兔脂肪干细胞体外构建组织工程软骨:负载胰岛素样生长因子1基因的作用

背景:前期研究证实在二维培养条件下,转染胰岛素样生长因子1基因能够明显促进脂肪间充质干细胞的增殖.目的:在前期研究基础上,利用壳聚糖明胶复合物为立体培养的载体,观察三维立体培养条件下胰岛索样生长因子1基因转染对兔脂肪间充质干细胞增殖能力的影响,体外初步构建组织工程软骨.方法:分离、培养成年新西兰大耳白兔脂肪间充质干细胞,构建稳定表达pcDNA3.1-IGF-1的细胞株,鉴定后接种于壳聚糖三维支架材料上,分组培养:空白对照组接种未转染基因的脂肪间充质干细胞,空载体组接种胰岛素样生长因子1诱导条件下培养的脂肪间充质干细胞,基因转染组接种稳定转染胰岛素样生长因子1基因的脂肪间充质干细胞,培养1周.扫描电镜观察各组细胞形态,MTT法绘制细胞增殖曲线,CM-DiL荧光标记后观察细胞增殖比率及细胞分布,DMMB法测定糖胺聚糖含量.结果与结论:成功构建稳定表达pcDNA3.1-IGF-1的细胞株,转染后的细胞株在mRNA水平上获得胰岛素样生长因子1的表达,并成功翻译为蛋白.扫描电镜示各组细胞在支架上贴附、伸展良好,基因转染组细胞生长最为旺盛.MTT及GAG检测结果提示,基因转染组增殖能力最强、糖胺聚糖最高(P<0.01),荧光标记显示细胞分布均匀,存活率高(P<0.05).提示胰岛素样生长因子1基因转染联合三维立体培养能够有效促进兔脂肪间充质干细胞的增殖和软骨细胞外基质糖胺聚糖的分泌.     

SOX-9和胰岛素样生长因子1共同转染大鼠骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景:单基因诱导虽能对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化产生积极影响,但作用有限,多种基因共同作用才符合机体真实内环境的需求,并有助于发挥多基因产物之间的协同作用,提高分化效果.目的:验证应用SOX-9和胰岛素样生长因子1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后,目的基因分泌情况及向软骨细胞的分化效果.设计、时间及地点:两样本观察,实验于2008-04/2009-02在中国医科大学细胞生物实验室完成.对象:6周龄健康雄性Wistar大鼠2只用于骨髓间充质干细胞提取.方法:扩增、提取质粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9.分离、纯化Wistar大鼠骨髓间充质干细胞.按转染情况分为5组:①未转染组:仅加入双无(无血清无双抗)L-DMEM.②转染窄载体组:双无L-DMEM+pcDNA3.1空载体和脂质体.③转染SOX-9组:双无L-DMEM+pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体.④转染胰岛素样生长因子1组:双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1质粒和脂质体.⑤共转染组:双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体,混合.主要观察指标:对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,反转录-聚合酶链反应和Western blot法检测筛选后细胞目的基因和蛋白的表达.结果:MTT法检测转染SOX-9组、转染胰岛素样生长因子1组和共转染组骨髓间充质干细胞增殖活性A值显著高于未转染组、转染空载体组(P<0.01).反转录-聚合酶链反应和Westem blot检测目结果显示,SOX-9表达以转染SOX-9组最多;胰岛素样生长因子1表达以共转染组最多:软骨细胞特异性基质Ⅱ型胶原表达以共转染组最多.结论:双基因转染在诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化的能力和细胞外基质分泌的能力上更明显高于单基质转染;另外结果间接说明胰岛素样生长因子1具有诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的作用,但能力弱于SOX-9.     

