庆大霉素对小鼠螺旋神经节神经元电生理特性的影响

目的 探讨庆大霉素对小鼠耳蜗螺旋神经节神经元细胞电生理特性的影响及其意义。方法 应用全细胞电压钳技术研究庆大霉素对急性酶分离小鼠螺旋神经节神经元细胞膜上的钾、钠离子通道电流的峰值的影响．与细胞外液中庆大霉素浓度的关系，以及庆大霉素洗脱后电流的恢复情况。结果 庆大霉素能抑制电压依赖性钾通道，但不能抑制电压依赖性钠通道，其钾通道抑制作用与细胞外液中庆大霉素的浓度呈剂量依赖性，庆大霉素洗脱后电流恢复不完全。结论 庆大霉素通过抑制螺旋神经节神经元细胞的钾离子通道而产生耳毒性。     

利用膜片钳技术对急性分离小鼠螺旋神经节神经元的电生理研究

目的 探讨小鼠螺旋神经节神经元(spiral ganglion neurons，SGN)的电生理特性。方法 应用全细胞电压钳技术对急性酶分离的小鼠耳蜗SGN细胞膜上的离子通道电流进行记录和分析。结果 在SGN细胞膜上记录到对氯化四乙胺、4-氨基吡啶敏感的外向延迟整流钾电流和瞬时钾电流，以及对河豚毒素敏感的内向钠电流。并且离子通道活动具有明显的电压依赖性，在没有记录到钠电流的细胞记录到延迟整流钾电流。结论 急性酶分离的小鼠耳蜗SGN细胞的电生理特性可为听觉传导机制的研究提供了重要的参考，并指导下一步通道药理学的研究。     

顺铂对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞延迟整流钾电流的影响

目的探讨耳毒性药物顺铂对耳蜗螺旋神经节细胞延迟整流钾电流的影响,了解顺铂耳毒性的离子机制。方法选择状态良好培养2—14d的耳蜗螺旋神经节细胞在电压钳制条件下记录的钾电流作为对照组,浴液中分别加入100,500,1000,5000μM不同浓度的顺铂溶液后记录的电流为实验组,观察其对钾通道电流电生理学特性的影响,并观察冲洗后电流的恢复情况。结果实验显示耳蜗螺旋神经节细胞钾通道电流的电生理学特性受不同浓度顺铂溶液的影响,并具有浓度依赖性,表现在其活化动力学和电流幅度的改变。本实验中顺铂的50％的电流被抑制时的浓度（IC50）为294μM,冲洗后钾通道电流逐渐恢复。结论顺铂可以改变耳蜗螺旋神经节细胞钾通道电流的电生理学特性,这种变化在短期内可逆,揭示其耳毒性的形成具有一定的离子机制。     

小鼠螺旋神经节神经元髓鞘的发育

目的研究小鼠螺旋神经节神经元髓鞘的发育,探讨螺旋神经节神经元的发育成熟过程。方法应用透射电镜观察３２只１～６０天龄小鼠螺旋神经节神经元髓鞘的发育。结果新生小鼠螺旋神经节神经元为形态相同的幼稚细胞,由卫星细胞及其伸出的单层突起包绕,无致密髓鞘形成;出生后７天,Ｉ型神经元出现,Ｉ型神经元局部致密髓鞘开始形成;出生后１０～１４天,Ｉ型神经元多层致密髓鞘出现;出生后３０天,可见一种细胞形态和Ｉ型神经元相似而有明显致密髓鞘的神经元;出生后６０天,螺旋神经节神经元髓鞘基本发育成熟。螺旋神经节神经元的发育成熟由底回向顶回逐步发展。结论出生后７～１４天是螺旋神经节神经元发育和成熟的重要阶段。     

