TRAIL受体在胆管癌组织中的表达及意义

目的 :探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL)的受体在人胆管癌组织、癌旁胆管组织和胆管癌细胞株 (QBC939)的表达及其临床意义。 方法 :应用原位杂交组织化学法检测TRAIL受体mRNA在人胆管癌组织、癌旁胆管组织和胆管癌细胞株 (QBC939)中的表达。 结果 :DR4mRNA、DR5mRNA在人胆管癌组织、癌旁胆管组织和胆管癌细胞株 (QBC939)均呈阳性表达。只有 3例DcR1(3/5 2 )和 7例DcR2 (7/5 2 )在人胆管癌组织呈弱阳性表达。DcR1、DcR2 mRNA在癌旁胆管组织呈阳性表达 ,而在胆管癌细胞株 (QBC939)均不表达。 结论 :TRAIL死亡受体和诱捕受体在人胆管癌、癌旁胆管组织和胆管癌细胞株 (QBC939)的表达不同 ,这些受体表达的变化可能在调控人胆管癌凋亡中发挥重要作用。     

原癌基因c-erbB-2在胆管癌细胞中的表达

目的：研究c-erbB-2基因在胆管癌细胞中的表达。方法：应用免疫细胞化学SABC法检测两株人胆管癌细胞（QBC一939和SK-ChA-1）、21例原代培养人胆管癌细胞和6例原代培养人正常胆管细胞中c-erbB-2蛋白的表达情况。结果：免疫细胞化学检测结果，c-erbB-2在QBC一939细胞和SK-ChA-1细胞中表达均为阳性；21例原代培养人胆管癌细胞中有18例（86％）表达阳性，3例表达阴性，6例原代培养人正常胆管细胞中e-erbB-2蛋白的表达均为阴性。结论：c-erbB-2蛋白在胆管癌组织中为诱导性表达，其表达上调与胆管癌的形成关系密切。     

长链非编码RNA癌症易感性候选物2与印记基因H19在肝外胆管癌中差异表达的分析

目的 探讨肝外胆管癌(ECC)中长链非编码RNA(lncRNA)癌症易感性候选物2(CASC2)和印记基因H19表达及其潜在的功能作用。方法 收集ECC患者样本4例,基于高通量测序技术进行转录组测序,分析lncRNA CASC2和H19的表达模式,并基于生物信息学方法预测潜在功能。另取22例ECC组织样本和不同分化程度的胆管癌细胞株(RBE、QBC939、HuH-28、HuCCT1)进行验证,分别以癌旁组织和正常胆管上皮细胞(HIBEC)作为对照,应用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法分别检测癌组织、癌旁组织与细胞系中lncRNA CASC2和H19的表达水平。汇总患者临床指标并结合目标基因的差异表达进行相关性分析。结果 4对ECC癌组织与癌旁组织中lncRNA CASC2和H19的表达差异有统计学意义(P均<0.05)。qRT-PCR结果显示,lncRNA CASC2在ECC癌组织中表达水平明显高于癌旁组织(t=1.262,P=0.025),而lncRNA H19在ECC癌组织中表达水平明显低于癌旁组织(t=1.285,P=0.005);细胞系QBC939(t=8.1...     

腺病毒介导的p16对胆管癌细胞的生长抑制作用

目的 研究p16基因对胆管癌细胞的作用。方法 将重组体腺病毒p16转移到人胆管癌细胞QBC939,对p16基因的表达、细胞的生长抑制及机制进行分析。结果 用Ad-LacZ进行重组体腺病毒转导效率的检测,发现当MOI为100以上时,重组体朱病毒可使90%以上的培养的人胆管癌QBC939细胞被转导,用RT-PCR方法检测,在胆管癌QTBC939细胞系中p16呈低表达,重组体腺病毒能介导外源基因p16在胆管癌QBC939细胞系中高效表达,重组体朱病毒介导的p16在QBC939细胞中表达,能抑制QBC939细胞的生长和集落形成。流式细胞计数和细胞DNALadder,证实p16能诱导QBC939细胞发生凋亡并导致其发生G1期阻滞。结论 p16基因通过诱导肿瘤细胞凋亡及G1期阻滞在肿瘤的基因治疗方面发挥作用。     