肌腱愈合及粘连形成机制的研究:胰岛素样生长因子1基因真核表达载体的构建及表达

目的:探讨真核表达载体介导外源性胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因转染肌腱细胞的可能性。方法:组织块法培养原代肌腱细胞,体外重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-IGF-1,并以脂多胺DOGS为介导转染培养的肌腱细胞,反转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测IGF-1mRNA的表达,ELISA法检测IGF-1活性蛋白表达。结果:成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-IGF-1;RT-PCR检测显示转染后的肌腱细胞成功表达IGF-1mRNA;ELISA结果显示转染组IGF-1蛋白表达较对照组明显增高(t=-2.873,P<0.05)。结论:重组的真核表达载体pcDNA3.1(+)-IGF-1能够将IGF-1cDNA成功导入肌腱细胞并表达。     

转化生长因子β1转染骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

目的:通过转化生长因子β1基因转染大鼠的骨髓间充质干细胞,观察目的基因的分泌情况及干细胞向软骨细胞分化效果,为构建新型的软骨组织工程学种子细胞提供新思路。方法:实验于2005-10/2006-09在中国医科大学细胞生物实验室完成。实验材料:6周龄Wistar大鼠10只,质粒pcDNA3.1-TGF-β1(由吉林大学徐莘香教授惠赠),转化生长因子β1、Ⅱ型胶原小鼠抗大鼠单克隆抗体(Neomaker公司)。实验分组:分为未经转染的骨髓间充质干细胞(未转染组)、转染空载的骨髓间充质干细胞(转染空载体组)和转染转化生长因子β1的骨髓间充质干细胞(转染转化生长因子β1组)。实验方法:①密度梯度离心法和贴壁分离法相结合分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,免疫荧光法检测细胞表面标志。②质粒pcDNA3.1-TGF-β1扩增、提取、鉴定。③转化生长因子β1基因转染骨髓间充质干细胞。实验评估:①四甲基偶氮唑盐法测定筛选后细胞的增殖活性。②Westernblot检测转染后细胞转化生长因子β1和Ⅱ型胶原蛋白表达。结果:①免疫荧光法检测骨髓间充质干细胞:CD29和CD44表达阳性,CD34和CD45表达阴性。②pcDNA3.1-TGF-β1真核表达载体的酶切鉴定:基因测序与GeneBank cDNA序列相符。③转染基因对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响:基因转染后骨髓间充质干细胞的增殖力变强,转染组的细胞增殖力高于未转染组和转染空载体组。④转化生长因子β1表达:转染后的骨髓间充质干细胞较未转染和转染空载体的骨髓间充质干细胞分泌转化生长因子β1蛋白增加。⑤Ⅱ型胶原的蛋白表达:在转化生长因子β1目的基因转染后的骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原蛋白表达较未染和转染空载体的骨髓间充质干细胞增强。结论:应用基因转染技术将转化生长因子β1目的基因导入骨髓间充质干细胞中,在蛋白质水平鉴定转染成功,且骨髓间充质干细胞成软骨分化所需的特异性细胞外基质Ⅱ型胶原明显升高,使骨髓间充质干细胞在保持很强的体外传代增殖能力同时,又能产生、表达转化生长因子β1。     

胰岛素样生长因子Ⅱ基因转染骨髓基质细胞后的生物学活性

目的:将人胰岛素样生长因子Ⅱ基因的真核表达载体pcDNA3-胰岛素样生长因子Ⅱ,转染兔骨髓基质细胞,使其在该细胞中瞬时表达,并观察该表达载体促进骨髓基质细胞增殖的生物学活性。方法:实验于2004-08/12在解放军总医院骨科研究所完成。①骨髓基质细胞培养:取4周龄雄性新西兰大白兔1只用于骨髓基质细胞提取。培养的第2代细胞用于实验。②基因转染:将人胰岛素样生长因子Ⅱ基因的真核表达载体pcDNA3-胰岛素样生长因子Ⅱ,转染兔骨髓基质细胞,对照组则为空载体pcDNA3。③转染与非转染骨髓基质细胞胰岛素样生长因子ⅡmRNA表达:采用反转录-聚合酶链反应检测。④转染细胞的增殖状况检测:采用四甲基偶氮唑盐法测定各组吸光度(A)值(A值越大表示细胞增殖越强)。结果:①转染与非转染骨髓基质细胞胰岛素样生长因子ⅡmRNA表达:琼脂糖凝胶电泳的结果显示,未转染和转染pcDNA3质粒的细胞仅出现内参照β-肌动蛋白的条带,而转染的细胞出现胰岛素样生长因子Ⅱ和β-肌动蛋白的两条带。②转染细胞的增殖状况:24,48,72h各时间点单纯骨髓基质细胞组和转染胰岛素样生长因子Ⅱ的骨髓基质细胞组细胞增殖均显著高于与对照组(72h:1.233±0.45,1.575±0.45,0.482±0.04,P<0.01);转染胰岛素样生长因子Ⅱ的骨髓基质细胞组显著性高于单纯骨髓基质细胞组(P<0.01)。结论:将具有多重生物学效应的胰岛素样生长因子Ⅱ基因转入软骨组织工程最佳种子细胞-骨髓基质细胞,明确胰岛素样生长因子Ⅱ促进骨髓基质细胞增殖分化效应,并初步证实了其促进种子细胞的成骨活性。     