对灰鼠延迟性神经元死亡模型中螺旋神经节细胞缺损的评估

目的探索观察耳蜗螺旋神经节细胞的简便定量研究方法 ,并在灰鼠延迟性螺旋神经节细胞死亡动物模型中验证本方法的实用性和可靠性。方法 15只成年灰鼠平均分为3组,第1组用于正常对照;第2组一次性同时肌肉注射庆大霉素（125mg/kg）和静脉注射利尿酸钠（40mg/kg）,并在用药后2个月处死;第3组接受与第2组同样的药物注射,但在用药后4个月处死。耳蜗样品被常规应用环氧树脂包埋并制作成耳蜗中轴半薄切片,计数耳蜗各回蜗轴螺旋管腔切片截面内的螺旋神经节数量并进行统计分析。结果灰鼠耳蜗底回起始端的蜗轴螺旋管腔比耳蜗底回中部和耳蜗中回大,因此耳蜗底回起始端蜗轴螺旋管内的螺旋神经节细胞数量多于耳蜗底回中部和耳蜗中回。耳蜗毛细胞被彻底破坏后2个月,与正常灰鼠耳蜗各回蜗轴螺旋管腔切片截面内的螺旋神经节细胞数量相比,耳蜗底回蜗轴螺旋管切片截面内的螺旋神经节细胞减少数量比耳蜗中回严重,提示延迟性螺旋神经节细胞死亡可能遵循着从耳蜗底回向顶回扩展的规律。耳蜗毛细胞被彻底破坏后4个月,全耳蜗蜗轴螺旋管内的螺旋神经节细胞基本上丧失殆尽。结论计数耳蜗中轴切片各回蜗轴螺旋管腔切片截面内的螺旋神经节细胞数量是一种简便可靠的定量分析方法 。     

顺铂对大鼠耳蜗螺旋神经节细胞外向延迟整流钾电流的影响

目的:观察记录顺铂作用下急性分离新生大鼠耳蜗螺旋神经节细胞(SGNs)延迟整流钾通道的电流曲线,分析顺铂对SGNs钾电流激活动力学的影响,并初步探讨其耳毒性机制。方法:采用全细胞膜片钳技术记录SGNs外向延迟整流钾电流及顺铂对此电流的影响。结果:钳制电压为-60mV,刺激电压从-60mV到 80mV逐渐去极化,阶跃电压为10mV,持续时间为500ms,可在SGNs上记录到外向钾电流,该电流对TEA-Cl(4-乙基胺)敏感,具有延迟整流特性;在细胞外液中加入10μmol/L顺铂,能明显抑制SGNs延迟整流钾电流;顺铂对此电流的抑制作用与细胞外液中顺铂的浓度呈剂量依赖性;外液洗脱后SGNs电流可基本恢复正常。结论:钾通道与SGNs动作电位的产生密切相关,顺铂可抑制SGNs钾通道电流,导致听觉功能障碍。     

利用膜片钳技术对急性分离小鼠螺旋神经节神经元的电生理研究

目的 探讨小鼠螺旋神经节神经元(spiral ganglion neurons SGN)的电生理特性。方法 应用全细胞电压钳技术对急性酶分离的小鼠耳蜗SGN细胞膜上的离子通道电流进行记录和分析。结果 在SGN细胞膜上记录到对氯化四乙胺、4-氨基吡啶敏感的外向延迟整流钾电流和瞬时钾电流,以及对河豚毒素敏感的内向钠电流。并且离子通道活动具有明显的电压依赖性,在没有记录到钠电流的细胞记录到延迟整流钾电流。结论 急性酶分离的小鼠耳蜗SGN细胞的电生理特性可为听觉传导机制的研究提供了重要的参考,并指导下一步通道药理学的研究。     

电刺激螺旋神经节细胞的形态学研究

为定量确定刺激螺旋神经节神经元的电流强度的安全范围，利用图象分析仪测量不同电流强度刺激下兔螺旋神经节经（ＳＧＮ）面积、周长、直径和体积的变化，发现ＳＧＮ形态各主要参数对０．４～１．２ｍＡ电流有显著改变，对０．１ｍＡ电流的变化则不显著，与正常组和对照组（药毒致聋组）比较无显著性差异。     

不同培养方法对螺旋神经元体外生长的影响

目的 观察不同培养条件下螺旋神经元体外生长情况,获得高纯度螺旋神经元培养物.方法 利用酶消化法、剪切分离结合酶消化法对出生后3～5天的大鼠螺旋神经节进行分离,分别在血清培养基和神经元专用培养基内培养,观察神经元形态及生长情况,并进行免疫组化鉴定.结果 神经元专用培养基比含血清培养基能够得到纯度更高的神经元,且细胞形态良好,轴突再生能力强.结论 酶消化结合剪切分离螺旋神经节,经神经元专用培养基培养,能获得高纯度的螺旋神经元.     

