布鲁氏菌猪种标准株外膜蛋白OMP25的原核表达

目的克隆布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因并构建基因的原核表达系统。方法用聚合酶链反应技术扩增得到布鲁氏菌基因组，得Omp25基因片段，T—A克隆后测定核苷酸序列，将目的基因定向插入原核表达载体pGEX-4T-1，经双酶切和DNA测序测定，将构建的重组质粒转化大肠杆菌（E．coli HB101，TOP10），经IPTG诱导后，用SDS—PAGE检测重组蛋白rOrap25表达情况。结果经DNA测序显示Omp25DNA序列和插入位点正确，成功构建了重组质粒DGEX-4T-1-Omp25，经IPTG诱导，特异性表达出以包涵体形式存在48kDa的Omp25融合蛋白。结论制备、克隆了布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因片段，并在大肠杆菌中表达出Omp25融合蛋白。     

用双向电泳及蛋白质印迹技术筛选乳腺癌相关抗原

目的：应用双向电泳及免疫印迹技术分析乳腺癌MCF-7细胞总蛋白,寻找乳腺癌相关抗原。方法：提取乳腺癌MCF-7细胞总蛋白,双向电泳技术（2-DE）对总蛋白进行分离后转膜,将健康人血清（对照组）和乳腺癌患者血清（实验组）作为一抗进行蛋白质印迹（Western blotting）分析,寻找杂交蛋白点的差异。结果：MCF-7总蛋白双向电泳考马斯亮蓝染色图谱共检测到248个蛋白质斑点,Western blotting显示实验组抗原抗体反应点23个,对照组为13个,找到10个差异蛋白点。结论：乳腺癌患者血清中的抗体表达水平有改变,这10个差异蛋白点有可能是乳腺癌相关抗原。     

神经蛋白质组学双向电泳技术体系的建立

目的：建立神经蛋白质组学双向电泳技术体系。方法：利用双向电泳技术分别以人脑脊液、人和鼠脑组织为研究对象。通过离心等手段提取蛋白。行双向电泳,硝酸银染色,进行图谱分析。结果：从双向电泳图谱上获得蛋白质斑点：正常人脑脊液359个,多发性硬化人脑脊液397个,正常人脑组织480个．正常鼠脑组织524个。经与SWISS-2DPAGE DATA比对,发现差异蛋白点。结论：从蛋白质水平探讨多发性硬化症、脑出血等疾病的发病机制。对寻找有效的药物靶点具有重要意义,同时为神经系统其它疾病的研究提供了切实可行的神经蛋白质组学研究技术体系。     

布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因的克隆、表达和免疫学特性的初步研究

目的研究布鲁氏菌外膜蛋白OMP31的克隆、测序和表达,并对其进行初步的血清学鉴定。方法从布鲁氏菌基因组中获得OMP31基因连接入PMD-18T克隆质粒并测序,克隆入融合表达载体PGEX-4T-1,构建重组质粒PGEX-4T-1/OMP31,在大肠杆菌中将该蛋白表达。用Western-blot分析重组表达的GST-OMP31的免疫学特性。结果成功构建了PGEX-4T-1/OMP31原核表达载体并在大肠杆菌中表达了OMP31基因,布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别所表达的蛋白。结论成功表达了布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因,它可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应,为之后的抗原性以及免疫原性研究打下良好的基础。     

肺癌性与结核性胸腔积液蛋白质组的差异

目的：建立肺癌性胸腔积液与结核性胸腔积液的双向电泳图谱,分析二者蛋白质表达的差异和特点。方法：以固相pH梯度等电聚焦为第一向,垂直板SDS-PAGE为第二向分离胸水蛋白质,银染显色,扫描仪获取凝胶图像并对其进行软件分析。应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定差异蛋白质。结果：双向电泳结果显示,肺癌性胸腔积液中表达增高2倍的差异蛋白点52个,降低50%的蛋白质点60个。有9个点仅在结核性胸腔积液表达,11个点仅在肺癌胸腔积液中表达,并通过肽指纹图分析成功鉴定了6个蛋白质。结论：肺癌性胸腔积液组与结核性胸腔积液组的双向电泳结果显示蛋白表达图谱有明显差异,这些差异蛋白可能是肺癌相关蛋白或肺癌特异性蛋白标志物。     

人CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25-T细胞蛋白质组的双向电泳分析

目的 用双向电泳技术分析人CD4^ CD25^ T细胞和CD4^ CD25^-T细胞表达的蛋白质组，建立二者之间的差异表达谱。方法 从人脾脏分选CD4^ CD25^ T细胞和CD4^ CD25^-T细胞，用双向电泳技术分析两种细胞蛋白质组的表达差异。结果 分选细胞纯度分别为CD4^ CD25^ T细胞82.3%,CD4^ CD25^-T细胞96.5%，双向电泳分析发现有4个蛋白点明显仅于CD4^ CD25^ T细胞检测到表达，有9个蛋白点明显仅于CD4^ CD25^-T细胞检测到表达。结论 CD4^ CD25^-T细胞和CD4^ CD25^-T细胞表达蛋白质组有明显差异。     

梅毒螺旋体外膜蛋白功能的研究进展

梅毒是一种严重影响人类健康的慢性传播性疾病,是由梅毒螺旋体感染所引起。梅毒螺旋体外膜蛋白(Omp)是一类具有关键性功能的蛋白。Omp在梅毒螺旋体的免疫原性、黏附宿主细胞以及转运营养物质等方面具有非常重要的作用。本文就梅毒螺旋体主要外膜蛋白的结构、功能等特性做一综述。     

肾癌及癌旁组织蛋白质组学的比较研究

目的：建立肾癌及癌旁组织比较蛋白质组学双向电泳技术研究体系。方法：取病理证实的肾癌及癌旁组织,研磨、超声裂解、抽提蛋白,采用双向凝胶电泳分离,进行染色,Image Master 2D Platinum软件分析、识别差异表达蛋白质,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱得到相应肽质量指纹图谱,搜索数据库鉴定部分差异蛋白质点。结果：从双向电泳图谱上获得蛋白质斑点：肾癌组织(1326±78)个,癌旁组织(1232±56)个。显著差异蛋白质点46个,对其中7个点进行了筛选鉴定。结论：分析这些差异蛋白有助于寻找具有普遍性意义的肾癌标志物,进而为肾癌的早期诊断和防治提供理论和实验依据。     

小鼠胚胎成纤维细胞条件培养液的蛋白质组学初步分析

目的：运用双向电泳、质谱技术对小鼠胚胎成纤维细胞饲养层条件培养液进行蛋白质组学分析,寻找其中可能具有抑制分化作用的蛋白因子。方法：用60Co γ-射线照射昆明白小鼠胚胎成纤维细胞,制成饲养层,置于ITS（胰岛素-转铁蛋白-硒钠盐）培养液中培养24h,收集条件培养液。用冷冻干燥、凝胶过滤层析、冷丙酮沉淀的方法从条件培养液中提取蛋白质样品,经双向电泳和银染得到双向电泳图谱,用Image master elite 2.0软件进行图像分析。取蛋白点进行酶解,再用CapLC-ESI-Q-TOF质谱进行分析,使用Mascot软件在NCBInr数据库中进行搜索。结果：双向电泳得到（221±67）个蛋白点的银染图谱,初步分析鉴定13个蛋白点。结论：昆明白小鼠胚胎成纤维细胞条件培养液中含有β-半乳糖苷结合蛋白、半胱氨酸富集的酸性分泌蛋白（SPARC）等成分。     