体外培养条件下人骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因的转染与鉴定

背景:骨髓间充质千细胞的定向分化需要合适生长因子的调控,利用细胞因子基因转染促进其生长,定向分化和加速骨缺损修复是近年来研究热点.目的:探讨在体外培养条件下转染碱性成纤维细胞生长因子基因对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响.方法:将含人pcDNA3.1-bFGF真核表达载体DH-5α菌扩增,用EndoFree质粒抽提纯化试剂盒抽提质粒,并对所提取的pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒进行酶切鉴定和测序.利用脂质体将pcDNA3.1-bFGF质粒转染到生长良好的P3代骨髓间充质干细胞,G418筛选获得抗性克隆.采用荧光定量PCR、免疫组化、免疫荧光、Westem-blot检测转染后骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因及其产物的表达,流式细胞仪检测细胞增殖周期.结果与结论:脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染骨髓间充质干细胞后,转染细胞确实表达碱性成纤维细胞生长因子,且表达部位丰要位干胞浆.转染细胞增殖活力加强,处于增殖周期的细胞比例更高(P<0.05).提示采用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF成功导入体外培养的骨髓间充质干细胞,碱性成纤维细胞生长因子基因转染后可改善骨髓间充质干细胞的生存状态,促进其增殖.     

胰岛素样生长因子1真核细胞表达质粒构建及在大鼠脊髓内的表达

目的:构建胰岛素样生长因子1的真核细胞表达质粒,分析pcDNA3.1-hIGF-1体内转基因的可行性。方法:实验于2004-06/09在吉林大学基础医学院动物实验室完成。①选取清洁级成年雄性Wistar大鼠12只,随机数字表法分为胰岛素样生长因子1组、模型对照组、正常对照组,4只/组。②聚合酶链法从人的肝细胞cDNA文库中克隆出胰岛素样生长因子1cDNA,然后定向插入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,酶切电泳和基因测序鉴定插入质粒的人源性胰岛素样生长因子基因序列。③胰岛素样生长因子1组应用直接注射法将阳离子脂质体和pcDNA3.1-hIGF1混合后转染至大鼠胸段脊髓组织中;模型对照组注射等剂量pcDNA3.1和阳离子脂质体混合液。正常对照组未作任何处理。1周后应用免疫组化法观察人源性胰岛素样生长因子在大鼠脊髓中的表达。结果:实验选取清洁级成年雄性Wistar大鼠12只,全部进入结果分析。①聚合酶链反应片段鉴定结果:琼脂糖电泳显示,扩增带大小与预期的人源性胰岛素样生长因子cDNA相同。②重组的真核表达质粒的鉴定结果:酶切鉴定显示,重组的真核细胞表达质粒pcDNA3.1-hIGF-1所含的IGF-1cDNA序列和插入方向均正确。③基因转染后各组胰岛素样生长因子1免疫组化测定结果:基因转染1周后,胰岛素样生长因子1组脊髓组织内阳性细胞数明显高于模型对照组和正常对照组(48.2±5.3,29.3±4.2,23.8±8.3,P<0.01)。结论:阳离子脂质体介导pcDNA3.1-hIGF1体内转基因的方法是可行的。     

