微波辅助萃取蛇足石杉总生物碱的工艺研究

蛇足石杉为厥类植物,属石松类石杉科(Huperziacease)石杉属(Huperzia),又名千层塔、蛇足草。蛇足石杉具有散瘀消肿、解毒、止痛功能,用于治疗瘀血肿痛、内伤吐血等。从蛇足石杉中提取分离得到的石杉碱甲(Hup A),是一种强效的可逆性胆碱酯酶抑制剂,在临床上主要用于治疗重症肌无     

蛇足石杉主要活性成分及其生物合成研究进展

蛇足石杉Huperzia serrata为我国珍稀濒危药用植物,可供利用的资源极其有限,其所含石杉碱甲对治疗阿尔茨海默病、改善学习记忆等具有显著的疗效。对蛇足石杉的主要活性成分进行系统综述,基于现有研究推导了其活性成分可能的生物合成途径,为其资源开发利用和活性成分的生物合成提供科学参考。     

蛇足石杉HsCAS1基因克隆及序列分析

本研究对蛇足石杉(Huperzia serrata)环阿屯醇合成酶(Cycloartenol synthase,CAS)基因HsCAS1编码区进行克隆及序列分析。根据本实验室已获得的蛇足石杉转录组数据,从中获得1条具有环氧角鲨烯环化酶保守结构域的编码CAS的转录本,采用RT-PCR方法获得该基因的编码区序列,并对HsCAS1蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析。利用实时荧光定量PCR方法检测HsCAS1基因在蛇足石杉的根、茎、叶中的表达情况。序列分析表明,所克隆的HsCAS1基因编码区长为2,271 bp,编码756个氨基酸残基,HsCAS1与紫果冷杉(Abies magnifica)的CAS具有61%的序列相似性。生物信息学预测HsCAS1蛋白含有3个跨膜区,具有萜类环化酶等保守结构域,不含信号肽。HsCAS1在蛇足石杉的根中表达丰度高于茎和叶。本研究在国内外首次获得蛇足石杉HsCAS1基因的编码区序列,为进一步研究HsCAS1在石杉科植物甾醇合成途径中的功能及鉴定酶活性位点奠定基础。     

蛇足石杉内生真菌抗乙酰胆碱酯酶活性筛选及分类鉴定

目的:从蛇足石杉Huperzia serrata(Thunb.ex Murray) Trevis.内生真菌中筛选具有抗乙酰胆碱酯酶活性的菌株.方法:利用乙酰胆碱酯酶水解α-萘乙酯的产物和固蓝B盐发生显色反应的原理,用薄层色谱-生物自显影法对59株蛇足石杉内生真菌发酵产物进行抗乙酰胆碱酯酶活性筛选,并通过18s rDNA和5.8s rDNA序列分析结合形态学特征对目标菌株进行分类鉴定.结果:蛇足石杉内生真菌LQ2F01在抗乙酰胆碱脂酶活性筛选中呈现阳性颜色反应,18s rDNA和5.8s rDNA序列分析并结合形态学分类表明该菌株属枝顶孢霉属Acremonium.结论:蛇足石杉内生真菌LQ2F01表现出和宿主植物相同的抗乙酰胆碱脂酶活性,在天然药物开发以及内生真菌与宿主植物关系的研究中具有重要意义.     

蛇足石杉的地理分布

目的 获取蛇足石杉在世界范围内的地理分布数据,并绘制蛇足石杉的世界及中国资源分布图.方法 查阅世界范围的植物志和部分大型标本馆中有关蛇足石杉的文献资料,特别中国各大标本馆和中国植物志.结果 获取了蛇足石杉在世界范围内的地理分布数据,尤其明确了蛇足石杉在中国详细的分布状况,蛇足石杉主要分布于长江以南各省,东北地区有零星分...     

不同种质资源蛇足石杉引种及差异蛋白比较分析

目的 筛选野生蛇足石杉引种驯化的优质种质资源,并建立其分子鉴别方法。方法 对来自福建大田、三明市郊、南靖3个不同种质资源野生蛇足石杉引种驯化,HPLC法分析不同种质资源蛇足石杉中石杉碱甲（Hup A）量;采用蛋白质双向电泳技术,分析不同种质资源蛇足石杉差异蛋白。结果 种质资源来自大田的蛇足石杉适应性较强,植株长势好,成活率为65.5%,且茎叶Hup A量也较高,分别为197.80和87.54 μg/g;遮阳成活率为77.8%,远高于未遮阳的成活率（7.1%）;黄土地成活率为75%,远高于水田沙壤土的成活率（18.8%）。不同种质资源蛇足石杉共有15个差异蛋白质点,不同种质资源蛇足石杉的差异蛋白质点丰度差异较大。结论 人工引种栽培时,土壤选择以黄土质为佳,并需要给予必要的遮阳;种质资源来自福建大田的蛇足石杉可以作为蛇足石杉优质种质资源进行引种驯化;利用蛇足石杉差异蛋白质点的丰度差异,可以作为鉴别不同蛇足石杉种质资源的依据。     