烯脂酰辅酶A水合酶短链1对胆管癌细胞Warburg效应的影响

【摘要】 目的 研究烯脂酰辅酶A水合酶短链1（Enoyl coenzyme A hydratase short chain 1，ECHS1）对胆管癌细胞Warburg效应的影响以及对人胆管癌裸鼠移植瘤生长的影响。方法 本研究分为实验组及对照组，实验组：干扰ECHS1基因；对照组：ECHS1未干扰；采用酶标仪测定ECHS1对胆管癌QBC939糖酵解代谢的影响；采用免疫组化法检测糖酵解代谢关键酶PKM2表达水平变化，分析ECHS1对胆管癌Warburg效应的影响；同时将构建的含siECHS1 siRNA的质粒转染人胆管癌细胞QBC939，建立裸鼠皮下移植瘤模型。观察siRNA干扰ECHS1表达对胆管癌细胞QBC939裸鼠移植瘤生长的影响。结果 酶标仪测定显示，实验组胆管癌细胞QBC939对葡萄糖的吸收较对照组明显减少，实验组胆管癌细胞QBC939乳酸生成降低，差异均有统计学意义（P＜005）；免疫组化法检测结果表明，较对照组而言，干扰ECHS1可降低实验组胆管癌QBC939细胞中PKM2的表达，差异有统计学意义（P＜005）。抑制ECHS1表达可减小实验组裸鼠皮下肿瘤大小(P＜005)。结论 ECHS1通过调控PKM2蛋白表达影响胆管癌QBC939细胞Warburg效应，同时抑制胆管癌的增殖。     

过表达miR-29b可抑制胆管癌细胞的增殖和诱导细胞凋亡

目的研究miR-29b在胆管癌中的表达情况,及其对胆管癌细胞QBC939增殖和凋亡的影响。方法Real-time PCR检测 miR-29b在胆管癌细胞QBC939与良性胆管细胞株H-69中的表达;及胆管癌组织与正常胆管组织中的表达。将对数生长期的 QBC939细胞分为3组,空白对照组,阴性对照组,miR-29b过表达组。MTT和细胞克隆形成实验分别检测过表达miR-29b对细 胞增殖和克隆形成率的影响;流式细胞术检测过表达miR-29b对细胞周期和凋亡的影响。结果miR-29b在胆管癌细胞及胆管 癌组织中表达较正常胆管细胞和组织中均显著降低（P<0.01）。miR-29b过表达组QBC939细胞的miR-29b较阴性对照组表达 明显升高（P<0.01）。在QBC939细胞中,过表达miR-29b可以显著抑制细胞的增殖和克隆形成（P<0.01和P<0.05）;过表达miR- 29b可阻滞细胞在S期（P<0.05）,并且导致细胞凋亡明显增加（P<0.01）。结论miR-29b作为一种抑癌microRNA,在胆管癌中 低表达,过表达miR-29b可以抑制胆管癌细胞增殖,促进细胞凋亡。     

PKM2基因对胆管细胞癌迁移､侵袭及增殖的影响

目的:检测M2-型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2,PKM2)在胆管癌(cholangiocarcinoma,CCA)组织中的表达情况,探讨PKM2下调对胆管癌细胞迁移?侵袭及增殖的影响?方法:实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色分别检测胆管癌及对应癌旁组织标本中PKM2的mRNA和蛋白表达水平?利用慢病毒表达载体系统在胆管癌细胞株HuCCT-1?HCCC-9810中下调PKM2,分别用划痕实验?Transwell细胞侵袭实验和CCK-8比色法检测细胞迁移?侵袭及增殖能力?结果:胆管癌组织中PKM2的mRNA和蛋白表达水平明显高于对应癌旁组织?经qRT-PCR和Western blot方法证实稳定转染PKM2 shRNA的胆管癌细胞中PKM2的mRNA和蛋白水平较对照组均明显下降(P < 0.05),与空载对照组(PKM2-NC)和正常对照组(PKM2)相比,实验组细胞(PKM2-shRNA)的迁移?侵袭及增殖能力明显减弱,差异有统计学意义(P < 0.05)?结论:胆管癌组织中PKM2表达明显高于癌旁组织,PKM2 shRNA能有效地降低胆管癌细胞中PKM2基因的表达,PKM2基因沉默可以抑制HuCCT-1?HCCC-9810细胞的迁移?侵袭及增殖?     