大鼠出生后发育中螺旋神经节神经元凋亡的观察

目的：研究大鼠出生后发育时螺旋神经节（spiral ganglion,SG）神经元凋亡和分化的关系。方法：应用透射电镜观察1、3、5、7、10、14和30天龄大鼠螺旋神经节神经元超微结构的变化及细胞凋亡现象。结果：大鼠出生后5和7天，在透射电镜下观察到SG神经元凋亡，其典型的超微结构改变为染色质凝聚和着边形成的新月样结构、凋亡小体和细胞皱缩；随后的发育阶段细胞凋亡现象消失；最早可识别的富含神经丝的Ⅱ型神经元（neuron2,N2）出现在出生后7天，新出现的N2有明显的细胞皱缩现象；在随后发育的各阶段，SG中I型神经元（neuron1,N1）和N2的结构特征更明显，逐渐发育成熟。结论：神经元凋亡是大鼠螺旋神经节出现后发育过程中的一个重要事件，发生在N2分化过程中，可能与SG中N2发育有关。     

水杨酸钠可逆性抑制耳蜗螺旋神经节神经元GABAa受体电流

目的探讨水杨酸钠对大鼠耳蜗螺旋神经节神经元(SGN)GABAa受体的作用。方法采用全细胞膜片钳记录技术,观察离体培养大鼠SGN的GABAa受体激活电流的特性及水杨酸钠对其作用特点。结果在SGN上可记录到GABAa受体激动剂GABA诱发的内向电流,该电流呈浓度依赖性且可被荷包牡丹碱所阻断;水杨酸钠作用在SGN上未诱出电流,100μM、500μM的GABA与不同浓度的水杨酸钠(500μM、1000μM、5000μM)分别联合作用时,GABA诱发的电流可被不同程度地抑制,且该抑制作用呈可逆性。结论大鼠SGN上可记录到GABAa受体电流,且水杨酸钠以浓度依赖的方式可逆性抑制GABAa受体电流,抑制作用与GABA浓度有关。     

氨基糖苷类抗生素对耳蜗螺旋神经节的损害作用

氨基糖苷类药物(Am An)是一类经典的治疗革兰阴性菌感染的抗生素,但具有耳毒性和肾毒性。以往的研究认为Am An的耳毒性仅仅针对内耳毛细胞并可引起继发的延迟性螺旋神经节细胞(SGNs)死亡。但是随着关于Am An耳毒性和对耳蜗其他细胞的研究进展,人们逐渐意识到耳蜗内支持细胞的损害也是引起SGNs延迟死亡的重要原因之一。我们发现,不同的Am An对内耳的损害方式不同,以硫酸链霉素为代表的少数Am An可以不受血-迷路屏障阻碍直接进入内耳并首先损害内耳的周边神经元;而以往认为只能间接损害SGNs的其他那些难以跨越血-迷路屏障的Am An,比如卡那霉素,对出生后三天大鼠处于发育阶段的SGNs也具有直接的损害作用。因此我们提出一个根据不同内耳损害方式来区分Am An的分类建议,并希望本文介绍的新内容能够为更深入理解不同种类Am An的不同耳毒性机制以及听觉系统各个重要组织成分之间的相互作用关系提供新的参考信息。     