高温胁迫对蛇足石杉质膜透性及叶绿体结构的影响

目的 蛇足石杉Huperzia serrata是治疗阿尔茨海默病的珍稀药用植物,其生长受高温限制,研究高温对蛇足石杉质膜及叶绿体结构与功能的影响,为生产实践提供参考依据。方法 分别在25、30、35、40 ℃不同温度下处理蛇足石杉,测定不同温度下的膜脂过氧化物丙二醛（MDA）的量及电导率的变化,以及叶绿素总量、叶绿素a、叶绿素b及叶绿素a/b的变化,并用透射电镜观察不同温度处理后的叶绿体的超微结构。结果 在35、40 ℃的高温处理下,MDA、电导率的值明显高于对照;40 ℃处理4 d后,叶绿素总量显著下降,6 d时至最低值,仅为对照的58%,叶绿素a、b量的变化与叶绿素总量的变化规律相似;透射电镜观察显示,35 ℃处理4 d,叶绿体结构出现变形,40 ℃处理4 d叶绿体结构受到明显破坏,被膜模糊并出现不同程度的断裂,类囊体排列紊乱,基质片层不规则,出现断裂等。结论 结合生理指标的变化、叶绿体超微结构及外部形态的变化,蛇足石杉生长的适宜温度在25～30 ℃;40 ℃是蛇足石杉生长的极限温度,胁迫4 d后就会引起植株死亡;35 ℃处理对蛇足石杉生长也有明显的影响,长时间超过35 ℃能引起植株死亡。     

蛇足石杉中石杉碱甲含量的动态变化分析

目的:为揭示蛇足石杉Huperzia serrata居群间和居群内石杉碱甲(HupA)含量的变异程度和变异规律,以及引种前后的变化情况。方法:以采自浙江、广西和重庆的3个蛇足石杉居群,共73株活体植物为研究对象,用改进的HPLC测定了每株引种前后的HupA含量,采用变异系数、单因素方差分析和配对t检验等统计方法,分析了居群间和居群内HupA含量的多样性特征,以及引种前后的含量变化规律。结果:蛇足石杉中石杉碱甲含量在居群间和居群内存在极其丰富的多样性,居群间的含量差异达显著或极显著水平,居群内含量的变异系数从东到西分别为0.36,0.43,0.40;同园引种1年后,东部的浙江居群与西部的广西和重庆居群间的含量差异仍保持极显著的水平,而西部的广西和重庆居群间含量的显著性差异则消失,同时,各居群个体的石杉碱甲含量在引种前后均未发生明显的变化。结论:蛇足石杉中石杉碱甲含量的高低是遗传因素与环境条件共同作用的结果,但更受遗传因素控制。     

相对湿度对蛇足石杉生理生化指标的影响

目的:研究相对湿度对蛇足石杉生理生化指标的影响。方法:设置不同相对湿度,测定蛇足石杉可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、多酚氧化酶活性、过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性。结果:90%相对湿度条件比较适合蛇足石杉生长。结论:本试验结果可为蛇足石杉规范化种植(GAP)提供参考。     

蛇足石杉化学成分和药理作用研究进展

结合国内外文献综述蛇足石杉生物碱和三萜化学成分和药理作用,尤其重点归纳蛇足石杉石松生物碱的结构、类型。石杉碱甲为高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂,优于国外已上市的老年痴呆症治疗药物,是首先从蛇足石杉中发现的lycodine生物碱类型,从蛇足石杉分离的该类型其他生物碱也具有较强的类似活性,具备进一步研究与开发的潜力。     

湘西地区蛇足石杉资源调查研究

目的:系统调查湘西地区蛇足石杉的分布现状、更新频度、产销状况,并为蛇足石杉资源的可持续利用提供对策。方法:采用调查访问和采样方法。结果:随着对蛇足石杉资源掠夺性地采收加上其种群自然更新频度偏低,导致很难维持其种群的动态平衡,野生资源蕴藏量迅速下降,种质资源正逐步消失。结论:应加强蛇足石杉野生种质资源的保护和合理开发利用。     

