定表达ANXA2蛋白;经过LV-ANXA2-Flag感染后,Hepa 1-6细胞S期细胞比例明显高于对照细胞。结论:成功建立ANXA2基因慢病毒表达载体pWPT-ANXA2-Flag,包装的慢病毒能够成功感染小鼠肝癌...     

重组Bmi1基因的慢病毒的制备和鉴定

目的制备携带B细胞特异单克隆鼠白血病毒整合位点1基因（Bmi1基因）的慢病毒pSin-Bmi1,并在人胚胎干细胞H1中过表达Bmi1基因和BMI1蛋白。方法根据GeneBank提供的Bmi1基因序列,以H1来源的cDNA为模板扩增其cDNA序列,回收片段,Bmi1基因和pSin载体分别进行双酶切,连接后的质粒转化。经菌落PCR、双酶切鉴定及测序鉴定pSin-Bmi1阳性克隆。将阳性表达的pSin-Bmi1和包装质粒转染到293T细胞中制备病毒液。将包装好的病毒感染人胚胎干细胞H1细胞系并用嘌呤霉素筛选稳定表达BMI1的细胞株。通过Western blot验证H1细胞中外源性BMI1蛋白表达。结果经菌落PCR、限制性核酸内切酶酶切和测序证实目的基因Bmi1序列正确。Western blot检测发现感染重组Bmi1的慢病毒的细胞中有外源性BMI1蛋白的高表达,而未感染重组Bmi1的慢病毒的对照组未检测到BMI1表达。结论成功制备了携带Bmi1基因的慢病毒,并得到了稳定高表达外源Bmi1的细胞株。     

miR-137过表达慢病毒的包装和鉴定

目的：构建miR-137过表达慢病毒载体并进一步包装慢病毒,探讨miR-137在HEK293T细胞中的感染效率和表达水平。方法：化学合成miR-137序列并克隆到慢病毒载体GV209,得到并鉴定含有目的片段的重组质粒,采用Lipofectamine 2000共转miR-137重组质粒与慢病毒辅助包装质粒到HEK293T细胞中生产慢病毒。以感染复数（MOI）值为40感染HEK293T细胞48h后,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达,采用荧光定量PCR法检测HEK293T细胞中miR-137的表达水平。结果：测序结果,目的基因序列与GenBank公布的miR-137基因序列完全一致。在感染的HEK293T细胞中观察到GFP的表达。过表达慢病毒感染细胞中miR-137表达水平是对照细胞的12.74倍。结论：成功包装miR-137过表达慢病毒,并可高效感染HEK293T细胞。     

慢病毒介导的调节因子XI过表达及其对胶质瘤细胞增殖的抑制作用

目的：构建调节因子X1(regulatory factor X1,RFX1)过表达慢病毒载体,并观察其对F98细胞增殖的影响。方法：运用PCR技术扩增RFX1,并将其插入慢病毒空载体质粒pITA,构建pITA-RFX1慢病毒质粒,经琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定正确。将包装慢病毒共转染293T细胞,然后感染F98细胞。利用Western印迹和激光共聚焦验证RFX1过表达情况,用流式细胞仪和CCK-8试剂盒观察转染前后细胞增殖情况。 结果：电泳和测序显示慢病毒载体pITA-RFX1构建成功,将其感染F98细胞后过表达RFX1蛋白,同时可以明显抑制细胞的增殖。结论：过表达慢病毒载体构建成功,上调RFX1可以降低恶性胶质瘤细胞的增殖。     

SMO特异性siRNA慢病毒载体的筛选构建

目的构建特异性沉默SMO基因的重组慢病毒载体,筛选对T293细胞SMO基因表达抑制效率最高的siRNA。方法根据SMO基因信息,设计了4个小干扰序列和1个阴性对照序列,利用慢病毒质粒载体pGCSIL-GFP构建了5个重组质粒。用脂质体将重组慢病毒载体转染293T细胞后,Western blot检测沉默效率,从中筛选沉默效率高的质粒载体进行慢病毒颗粒大量包装。结果测序结果证明4个重组慢病毒质粒载体pGCSIL-GFP-721、pGCSIL-GFP-722、pGCSIL-GFP-723、pGCSIL-GFP-724的插入序列完全正确,重组慢病毒载体转染293T细胞后,Western blotting证实重组慢病毒质粒载体pGCSIL-GFP-723的干扰效率最高。包装获得Lv-SIL-SMO723慢病毒颗粒。结论成功筛选获得特异性抑制SMO的siRNA,成功构建了特异性沉默SMO基因慢病毒载体,其产生的慢病毒颗粒能高效特异地沉默SMO基因,为进一步应用奠定基础。     

VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建

目的：构建过表达VEGF和Smad7双基因的慢病毒载体,为勃起功能障碍基因治疗的研究提供有效工具。方法：根据GenBank中基因信息,设计合成VEGF和Smad7引物,采用overlap PCR方法扩增目的基因片段,运用基因重组技术将其克隆至慢病毒表达载体Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin,经酶切、测序对重组质粒进行验证。将重组质粒和Helper1.0、pHelper2.0辅助质粒共转染293T细胞,包装双基因过表达慢病毒并测试其滴度。结果：经酶切和测序鉴定表明VEGF和Smad7双基因重组慢病毒载体构建成功,荧光法测定重组慢病毒滴度高（2E+8TU/mL)。VEGF和Smad7重组慢病毒能高效转染293T细胞,Western blot检测显示VEGF和Smad7蛋白在靶细胞中过表达。结论：成功构建了携带VEGF和Smad7基因并能正确表达的高滴度的重组慢病毒载体。