Survivin蛋白和mRNA在胆管癌中的表达和意义

目的检测胆管癌和癌旁胆管组织中Survivin蛋白和mRNA的表达,探讨其在胆管癌发生发展中的作用。方法应用免疫组化SP法检测48例胆管癌和其中30例癌旁胆管组织中Survivin蛋白的表达,同时应用RT-PCR技术检测这些组织标本中Survivin mRNA的表达,并与临床病理资料进行相关性分析。结果48例胆管癌组织中,Survivin蛋白阳性表达率为79.2%(38/48),在癌旁胆管组织中Survivin蛋白阳性表达率6.7%(2/30),两者比较差异有显著性意义(P<0.05)。48例胆管癌组织中,有30例Survivin mRNA的表达高于配对正常组织,胆管癌组织中Survivin mR-NA的表达水平(2.18±1.21)明显高于正常对照组织(1.01±1.03)(P<0.05)。临床病理资料的相关性分析显示,胆管癌组织中Survivin蛋白和mRNA的表达分布与临床病理特征无相关性。结论Survivin基因转录和蛋白表达可能参与胆管癌的发生发展过程,检测Survivin表达可能有助于阐明胆管癌的发生机制。     

COX-2途径对胆管癌细胞血管内皮生长因子影响的实验研究

目的：研究COX-2与胆管癌血管生成的关系及胆管癌血管生成的可能机制。方法：应用不同浓度的选择性环氧合酶-2抑制剂尼美舒利分别处理胆管癌细胞株QBC939,于作用的不同时间收集细胞,应用酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunoadsordent assay,ELISA）检测药物处理前后培养细胞上清液中分泌的VEGF浓度;应用RT-PCR检测药物处理前后胆管癌细胞株QBC939中COX-2/VEGF基因的表达变化;采用SP免疫组化染色观察药物处理前后胆管癌细胞株QBC939中COX-2/VEGF蛋白的表达情况。结果：（1）ELISA表明随着尼美舒利浓度增加,胆管癌细胞QBC939上清液中分泌的VEGF浓度下降;（2）免疫组化测定显示随着尼美舒利浓度增加,COX-2和VEGF在QBC939细胞浆中表达下调;（3）RT-PCR测定显示随着尼美舒利浓度增加,COX-2和VEGF在QBC939细胞核中表达下调。结论：（1）COX-2在胆管癌中高度表达可能与胆管癌血管发生有密切联系;（2）选择性COX-2抑制剂尼美舒利对体外培养的胆管癌细胞株QBC939的VEGF有抑制作用,呈剂量依赖性和时间依赖性,并且可能通过COX-2途径发挥其抗肿瘤血管生成作用。     

HCVC蛋白调控肝门部胆管癌细胞中NF-κB活性的研究

目的 探讨丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV C)在肝门部胆管癌细胞中对核转录因子κB(NF-κB)的调控作用。方法 利用稳定表达HCV C蛋白的QBC939细胞株(QBC939HCV C ),通过NF-κB报道基因分析法、凝胶迁移率分析(EMSA)检测HCVC蛋白增强肝门部胆管癌细胞NF-κB的DNA结合活性和反式激活活性。RT-PCR、Western blot检测HCV C蛋白对核转录因子-κB抑制蛋白α(IκBα)mRNA及P50、P65、IκBα蛋白表达及IκBα蛋白磷酸化的影响。结果 ①EMSA结果显示QBC939HCV C 细胞系中NF-κB相对信号密度明显比QBC939细胞高。②将pNF-κB-lun表达质粒转染稳定表达HCVC蛋白胆管癌细胞系中,通过单光子检测仪检测荧光素酶活性,结果显示QBC939HCV C 细胞中活化NF-κB为12．8倍,而QBC939细胞中NF-κB为2．6倍。③RT-PCR显示IκB mRNA在QBC939HCV C 细胞和QBC939细胞中的表达无明显差异;Western blot结果显示稳定表达HCVC蛋白的QBC939HCV C 细胞株的胞核中的P50、P65蛋白高水平表达,而未转染HCVC蛋白的QBC939细胞仅检测出极低水平的P50、P65蛋白。在QBC939HCV C 细胞胞浆中IκBα蛋白低水平表达。QBC939细胞高水平表达,但IκBα蛋白磷酸化水平则相反。结论 HCVC蛋白通过增加IκB降解激活的NF-κB在肝门部胆管癌的发生中起重要作用。     

microRNA143?microRNA145对胆管癌细胞株QBC939生长周期及凋亡的影响

目的:探讨microRNA143、microRNA145与肝外胆管癌的关系以及microRNA143、microRNA145对胆管癌细胞株QBC939细胞周期及凋亡的影响。方法:提取11对肝外胆管癌组织标本和正常胆管组织标本的RNA,实时荧光定量PCR(realtimePCR)检测microRNA143、microRNA145的表达;将microRNA143、microRNA145质粒转染人胆管癌细胞株QBC939,分别以流式细胞仪和噻唑蓝(MTT)的方法检测转染前后细胞周期、凋亡及生长情况。结果:相对正常胆管组织,胆管癌组织microR-NA143、microRNA145表达率分别为0.048、0.035(P<0.05)。较对照质粒组,microRNA143组、microRNA145组G1期细胞百分比明显增多[(66.08%±1.93%、65.57%±1.85%)vs(42.87%±1.37%)]、S期细胞百分比明显减少[(19.16%±1.15%、21.40%±1.65%)vs(38.76%±1.83%)]、细胞凋亡率增加[(18.49%±2.26%、16.89%±2.47%)vs(4.68%±1.65%...     

