多重引物聚合酶链反应扩增丙型肝炎病毒基因及基 …

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术对丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的５’－非编码区（５’－ＮＣＲ）、Ｃ及ＮＳ４基因区的３对引物分别及同时扩增，检测８０例抗－ＨＣＶ阳性患者的血清ＨＣＶ ＲＮＡ，并进行了ＨＣＶ基因分型研究。各不同引物所介导的ＰＣＲ检出ＨＣＶ ＲＮＡ的结果为：５’－ＮＣＲ基因区６０％（４８／８０），Ｃ基因区３７％（３０／８０），ＮＳ４基因区３０％（２４／８０）。以上３对引物同时扩增仅４２％（３４／     

多聚酶链反应和寡核苷酸探针检测衣原体

本研究所用引物和探针序列选自衣原体１６Ｓ ｒＲＮＡ基因。以生物素末端标记制备探针。多聚酶链反应（ＰＣＲ）扩增物作琼脂糖凝胶电泳和ＤＮＡ斑点杂交，证实引物为衣原体属特异性。ＰＣＲ检测灵敏度达到相当于１个拷贝的衣原体ＤＮＡ分子。生物素化寡核苷酸探针ＤＮＡ斑点杂交的直接检测灵敏度为１００ｐｇ，结合ＰＣＲ扩增的检测灵敏度为１ｆｇ。本法高度敏感、特异，且方法简便，对于衣原体感染诊断和分子流行病学调查具有较好     

半巢式聚合酶链反应检测柯萨奇B组病毒方法的建…

为确定聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术在柯萨奇Ｂ组病毒（ＣＢＶ）ＲＮＡ检测及临床常规诊断中的应用价值，从ＣＢＶ基因组５’非编码区（５’－ＮＣＲ）选择了ＣＢＶ间高度保守的三个寡核苷酸片段作为引物，建立了ＣＢＶ半巢式ＰＣＲ检测方法，该方法对ＣＢＶ最低检出量为０．１ＴＣＩＤ５０，且对其他常见的相关病毒无扩增反应，在确定特异性和敏感性的基础上，对临床诊断或疑为病毒性心肌炎等疾病的患者进行了检测，１１１例心肌炎患     

多聚酶链反应技术在NHL基因诊断中的应用研究

收集非何杰金淋巴瘤（ＮＨＬ）标本５９例。用全Ｔ（ＵＣＨＬ一１）与全Ｂ（Ｌ２６）ＭｃＡｂ作免疫组化分型。然后应用ｌｇＨ单轮和半重叠基因引物，Ｔ细胞受体β（ＴＣＲ＿β）基因引物进行多聚酶链反应（ＰＣＲ）扩增检测克隆性基因重排。检测阳性结果：新鲜组织ｌｇＨ７１．４％（１０．／１４），ＴＣＲ＿β８３．３％（１０／１２）。石蜡包埋组织ＩｇＨ（半重叠扩增）８０％（１２／１５），ＴＣＲ＿β７３．３％（１１／１５）。无假阳性。其中有６例有争议的疑难病例明确了诊断。结果表明ＰＣＲ技术是当前最特异、敏感而快速的ＮＨＬ克隆性基因重排检测方法。     

霍奇金病单个H／R—S细胞TCR—γ基因重排的研究

目的 从单个细胞水平检测Ｈ／Ｒ－Ｓ细胞是否存在Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）－γ链基因重排,以研究其是否来源于分化早期的Ｔ淋巴细胞。方法 用显微操作仪从冷冻的新鲜活检组织切片中挑取ＣＤ３０阳性的Ｈ／Ｒ－Ｓ细胞,提取其ＤＮＡ并行聚合酶链反应（ＰＣＲ）。ＴＣＲ－γ基因重排的ＰＣＲ采用半巢式扩增法,首轮用与ＴＣＲ－γ基因Ｖγ和Ｊγ区（包括Ｎ区）互补的引物对加入β－珠蛋白引物行混合扩增,对其中β－珠蛋白扩增阳性的Ｐ     