羊布鲁氏菌omp25基因原核表达载体的构建与鉴定

目的:利用PCR反应从羊布鲁氏菌基因组DNA中克隆omp25基因,并将其构建到原核表达载体pET-32a中。方法:试剂盒法提取羊布鲁氏菌基因组DNA,设计合适的引物,通过PCR反应从基因组中扩增外膜蛋白OMP25的编码基因(omp25)。将得到的基因片段连接到克隆载体pMD19-T的多克隆位点(MCS)中,将连接体pMD19-T-omp25转化感受态大肠杆菌DH5(并进行筛选和克隆扩增,提取质粒并进行酶切分析与序列测定。利用酶切与连接反应将目的基因(omp25)插入载体pET-32a的多克隆位点中,将连接体pET-32a-omp25转化感受态大肠杆菌DH5(并进行筛选和克隆扩增,提取质粒并进行酶切分析。结果:PCR扩增得到的基因片段与GenBank中已公布的羊布鲁氏菌omp25基因同源性为99%。酶切分析结果表明,omp25基因成功地插入载体pET-32a中。结论:成功地扩增得到了羊布鲁氏菌omp25基因并构建了携带该基因的重组原核表达载体pET-32a-omp25,为后续的研究提供了可靠的基础。     

不同培养基上空肠弯曲菌生长特性及外膜蛋白表达差异的初步研究

目的 探讨不同培养基对空肠弯曲菌(CJ)的生物学特性和外膜蛋白表达的影响.方法 采用改良布氏、改良布氏血、改良卵黄等3种培养基培养CJ,48 h后进行菌落观察、菌体观察、动力学试验、生物化学检验、间接荧光检测等初步确定生物学特性,比较3种培养基上CJ生长特性的差别.采用0.2 mol/L、pH 2.2甘氨酸-HCl缓冲液抽提CJ外膜蛋白,SDS-PAGE电泳后,灰度扫描观察比较不同培养基上CJ的28 000～31000外膜蛋白表达差异.结果 改良卵黄培养基上CJ的生长特性典型,并且其菌体形态较另外两种培养基粗壮,繁殖速度更为快速,改良卵黄培养基来源的CJ的28000～31 000外膜蛋白的表达较改良布氏血培养基丰富.结论 改良卵黄培养基培养CJ是一种生长特性典型、28000-31000外膜蛋白表达丰富的培养基,该培养基的选择和使用将为该类蛋白的CJ亚单位疫苗大规模制备、CJ的流行病学检验、食品安全卫生检验检疫奠定重要基础.

Abstract：

Objective To evaluate the biological characteristics of Campylobacter Jejuni (CJ) cultured on different culture media and their expression abundance of outer membrane proteins (OMPs). Methods CJ was cultured on the improved Bull's medium yolk agar, improved Bull's blood agar or improved Bull's agar for 48 h. The biological characteristics of the bacteria, including the colony feature, morphology, motility, biochemistry, and results of indirect fluorescence test were observed and compared. OMP of the cultured CJ was extracted using 0.2 mol/L and glycine-hydrochloride buffered solution (pH 2.2) and identified by SDS-PAGE to compare the expression abundance of the OMPs with molecular weight of 28-31 kD. Results CJ exhibited typical biological characteristics with larger cell body and more rapid growth on improved Bull's medium yolk agar than those on improved Bull's blood agar and improved Bull's agar. The bacteria grown on improved Bull's medium yolk agar showed also greater expression abundance of the OMPs with molecule mass between 28 kD and 31 kD. Conclusion Improved Bull's medium yolk agar allows rapid growth of CJ with typical biological characteristics and enhanced expression of the OMPs with molecular weight of 28 -31 kD, and can be widely used in CJ subunit vaccine development, CJ epidemiological survey, CJ food safety examination, and CJ quarantine.     