蛇足石杉离体培养产石杉碱甲的条件优化及动力学研究

目的以具有产石杉碱甲能力的蛇足石杉离体叶状体为研究对象,探究蛇足石杉离体培养物累积石杉碱甲的影响因素及生产动态变化规律。方法应用正交设计对蛇足石杉离体培养叶状体的植物生长物质浓度进行筛选,采用HPLC法对叶状体提取物中的目标成分进行定性定量检测,用Logistic模型拟合叶状体的生长曲线。结果以白光为主要光源,光照时间为12 h/d,1/4 MS固体培养基,为蛇足石杉叶状体产石杉碱甲的最佳条件,相对增殖率达到3 174.5%,石杉碱甲累积量为72.45μg/L;蛇足石杉离体叶状体增殖的生长曲线呈"S"形,继代周期以50 d左右为最适;60 d后生长进入稳定阶段,累积石杉碱甲量明显加快,直至85 d达到最大值7.453μg/g,即叶状体先快速增殖,后累积石杉碱甲。结论叶状体累积石杉碱甲与叶状体增殖呈非生长偶联型,叶状体增长规律符合Logistic生长模型,最大的比生长速率(μmax)为0.071·d-1。     

高温胁迫对蛇足石杉生理特性的影响

目的 研究蛇足石杉的最高耐受温度及耐受时间,为人工栽培蛇足石杉提供温度调控参考.方法 通过在25、30、35、40℃的不同温度下胁迫处理蛇足石杉,测定其叶片中的可溶性糖量、可溶性蛋白质量、游离脯氨酸量及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性在不同处理时间的量,并对其进行相关性分析.结果 随着温度的升高,各项指标均有大幅度的变化,可溶性糖和游离可溶性脯氨酸的量呈上升的趋势,可溶性蛋白质量呈下降趋势,POD和SOD活性均呈现下降的趋势.35℃高温胁迫达8d后,对蛇足石杉的各项生理指标有较大影响,外部形态表现轻度失水,继续处理至12d后,叶片发黄,植株基本死亡;40℃高温胁迫6d后,蛇足石杉的各项生理指标均出现较大幅度的变化,SOD活性显著下降,叶片发黄,第8天植株完全死亡.结论 高温对蛇足石杉的生长有明显影响,其生长温度在25～30℃为宜,长时间持续超过35℃对其生长有明显的影响,40℃为极限高温,短期内会引起植株死亡.     

基于叶绿体matK基因序列探讨10种石杉科石杉属植物的系统关系及分子鉴定

目的:利用叶绿体matK基因序列探讨10种石杉属植物的系统发育及分子鉴定.方法:分别从9种石杉属植物中提取总DNA,经扩增纯化后,用PCR产物直接测序.结果:对石杉属Huperzia Bernh.9个种的叶绿体matK基因进行了测序,序列长度为1 589 bp,并对10个种(亮叶石杉H.lucidula的matK基因序列从GenBank中下载)的matK序列进行比对,其中有35个系统发育信息位点及35个变异位点,以垂穗石松Lycopodiella cernua为外类群,利用MEGA 3.1软件计算种与种之间的遗传距离在1.59%～0.25%,并构建系统树,获得最简约树和邻接树.结论:小杉兰组和蛇足石杉组植物分别聚成一枝,构成姊妹群,其靴带支持率分别为98%和99%.长柄石杉与蛇足石杉分别聚在2个不同进化枝,二者间有19个碱基差异,遗传距离为1.21%.建议应将长柄石杉单独列为一个种.     

蛇足石杉内生真菌DSJ5的分离及其代谢产物HPLC-DAD筛选研究

目的:从蛇足石杉中筛选分离能产生生物活性物质石杉碱甲及其类似物的内生真菌。方法:从蛇足石杉新鲜植株中分离纯化内生真菌,采用HPLC-DAD筛选内生真菌的代谢产物。结果:内生真菌DSJ5代谢产物的色谱峰与石杉碱甲在相同的色谱条件下保留时间相同,且紫外光谱相近;DSJ5经形态特征鉴定为胶胞炭疽菌Colletotrichum gloeosporioide。结论:HPLC结合紫外光谱特征可用于检测内生真菌中微量的代谢产物;蛇足石杉内生真菌DSJ5可能产生石杉碱甲。     