用简并寡核苷酸引物构建人类染色体区带特异性探针池的技术

目的建立快速有效构建人类染色体区带特异性探针池及其文库的技术。方法显微切割人类染色体３ｐ２３－ｐ２６，３ｑ２１－ｑ２２，４ｐ１２－ｐ１６区带，用简并寡核苷酸引物－ＰＣＲ（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｅｄｐｒｉｍｅｒｅｄ－ＰＣＲ，ＤＯＰ－ＰＣＲ）扩增，并用荧光原位杂交（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＦＩＳＨ）检测扩增产物来源，再将区带特异性扩增产物克隆于ｐＵＣ１９载体构建区带特异性文库，以及用α－３２ＰＡＴＰ标记的ｇＤＮＡ行菌落原位杂交。结果经ＦＩＳＨ证实，３ｐ２３－ｐ２６，３ｑ２１－ｑ２２，４ｐ１２－ｐ１６探针池均在切割相应区带出现特异性信号。其中３ｑ２１－ｑ２２获得的１．２×１０４个阳性克隆。随机分析３０个含插入片段的白色菌落，其插入片段平均约４２０ｂｐ。２２０个白色克隆菌落原位杂交示单拷贝和低度重复序列占８１％（１７８／２２０）。结论改进的显微切割结合ＤＯＰ－ＰＣＲ为人类染色体探针池及文库构建建立了一个简易、高效的方法，这将有助于基因克隆和人类基因的全序列分析。     

利用多组套式引物检测庚型肝炎病毒RNA

利用庚型肝炎病毒（ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ）ＮＳ３～５区序列合成了四组套式引物，建立了灵敏、特异的庚型肝炎病毒ＲＮＡ双扩增聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测方法。用此方法检测了１０份庚型肝炎病毒抗体阳性患者血清及１０份阴性的健康人血清。前者不同组引物的检出率为ＮＳ３（１）引物９份阳性，ＮＳ３（２）引物８份阳性，ＮＳ４引物４份阳性，ＮＳ５（１）引物５份阳性，ＮＳ５（２）引物９份阳性；后者各组引物检测均为阴性。结果表明，庚型肝炎病毒不同区域引物用于ＲＴ－ＰＣＲ检出率差异较大。ＮＳ３（１）及ＮＳ５（２）这两组引物检出率最高，更适合用于ＲＴ－ＰＣＲ检测庚型肝炎病毒ＲＮＡ。     

中国株白喉杆菌毒素全基因编码序列的克隆

本实验从我国自己分离的白喉杆菌噬菌体中成功地克隆了白喉毒素的全基因。此基因克隆是以自己设计合成的寡核苷酸为引物，以Ｂ棒状噬菌体ＤＮＡ为模板，用热启动聚合酶链反应（ＰＣＲ）一次扩增出全基因编码序列。该基因全长共１６０５个碱基对。将ＰＣＲ产物直接克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ／载体系统，经有关限制性内切酶消化，核苷酸序列分析并与已知序列比较，结果表明，所获白喉毒素基因的序列与已知序列基本一致，仅有个别碱基位点的差异。该研究为在我国开展白喉毒纱基因工程疫苗及其相关的融合蛋白的研究奠定了必备的基础。     

B型肉毒神经毒素基因的PCR检测

本研究用一对Ｂ型肉毒神经毒素基因特异的寡核苷酸引物，扩增Ｂ型基因轻链区域一段２５３ｂｐ的ＤＮＡ片段，对２２株Ｂ型肉毒梭菌进行了鉴定，所试２２株Ｂ型肉毒梭菌其ＰＣＲ均为阳性。用Ｂ型肉毒梭菌ＣＭＣＣ（Ｂ）６４３５２对ＰＣＲ的检测灵敏度进行检查，可从６０个细菌中得到明显的扩增产物。用其它各型肉毒梭菌及其它梭状芽胞杆菌共５３株对ＰＣＲ的特异性进行了检测，除一株Ａ型肉毒梭菌（ＬＣＬ００１）ＰＣＲ为阳性外，其余菌株均为阴性。ＬＣＬ００１的扩增产物其分子量以及限制性内切酶消化产物和Ｂ型肉毒梭菌的扩增产物完全一致，认为该株菌中带有不表达的Ｂ型肉毒神经毒素基因，应为Ａ（Ｂ）型。由此可见，该ＰＣＲ扩增系统不仅具有灵敏度高，特异性强等特点，而且可检测出不表达的Ｂ型肉毒神经毒素基因，用于肉毒梭菌的鉴定具有其它方法不可比拟的优点。     

半巢式聚合酶链反应检测柯萨奇B组病毒方法的建立及其在病毒性心肌炎诊断中的应用

为确定聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术在柯萨奇Ｂ组病毒（ＣＢＶ）ＲＮＡ检测及临床常规诊断中的应用价值，从ＣＢＶ基因组５’非编码区（５’－ＮＣＲ）选择了ＣＢＶ间高度保守的三个寡核苷酸片段作为引物，建立了ＣＢＶ半巢式ＰＣＲ的检测方法。该方法对ＣＢＶ最低检出量为０．１ＴＣＩＤ５０，且对其他常见的相关病毒无扩增反应。在确定特异性和敏感性的基础上，对临床诊断或疑为病毒性心肌炎等疾病的患者进行了检测，１１１例心肌炎患者血清标本中有６２例为ＰＣＲ阳性。与ＥＬＩＳＡ检测结果相比，两种方法的阳性率分别为５６％和４５％，符合率为７７％。     