MK-801拮抗水杨酸钠致螺旋神经节细胞损伤的实验研究

目的探讨非特异性阻断NMDA受体拮抗水杨酸钠对离体培养螺旋神经节细胞兴奋性损伤的作用。方法将培养的耳蜗螺旋神经节细胞随机分为3组,分别为正常对照组:培养液中仅加入1mM谷氨酸;水杨酸钠组:1mM谷氨酸+5mM水杨酸钠;MK-801组:50μM MK-801+1mM谷氨酸+5mM水杨酸钠。培养24h后加药物干预3h,收集细胞采用实时荧光定量PCR及免疫荧光技术检测BDNF exonⅣ,BDNF exonⅥ转录及Caspase-3mRNA转录和蛋白表达的改变,研究应用MK-801非特异性阻断NMDA受体拮抗水杨酸钠对离体培养螺旋神经节细胞兴奋性损伤的作用。结果水杨酸钠组较谷氨酸组及MK-801组螺旋神经节细胞中BDNF exonⅣ,BDNF exonⅥ和Caspase-3 mRNA的转录及Cas-pase-3蛋白的表达水平显著增高(P值均<0.05);BDNF exonⅣ的转录在MK-801组较谷氨酸组明显降低(P<0.05);BDNF exonⅥ的转录在MK-801组较谷氨酸组未发生具有统计学意义的改变;Caspase-3的转录及蛋白的表达在MK-801组较谷氨酸组显著提高(P<0.05)。结论非特异性阻断NMDA受体能拮抗水杨酸钠引起的离体培养螺旋神经节细胞中BDNFexonⅣ,BDNFexonⅥ及Caspase-3上调。     

I h and HCN Channels in Murine Spiral Ganglion Neurons: Tonotopic Variation,Local Heterogeneity,and Kinetic Model

One of the major contributors to the response profile of neurons in the auditory pathways is the I _h current. Its properties such as magnitude, activation, and kinetics not only vary among different types of neurons (Banks et al., J Neurophysiol 70:1420–1432, 1993; Fu et al., J Neurophysiol 78:2235–2245, 1997; Bal and Oertel, J Neurophysiol 84:806–817, 2000; Cao and Oertel, J Neurophysiol 94:821–832, 2005; Rodrigues and Oertel, J Neurophysiol 95:76–87, 2006; Yi et al., J Neurophysiol 103:2532–2543, 2010), but they also display notable diversity in a single population of spiral ganglion neurons (Mo and Davis, J Neurophysiol 78:3019–3027, 1997), the first neural element in the auditory periphery. In this study, we found from somatic recordings that part of the heterogeneity can be attributed to variation along the tonotopic axis because I _h in the apical neurons have more positive half-activation voltage levels than basal neurons. Even within a single cochlear region, however, I _h current properties are not uniform. To account for this heterogeneity, we provide immunocytochemical evidence for variance in the intracellular density of the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel α-subunit 1 (HCN1), which mediates I _h current. We also observed different combinations of HCN1 and HCN4 α-subunits from cell to cell. Lastly, based on the physiological data, we performed kinetic analysis for the I _h current and generated a mathematical model to better understand varied I _h on spiral ganglion function. Regardless of whether I _h currents are recorded at the nerve terminals (Yi et al., J Neurophysiol 103:2532-2543, 2010) or at the somata of spiral ganglion neurons, they have comparable mean half-activation voltage and induce similar resting membrane potential changes, and thus our model may also provide insights into the impact of I _h on synaptic physiology.     