PTEN and PDCD4 are bona fide targets of microRNA-21 in human cholangiocarcinoma

Objective To investigate the expression profile of microRNA-21 in human cholangiocarcinoma tissues and to validate its bona fide targets in human cholangiocarcinoma cells. Methods The expression profile of microRNA-21 in human cholangiocarcinoma tissues and cholangiocarcinoma cell line, QBC939, was evaluated by using real-time PCR analysis. The bona fide targets of microRNA-21 were analyzed and confirmed by dual luciferase reporter gene assay and western blot, respectively. The expressional correlation of microRNA-21 and its targets was probed in human cholangiocarcinoma tissues by using real-time PCR, locked nucleic acid in situ hybridization (LNA-ISH), and immunohistochemistry analysis. Results Real-time PCR analysis revealed that microRNA-21 expression depicted a significant up-regulation in human cholangiocarcinoma tissues about 5.6-fold as compared to the matched normal bileduct tissues (P<0.05). The dual luciferase reporter gene assay revealed endogenous microRNA-21 in cholangiocarcinoma cell line, QBC939, inhibited the luciferase reporter activities of wild-type PTEN (P<0.01) and PDCD4 (P<0.05) and had no this effect on mutated PTEN and PDCD4. Moreover, loss of microRNA-21 function led to a significant increase of PTEN and PDCD4 protein levels in QBC939 cells. Elevated microRNA-21 levels were accompanied by marked reductions of PTEN and PDCD4 expression in the same cholangiocarcinoma tissue. Conclusion microRNA-21 expression is up-regulated in human cholangiocarcinoma and PTEN, PDCD4 are direct effectors of microRNA-21.     

PPAR-γ在肝门部胆管癌中的表达及其配体激活后对胆管癌细胞的作用

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）在人类肝门部胆管癌细胞系QBC939中的表达及经其配体吡格列酮（pioglitazone）激活后对QBC939细胞生长的影响。方法 培养QBC939细胞并分别加入不同浓度的吡格列酮进行干预培养,通过RT—PCR检测QBC939中PPAR—γmRNA的表达;光镜下细胞计数了解吡格列酮干预后对细胞增殖的作用;流式细胞技术了解吡格列酮对QBC939细胞周期及凋亡的影响。结果 QBC939中有PPAR—γmRNA表达;PPAR-γ经其配体激活后明显抑制细胞增殖,使细胞周期出现G2／M期停滞,并诱导细胞凋亡。结论 PPAR-γ经其配体激活后通过抑制细胞增殖及促使细胞周期G2／M期停滞而抑制细胞的生长,且诱导细胞凋亡的发生。因此PPAR-γ有可能成为胆管癌治疗的新的分子靶点。     

肝门部胆管癌裸鼠动物模型的建立

目的建立胆管癌细胞系裸鼠肝门部胆管原位种植瘤模型。方法应用自制显微注射针将培养的胆管癌细胞系QBC939细胞接种于裸鼠肝门部胆管与门静脉组织间隙紧贴胆管处,15d后行种植瘤组织解剖学和病理学检查。结果每只裸鼠肝门部胆管与门静脉组织间隙内可接种浓度为1×107个/ml的胆管癌细胞悬液100μl;原位种植15d后,肝门部胆管原位种植瘤成瘤率为100%（7/7）;病理学观察显示为典型的瘤组织表现。结论成功建立了胆管癌细胞系裸鼠肝门部胆管原位种植瘤模型。     

腺病毒介导多基因在胆管癌细胞中的表达

研究腺病毒介导的多基因（ＧＭ－ＣＳＦ,Ｂ７－１,ｐ５３、ＩＬ－２）在胆管癌细胞系ＱＢＣ９３９中的表达及对其生长的影响。方法：构建同时含ＧＭ－ＣＳＦ、Ｂ７－１、ｐ５３、ＩＬ－２ ４种目的基因的重组腺病毒载体Ａｄ－ｍｕｌｔｉｇｅｎｅｓ,应用流式细胞仪、ＥＬＩＳＡ、免疫组化等方法。     