微生物对蛇足石杉扦插生根及若干生理生化指标的影响

目的:研究原生境土壤微生物、内生真菌和根表真菌对蛇足石杉扦插生根率和若干生理生化指标的影响。方法:蛇足石杉分别在原生境土壤(土壤Ⅰ)、接种了内生真菌和根表真菌的灭菌土壤(土壤Ⅱ)、灭菌土壤(土壤Ⅲ)上进行扦插,调查蛇足石杉扦插生根率,测定可溶性蛋白含量,可溶性糖含量,PPO(多酚氧化酶),POD(过氧化物酶)活性、黄酮类化合物和石杉碱甲含量。结果:与土壤Ⅲ上的扦插蛇足石杉相比,土壤Ⅰ和土壤Ⅱ上植株生根率,分别提高了10%和16%,土壤Ⅱ上扦插植株茎中的可溶性蛋白含量显著提高(P<0.05),土壤Ⅰ上扦插植株叶片和茎中的可溶性糖含量显著提高(P<0.05),土壤Ⅰ和土壤Ⅱ上的扦插植株的黄酮类化合物含量显著提高。结论:原生境土壤微生物、内生真菌和根表真菌对扦插蛇足石杉的生根有促进作用,提高蛇足石杉体内的代谢水平。     

蛇足石杉侧芽的发生与培养研究

目的蛇足石杉Huperzia serrata自然繁殖能力低,资源极其匮乏,对蛇足石杉的快速繁殖技术进行探讨。方法取活体茎尖,依次用多种消毒剂进行表面消毒,再用孔雀石绿及原子吸收光谱(AAS)联合杀灭内生真菌,得到无菌苗接种到1/2MS+25 g/L蔗糖的培养基中,无菌苗在二叉分枝后的新枝长到4~5 cm时剪下进行继代培养。结果无菌苗分别在4次二叉分枝生长继代培养后,得到了数量不等的侧芽,侧芽的发生位置位于茎段中部或上部近茎尖处,侧芽的结构与芽孢的结构明显不同;不同植株培养获得的侧芽数不同,最多的植株可产生14个侧芽,一个侧芽发生点可产生一个或多个侧芽;去除茎尖顶端优势后,茎段中部的侧芽生长速度加快;不同高度的侧芽拨离母株后,成活率差别大,5 mm以上的侧芽接种到1/2 MS+30 g/L蔗糖的培养基上,存活率可达90%,120 d后生长为2~3 cm的幼苗,低于5 mm的侧芽,拨离接种后死亡率较高。结论蛇足石杉在离体培养中,可打破自然生长状态下叶腋内只产生孢子囊而不产生侧芽的生长方式,可形成多个增殖侧芽,侧芽剥离后极易产生不定根,为蛇足石杉的试管苗增殖方式提供重要参考。     

蛇足石杉茎尖组织培养研究

目的：研究蛇足石杉茎尖组织培养条件,建立组织快繁体系。方法：通过添加不同浓度的蔗糖及植物激素改良基础培养基,考察其对蛇足石杉茎尖诱导丛生芽和GGB（绿色小体）,GGB的分化以及丛生芽生根的影响。结果：诱导茎尖发生丛生芽和GGB的最适宜培养基分别为MS+2%蔗糖和MS+4%蔗糖;将GGB转接在MS+2%蔗糖培养基中,平均每团GGB可分化出16株丛生芽;在改良MS+10 μmol·L-1IBA生根培养基中,全部丛生芽再生健壮的根系,再生植株的移栽成活率可达80%。HPLC检测表明,组织快繁的蛇足石杉植株具有石杉碱甲合成能力,其含量为60740±3075 μg·g-1,与野生植株相当。结论：初步建立蛇足石杉组织快繁体系,扩大了蛇足石杉种质资源,并为石杉碱甲的合成途径提供了研究基础。     

蛇足石杉中生物碱含量测定方法的研究

目的建立蛇足石杉总生物碱含量的测定方法。方法采用紫外分光光度法,以石杉碱甲为对照,在246 nm波长下建立标准曲线进行蛇足石杉中生物碱含量测定。结果实验表明吸光度和含量间具有良好的线性关系(r=0.999 49),且精密度良好(RSD=1.14%);样品在1 h内测定稳定(RSD=0.947%)。结论紫外分光光度法是一种简便、快速测定蛇足石杉中生物碱含量的方法,该测定方法可作为蛇足石杉的质量控制。     

蛇足石杉过氧化物酶和酯酶同工酶比较研究

采用聚丙烯酰胺不连续垂直平板电泳(PAGE)技术,对蛇足石杉的过氧化物酶(POD)同工酶及酯酶(EST)同工酶酶谱进行了比较分析.结果 表明,两种同工酶在蛇足石杉的组织中均有不同的表达程度,在叶中POD检测到8条酶带,EST检测到7条酶带;在茎中POD检测到4条酶带,EST检测到6条酶带;在根中POD检测到5条酶带,EST检测到5条酶带.两种酶同工酶带型在蛇足石杉中存在明显的组织器官特异性.