EGCG对阿米卡星诱导的大鼠螺旋神经元凋亡的保护作用

目的 研究硫酸阿米卡星(Amikacin sulfate)诱导SD大鼠螺旋神经元(spiral ganglion neurons,SGNs)损伤的机制及表没食子儿茶素表没食子酸酯(-)-epigallocatechin-3-gallate,EGCG]对硫酸阿米卡星耳毒性的保护作用.方法 60只SD大鼠(雌雄各半)随机均分为三组,对照组(NS组)每日皮下注射生理盐水4.5ml/kg,中毒组(A组)每日皮下注射Arnikacin 450 mg/kg,保护组(AE组)每日皮下注射Amikacin 450 mg/kg,同时腹腔注射EGCG 50 mg/kg,以上三组均连续用药14天.每组用药前和用药后第7、14、21、35天随机抽取4只行ABR检测和组织学观察,比较三组间ABR的波潜伏期(peak latency,PL)和波间期(interpeak latency,IPL)、HE染色切片中的螺旋神经元(spiral ganglion neurons,SGNs)计数、TUNEL染色切片后的SGNs凋亡阳性细胞数.结果 ①用药前三组间ABR的PL和IPL无显著性差异,中毒组使用阿米卡星后第14和21天ABR的波潜伏期和波间期较保护组及对照组明显延长(P＜0.05);②使用阿米卡星后,SGNs细胞数随时间的延长逐渐减少,保护组和中毒组有显著差异(P＜0.05);而TUNEL检测片中,中毒组和保护组SGNs的凋亡阳性细胞数均随时间的延长而增多,中毒组明显多于EGCG保护组(P＜0.05).结论 ①阿米卡星能诱导大鼠耳蜗螺旋神经元的凋亡;②EGCG能减低阿米卡星诱导的大鼠耳蜗螺旋神经元的凋亡,对听功能、耳蜗螺旋神经元有很好的保护作用.     

螺旋神经节外周投射发育的体外观察

目的体外观察螺旋神经节外周投射发育情况,为建立螺旋神经节体外支配模型提供实验基础。方法采用18只胚胎第16天小鼠Corti器(36只Corti器,分为三组,每组12只,分别体外培养2、3、4天)及4只出生当天小鼠的8只Corti器,全基底膜组织固定后,行免疫组织化学染色铺片,共聚焦显微镜下观察体外螺旋神经节外周投射发育过程,并比较其与在体发育的异同。结果胚胎16天小鼠Corti器体外培养2天后(相当于在体胚胎18天),I型和II型螺旋神经节细胞树突向外周放射性生长并同时投射至内毛细胞和外毛细胞;培养3天后(相当于在体出生当天),两型螺旋神经节细胞树突向外继续生长,聚集形成放射性纤维束,其中,纤维在内毛细胞底部形成内螺旋丛,外毛细胞区纤维沿外毛细胞分布生长并向蜗轴底回延伸;培养4天后(相当于在体出生1～2天),螺旋神经节外周纤维进一步退缩、纯化,形成明显的内螺旋束和相对不规则的外螺旋束。结论体外培养的小鼠胚胎期Corti器尽管没有传出纤维的支配,仍保持了与在体相同的外周靶支配模式,证明体外培养的螺旋神经节支配模型可以作为研究两型神经节树突发育的替代模型。     

特异性损伤内耳螺旋神经元小鼠模型的建立

目的：建立小鼠内耳螺旋神经元损伤的耳聋模型,为研究干细胞移植治疗感音神经性聋奠定基础。方法成年雌性SPF级CBA／J小鼠60只,随机分为实验组和生理盐水组,每组30只,实验组动物经圆窗渗透给予10μl哇巴因（ouabain）,生理盐水组同法给予等量生理盐水。每组于给药前及给药后7、14及30天分别检测小鼠听性脑干反应（ABR）和畸变产物耳声发射（DPOAE）,并用免疫组织荧光技术和基底膜铺片技术分别观察耳蜗螺旋神经元（spiral ganglion neurons ,SGNs）细胞及内耳毛细胞（hair cells ,HCs）的变化。结果①与生理盐水组比较,实验组给药后各时间点 ABR反应阈均明显升高,波Ⅰ潜伏期延长,振幅明显降低,差异有统计学意义（ P＜0．05）。②实验组及生理盐水组小鼠DPOAE均可正常引出。③与生理盐水组相比,实验组耳蜗各回螺旋神经元的数量及密度显著降低,差异有统计学意义（P＜0．05）。④实验组在给药后不同时间点,耳蜗各回内、外毛细胞均排列整齐、形态完整、未见明显损伤或丢失。结论哇巴因经圆窗渗透给药可特异性损伤CBA／J小鼠内耳螺旋神经元及其功能,而不损伤内、外毛细胞,是一种理想的研究干细胞移植治疗感音神经性聋的动物模型。