转化生长因子β1基因转染鼠脂肪间充质干细胞的可行性

背景:脂肪间充质干细胞在转化生长因子β_1等生长因子的调控下可被诱导分化为软骨细胞.然而,外源性转化生长因子β_1存在引起趋化性、激发炎症反应、造成局部损伤、有效成分容易被稀释或丢失、半衰期短、缺少理想的转运蛋白等缺陷.因此,利用基因重组技术,使种子细胞表达转化生长因子β_1,对软骨组织工程的进一步发展具有重要的指导意义.目的:探讨真核表达载体pcDNA3.1-转化生长因子β_1质粒的构建方法,并观察其转染脂肪间充质干细胞的可行性.方法:利用基因重组技术,将大鼠转化生长因子β_1全长基因的PCR产物与克隆载体pT7Blue连接,并用大肠杆菌筛选阳性重组体构建真核表达质粒,采用XboⅠ、Hind Ⅲ双酶切及测序方法对质粒进行鉴定;将已经纯化的pcDNA3.1-转化生长因子β_1质粒和空载体pcDNA3.1质粒分别采用阳离子脂质体试剂LipofectamineTM2000转染脂肪间充质干细胞,经G418抗性筛选后扩大培养,同时用pcDNA3.1-绿色荧光蛋白观察转染效率.结果与结论:重组质粒经XboⅠ、Hind Ⅲ双酶切后出现1.35 bp和5.4 kb 2条带,测序结果显示重组质粒所包含的转化生长因子β_1全长碱基序列完全正确,绿色荧光蛋白显示其转染脂肪干细胞的转染效率> 80%,且转染细胞后有转化生长因子β_1 mRNA和蛋白的表达上调.提示利用基因重组技术可成功构建能转染脂肪间充质干细胞的真核表达载体pcDNA3.1-转化生长因子β_1质粒.     

人胰岛素样生长因子1真核细胞表达质粒的构建及其稳定表达细胞株的建立

目的构建胰岛素样生长因子1(insulin growth factor1,IGF-1)的真核细胞表达质粒,转染神经胶质瘤细胞(C6细胞),建立hIGF-1稳定表达细胞株,为进一步观察胰岛素样生长因子1基因体内转染后对脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响打下基础。方法实验于2004-05/09在吉林大学公共卫生学院放射生物实验室进行。用聚合酶链反应方法从人的肝细胞cDNA文库中克隆出IGF-1cDNA,然后定向插入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,酶切电泳和基因测序鉴定插入质粒的hIGF-1基因序列;使用C6细胞株,用脂质体方法转染C6细胞。经G418筛选,形成阳性细胞克隆。继续培养4周,进行W estern blot检测。结果重组的真核细胞表达质粒pcDNA3.1-hIGF-1所含的IGF-1cDNA序列和插入方向均正确。W estern blot检测结果证实转染的hIGF-1基因在C6细胞内成功表达。结论实验所构建的重组真核细胞表达载体pcDNA3.1-hIGF-1能够稳定表达有活性的hIGF-1,实验结果对进一步观察脊髓损伤后胰岛素样生长因子1抑制神经细胞凋亡的作用有一定意义。     

pcDNA3．1-VEGF165质粒转染骨髓基质干细胞后血管内皮生长因子的表达

目的:检测pcDNA3.1-VEGF165载体转染对兔骨髓基质干细胞血管内皮生长因子表达的影响。方法:实验于2005-07/2006-01在山东省青岛市市立医院中心试验室完成。①pcDNA3.1-VEGF165质粒由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科杨述华教授惠赠。②选取1月龄新西兰大白兔1只,无菌条件下取胫骨和股骨,进行骨髓基质干细胞的分离与培养。③转染前24h计数细胞,每孔5×105细胞接种于6孔板,待骨髓基质干细胞达到80%～90%融合时准备转染,设立未转染组、空载体组和载体组。未转染组无特殊处理,空载体组转染pcDNA3.1载体,载体组转染pcDNA3.1-VEGF165。④转染后72h,反转录聚合酶链反应检测各组骨髓基质干细胞中血管内皮生长因子165mRNA的表达;酶联免疫吸附法检测各组骨髓基质干细胞中血管内皮生长因子165蛋白的含量。结果:①骨髓基质细胞分离培养形态观察:初始分离的骨髓细胞呈圆形,大小不一;24h后有少量细胞贴壁;48h后贴壁细胞部分为成纤维样细胞;72h贴壁的成纤维样细胞数不断增加;96h后贴壁生长的细胞主要为梭形的成纤维样细胞;分瓶后细胞形成克隆;传代后细胞贴壁生长,分裂相增多,并不断增殖分化形成均一的梭形细胞。②转染72h后各组细胞血管内皮生长因子165mRNA的表达情况:反转录聚合酶链反应检测到载体组在576bp处有明显条带,空载体组和未转染组均未见血管内皮生长因子165表达。③转染72h后各组细胞血管内皮生长因子165蛋白含量检测结果:酶联免疫吸附结果显示,载体组转染pcDNA3.1-VEGF165载体的骨髓基质细胞培养上清液中血管内皮生长因子165蛋白浓度为(170.1±14.3)ng/L,而空载体组与未转染组均未检测到血管内皮生长因子165蛋白表达,差异有显著性意义(t均=42.206,P=0.000)。结论:应用pcDNA3.1-VEGF165载体转染,可使兔骨髓基质干细胞获得外源性血管内皮生长因子165基因和蛋白的表达。     