脂质体介导Bcl-2反义寡核苷酸对胆管癌细胞株QBC939的作用

目的：观察Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸（ASODN）对人胆管癌QBC939细胞的作用及对Bcl-2蛋白表达的影响。方法：脂质体LipofectamineTM2000介导Bcl-2 ASODN转染QBC939细胞,应用台盼篮拒染实验检测细胞存活率、克隆形成实验检测克隆形成率、Western blot检测Bcl-2蛋白表达。结果：Bcl-2 ASODN转染后Bcl-2蛋白免疫印迹条带光密度显著低于对照组（P<0.01）;台盼篮拒染实验和克隆形成实验均显示Bcl-2 ASODN可以部分抑制QBC939细胞增殖,经ASODN作用,细胞的存活率和克隆形成率均显著低于对照组（P<0.05）。结论：Bcl-2 ASODN通过封闭人胆管癌QBC939细胞bcl-2基因表达抑制人胆管癌QBC939细胞的增殖。     

抵抗素体外对胆管癌细胞侵袭和转移的影响及其机制

目的:观察重组人抵抗素(resistin)对胆管癌细胞系QBC939增殖、侵袭、转移及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达的影响。方法:分别采用噻唑蓝(MTT)比色法、Matrigel侵袭实验和迁移实验检测不同浓度的抵抗素对QBC939细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响;采用Western blot检测抵抗素对QBC939细胞内MMP-2蛋白表达的影响。结果:当抵抗素浓度高于10 ng/ml时,对QBC939细胞增殖具有明显的促进作用(P<0.01),并呈一定的剂量依赖性;经10、50、100 ng/ml抵抗素处理24 h后,QBC939细胞体外侵袭及迁移能力均较空白对照组明显增强(P<0.01);Western blot法检测抵抗素作用QBC939细胞24 h后MMP-2表达水平显著增加。结论:抵抗素对人胆管癌QBC939细胞的侵袭和转移能力有明显的促进作用,该作用机制可能与提高MMP-2表达水平有关。     

腺病毒介导多基因对胆管癌细胞凋亡的诱 导和肝细胞毒性损害

目的：研究腺病毒介导的多基因（ＧＭ－ＣＳＦ、Ｂ７－１、ｐ５３、ＩＬ－２）对胆管癌细胞系ＱＢＣ９３９ 凋亡的诱导作用和对正常肝细胞的作用。方法：应用ＴＵＮＥＬ细胞凋亡检测法和光镜观察,分析同时含ＧＭ－ＣＳＦ、Ｂ７－１、ｐ５３、ＩＬ－２ ４ 种目的基因的重组腺病毒载体（Ａｄ－ｍ ｕｌｔｉｇｅｎｅｓ）对胆管癌细胞系ＱＢＣ９３９ 和肝细胞系Ｌ０２的作用以及对大鼠肝脏的毒性损害。结果：Ａｄ－ｍｕｌｔｉｇｅｎｅｓ与化疗药物顺铂协同,能诱导３０％ 左右的ＱＢＣ９３９发生凋亡,并对肝细胞系Ｌ０２ 和大鼠肝细胞无明显毒性损害。结论：Ａｄ－ｍ ｕｌｔｉｇｅｎｅｓ能诱导胆管癌细胞ＱＢＣ９３９ 发生凋亡,且与化疗药物顺铂具有协同增强作用。初步分析对人肝细胞及大鼠肝脏无明显毒性损害,具有一定的临床应用前景。     

SiRNA抑制p63基因表达对胆管癌细胞增殖和侵袭的影响

目的构建SiRNA靶向p63载体,稳定导入胆管癌细胞QBC939后,观察细胞增殖和侵袭情况的改变。方法荧光定量PCR检测胆管癌细胞株QBC939细胞中p63表达。构建针对p63的shRNA慢病毒载体,转染胆管癌QBC939细胞中,建立稳定表达shRNA-p63胆管癌细胞株。Western blot检测干扰效率。噻唑蓝(MTT)和软琼脂集落形成实验检测细胞增殖的变化;Boyden小室检测细胞侵袭情况的改变。结果 p63基因显示在QBC939细胞中高表达。序列分析表明,重组到慢病毒载体中的shRNA序列正确。我们利用Western blot筛选了一个干扰p63表达效率为66.8%的单克隆细胞。p63表达降低不但能抑制细胞增殖体外能力,而且还能降低细胞侵袭能力。结论 p63在胆管癌QBC939细胞中高表达。SiRNA靶向抑制p63表达后,能明显降低细胞增殖和侵袭能力。