八株弯曲菌外膜蛋白的SDS-PAGE分析

用超声波处理八株不同来源,不同种和亚种的弯曲菌菌悬液,获得细菌细胞外膜;再用月桂酰肌氨酸钠处理外膜可获得外膜蛋白;最后经SDS-PAGE分离出不同分子量的外膜蛋白。结果表明:各种分子量蛋白质的分布及主要外膜蛋白的数目(2～3条)和分子量大小(33～68kd)均较稳定,提示它们在弯曲菌细胞表面结构中为稳定成分。     

八株弯曲菌外膜蛋白的SDS—PAGE分析

The outer membrane proteins (OMPs) from 8 strains of Campylobacter, including 5 reference strains and 3 local strains, were isolated and examined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The results showed that the population distributions of molecular weight of OMPs from different species and sources were alike based on the Rank Sum Test analysis. The number of bands of major OMP was around 2-3, the molecular weight of which varied from 33-68 kd. Moreover, three C. jejuni local strains isolated from patients in China showed common characteristics of OMPs to the reference strains. It is suggested that the OMPs of Campylobacter are of a conservative and stable structure.     

MIF和COX-2在实验性IgA肾病肾组织中的表达

目的探讨巨噬细胞移动抑制因子(MIF)和环氧化酶2(COX-2)在实验性IgA肾病肾组织中的表达及其相关性。方法应用葡聚糖G200和大肠杆菌外膜总蛋白(OMPs)提取物分别免疫小鼠,诱导IgA肾病模型,设立葡聚糖组和大肠杆菌外膜蛋白组,同时建立空白对照组。用免疫组化方法检测MIF和COX-2在实验性IgA肾病肾组织中的表达与分布。结果MIF和COX-2在葡聚糖组和大肠杆菌外膜蛋白组肾小管上皮细胞中的表达显著上调,在两组的表达显著高于空白对照组(P<0.01)。MIF和COX-2在实验性IgA肾病肾组织的表达与肾组织损伤的程度呈正相关。结论MIF和COX-2在IgA肾病肾组织的表达比较高,提示MIF和COX-2在IgA肾病的发生、发展中发挥一定的作用。     

长沙人间布鲁菌分离株omp25基因扩增和系统进化分析

目的了解长沙地区人间布鲁菌omp25基因的序列特征并阐明其系统进化关系,为布鲁菌病防控以及omp25基因克隆与表达研究提供参考。方法根据Gen Bank公布的羊种布鲁菌16M的omp25基因序列设计1对PCR引物,采用PCR法从长沙地区布鲁菌分离株基因组中扩增omp25基因,产物用凝胶电泳进行分析后进行双向核苷酸序列测定,测序结果用DNAstar 7.1进行分析,将测序结果提交Gen Bank,并利用Mega 7软件构建布鲁菌长沙分离株系统进化树。结果 41株布鲁菌成功扩增出omp25基因片段,片段长度约640 bp,通过测序后Blast同源性分析,证实41株菌株均为羊种布鲁菌,长沙分离株与10株羊种布鲁菌序列100%相同,进化树显示长沙分离的布鲁菌和国内外羊种布鲁菌位于同一进化分支上,同广西的LA1105参考株亲缘关系最近。结论长沙地区人间布鲁菌分离株omp25基因序列与参考菌株序列同源性高,且与羊种布鲁菌在同一分支,表明omp25基因序列是一个保守序列。该研究结果可为布鲁菌的分子生物学鉴定和诊断试剂的研制提供参考。     

布鲁菌病半套式PCR检测方法的建立

目的 建立布鲁菌属半套式PCR检测方法。方法根据布鲁菌BCSP-31蛋白基因设计三条引物，扩增目的片段长223bP，通过条件优化，建立了布鲁菌属半套式PCR检测方法。利用所建立的PCR方法对六个种布鲁菌和Y．CenterO：9，S．TyPhi，E．Coli O：157进行检测验证其特异性，通过对活菌计数检测验证其敏感性。结果检测结果表明六个种布鲁菌均可扩出223bP的目的片段，而Y．Center O：9，S．TyPhi和E．Coli O：157不能扩出目的片段。通过对活菌计数最低可检测到20个细菌。结论本研究建立了敏感、特异的布鲁菌病半套式PCR快速检测方法，为布鲁菌的检测和试剂盒的研制奠定了基础。     