韶关市农村留守儿童孤独感状况调查

目的了解广东省韶关市农村地区留守儿童孤独感现状及其影响因素。方法对韶关市某地区两所农村小学3～6年级学生中的489名留守儿童采用儿童孤独量表和自编调查表进行问卷调查。结果17．6％留守儿童存在孤独感,不同性别孤独感发生率无差异性,不同年龄及不同年级间孤独感发生率差异均有极显著性（P〈0.01）;随年级增加,孤独感发生率呈下降趋势（X^2趋势=5．970,P〈0.05）。留守儿童孤独感与健康状况、学习成绩、学习困难程度、父母教育方式、父母间关系和老师教育方式等因素显著相关（P〈0.01～0．05）。结论农村地区留守儿童中存在一定程度的孤独感问题,老师和家长应以正确的态度和方法对待留守儿童,以减少其孤独感的发生。     

产科新生儿不同部位经皮测黄报警预值的可靠性观察

目的对比观察产科新生儿不同部位经皮胆红素（TCB）报警预值的可靠性。方法132例产科新生儿采取随机数字分组法分为正常产组和剖宫产组各66例,新生儿均于产后第4天同一时间点应用KJ8000经皮测黄仪分别测量额、胸、腹、额胸、额胸腹TCB值,TCB〉12．9mg／dl者,取得亲属同意抽取静脉血检测血清胆红素（SB）,对比分析不同部位TCB及其与sB值的差异。结果两组分别有17例或21例达到TCB报警预值。两组TCB或sB相同方法及相同部位比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;两组TCB不同部位对比,额部值最低、胸部值最高,且与其他部位同组对比差异均有统计学意义（P〈0．01）;两组sB值对比差异无统计学意义（t=1．53,P〉0．05）,与不同部位TCB对比均以胸部数值差异无统计学意义（P〉0．05）,而与其他部位TCB两组差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论正常产与剖宫产新生儿术后sB对比差异无意义;TCB动态监测以胸部结果更接近SB。     

Determination of loss of quality of life

Physiatrists are a valuable resource in legal settings, where assessment of functional capacity to perform work and of future medical needs must be determined. Physiatrists help determine what future medical care is needed to restore and maintain an individual at the maximum level of life function. This article focuses on the use of a quality of life (QOL) rehabilitation model, rather than a medical model, for enhancing functional performance, modifying environments, and facilitating patient coping. We discuss use of the QOL model to describe and influence a patient's physical, psychological, cognitive, vocational/economic, and social/leisure domains.     

肇庆市居民颈椎病流行病学调查

目的 :调查肇庆市居民颈椎病发病情况及相关问题。方法 :通过分层随机抽样选择该市区18～70岁居民5000人为研究对象 ,入户或至单位询问调查。结果 :该市居民颈椎病发病率为8.11% ,男女差异无显著性 ,随着年龄的增长 ,发病率逐渐增加。经多因素分析 :体位姿势不正确、情绪紧张、潮湿、疲劳是发病的主要诱因。结论 :该病严重影响肇庆市居民的健康 ,做好防治应从早做起 ,综合防治。     

中国人四肢瘫日常生活能力评定量表的信度研究

目的研究四肢瘫日常生活能力评定量表评测四肢瘫患者的重测信度及观察者间信度。方法由1位评定者应用四肢瘫日常生活能力评定量表对20例四肢瘫患者进行评定,评定后1周内再次对该患者进行评定;另1位评定者在第1位评定者初次评定后2 d内对该患者进行评定。结果第1位评定者两次评定总分的组内相关系数为0.994(P<0.01);第1位评定者与第2位评定者评定总分的组内相关系数为0.971(P<0.01)。结论四肢瘫日常生活能力评定量表具有良好的重测信度及观察者间信度。