全基因组测序用于宁夏羊种3型布鲁氏菌毒力基因筛选的研究

目的 从3株布鲁氏菌分离株的全基因组序列中筛选出可能导致脑损害的关键毒力基因,为后续筛选布鲁氏菌致脑损害毒力基因的研究奠定基础.方法 通过BCSP31PCR、传统生化实验对3株分离于布鲁氏菌病患者外周血中的布鲁氏菌进行鉴定分型.利用Illumina Hiseq2000平台对3株布鲁氏菌进行全基因组测序与比较基因组学分析,根据文献报道分析筛选出布鲁氏菌的经典毒力基因,通过检索NCBI核酸数据库查找出所选毒力基因的参考序列,利用所选参考序列分别与3株布鲁氏菌全基因组序列做BLAT比对分析.结果 3株布鲁氏菌经BCSP31PCR、传统生化实验鉴定为羊种3型;比较基因组分析显示3株布鲁氏菌与标准株参考序列的同源性比例均达到99.02％.BLAT比对分析发现所选毒力基因wbkA、pgm、hemolysin、hemolysin Ⅲ和Omp25在这3株布鲁氏菌全基因组序列中的比对分数均达到99％以上.结论 本研究所选取的3株羊种3型布鲁氏菌的全基因组中存在经典的毒力基因序列.     

阳性血培养中的布鲁菌的快速分子鉴定

目的 建立一种快速、简便、准确的方法,直接检测阳性血培养液中的布鲁氏菌,用于布鲁菌病的早期诊断。 方法 将疑似布鲁菌病患者的阳性血培养液在生物安全柜内涂片,并转种至血培养皿及巧克力平皿进行培养。应用特异性的布鲁菌探针Bru-996,采用荧光原位杂交法检测涂片上的细菌;分别采用Vitek2自动细菌鉴定仪和16SrRNA基因测序法鉴定经培养的细菌。将荧光原位杂交法检测结果与Vitek2自动细菌鉴定仪和16SrRNA基因测序法检测结果进行比较。 结果 35份阳性血培养液经检测,荧光原位杂交法检出布鲁菌34株,非布鲁菌1株;基因测序法检出马耳他布鲁菌34株,洋葱伯克霍尔德菌1株;Vitek2鉴定法分别检出马耳他布鲁菌28株、洋葱伯克霍尔德菌1株、吉拉尔玫瑰单胞菌5株,支气管鲍特菌1株。荧光原位杂交法与基因测序法检出结果一致,6株布鲁菌经Vitek 2鉴定错误。 结论 荧光原位杂交法可直接快速简便准确地检测阳性血培养液中的布鲁菌。     

泉州市6例布鲁菌病的微生物生化鉴定及分子生物学确认

目的 验证布鲁菌的微生物鉴定和PCR检测结果的一致性. 方法 利用全自动细菌鉴定仪对血（骨髓）培养阳性的标本进行微生物鉴定,提取细菌DNA,应用布鲁菌通用引物BCSP31进行PCR扩增,产物进行测序. 结果 6例培养阳性的病原菌经鉴定为布鲁菌.经荧光PCR检测、测序结果在线blast分析确认为布鲁菌. 结论 细菌的分离培养结合PCR方法可以提高布鲁菌的检测.     

固有免疫应答在抗布鲁菌感染过程中的作用

布鲁菌是革兰氏阴性兼性胞内寄生菌,包括牛布鲁菌、羊布鲁菌、猪布鲁菌、犬布鲁菌和海洋哺乳动物感染的布鲁菌等,其中羊布鲁菌、牛布鲁菌、猪布鲁菌和犬布鲁菌等可以通过多种途径侵入人和动物体内,其引起的布鲁菌病是一种严重的人畜共患病。固有免疫系统是机体抵抗病原体感染的第一道防线,因此在布鲁菌感染过程中发挥重要作用。 现综述布鲁菌感染过程中宿主固有免疫应答发挥的作用。