聚合酶链反应技术结合酶切杂交研究单项抗乙型肝炎病毒核心抗原阳性者的乙型肝炎病毒感染

以聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增单项抗乙型肝炎病毒核心抗原（ＨＢｃ）阳性血清的乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ。内外两对引物均选自ａｄｒ、ａｄｗ和ａｙｗ３种亚型ＨＢＶ基因组Ｃ基因区的共有序列，扩增产物分别长４２８ｂＰ和６６４ｂＰ，共含一个ＢｇｌⅡ酶切点，酶切后前者产生２９９ｂＰ和１２５ｂＰ、后者产生４０６ｂｐ和２５４ｂｐ各一个限制性片段。以另一条基因位置处于内引物对之间的寡核苷酸制备３２Ｐ－５＇末端标记的探针对之进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转移杂交，鉴定了扩增产物的特异性。结果从单项抗ＨＢｃ阳性的８／４２例慢性肝炎和２／１２倒无症状受测者血清中检出ＨＢＶＤＮＡ，提示现症低水平病毒复制和潜在的传染性。     

简并引物在扩增GBV-C/HGV NS3高度变异区的应用

目的试图比较简并引物扩增ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶＮＳ３变异较大的区域的作用。方法设计了简并引物和减温（ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ）ＰＣＲ扩增程序以对目的基因进行扩增，并对阳性ＰＣＲ产物进行克隆及测序。结果该方法能够检测基因变异约达２１％的区域。结论提示该法是一项有效的了解基因家系的技术。     

抗HSV糖蛋白单克隆抗体可变区基因的克隆和序列测定

选用具有动物体内高保护作用的抗ＨＳＶ－１／ＨＳＶ－２型共同性糖蛋白Ｃ（ｇＣ）单克隆抗体１Ａ１２，从其杂交瘤细胞中提取总ＲＮＡ，以Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５为引物反转录合成ｃＤＮＡ，用一对鼠抗体通用ＶＨ引物和一对Ｖ引物进行ＰＣＲ，扩增出１Ａ１２ＶＨ和１Ａ１２ＶＬ基因，并分别克隆入ｐＵＣ１８质粒中，序列分析结果表明，１Ａ１２ＶＨ基因由３３６ｂｐ组成，编码１１２个氨基酸，隶属于小鼠重链第３组亚组（Ｄ）；１Ａ     

应用PCR—SSCP方法区分HLA DNA纯合基因型与杂合空…

在ＰＣＲ／ＳＳＯ分型的基础上，用一对ＰＣＲ引物扩增ＤＰＢ１基因后作ＳＳＣＰ分析，发现该方法能够确定那些用ＰＣＲ／ＳＳＯ方法只检出一个等位基因的样本为纯合基因或是含一个空白基因的杂合子，９个月用ＰＣＲ／ＳＳＯ方法只检出一个ＤＰＢ１等位基因的湖南汉族人样本中，用ＰＣＲ／ＳＳＣＰ方法发现１个样本表现为杂合子。     

聚合酶链反应技术结合酶切杂交研究单项抗乙型肝炎…

以聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增单项抗乙型肝炎病毒核心抗原阳性血清的乙型肝炎病毒ＤＮＡ。内外两对引物均选自ａｄｒ、ａｄｗ和ａｙｗ３种亚型ＨＢＶ基因组Ｃ基因区的共有序列，扩增产物分别长４２８ｂｐ和６６４ｂ０ｐ，共含一个Ｂｇ１Ⅱ酶切点，酶切后前者产生２９９ｂｐ和１２５ｂｐ、后者产生４０６ｂｐ和２５４ｂｐ各一个限制性片段。以另一条基因位置处于内引物对之间的寡核苷酸制备３２ｐ－５’末端标记的探针对之进行Ｓｏｕ     

大鼠组织中三磷酸肌醇受体亚型基因的表达

目的观察大鼠心肌、小脑和培养的主动脉血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）中三磷酸肌醇受体（ＩＰ２Ｒ）亚型的基因表达。方法用异硫氰酸胍－酸酚氯仿一步法抽提组织总ＲＮＡ,用特异性引物进行逆转／聚合酶链式反应（ＲＴ—ＰＣＲ）,β－ａｃｔｉｎ为内标半定量检测ＩＰ３Ｒ亚型ｍＲＮＡ的表达。将Ⅱ型ＰＣＲ产物重组、克隆并测序。结果发现ＩＰ３Ｒ三个亚型在心肌、小脑和ＶＳＭＣ中均有表达,小脑组织中表达水平较高。ＰＣＲ扩增片段分别为：Ｉ型ＩＰ３Ｒ,５２５ｂｐ（小脑）或４０５ｂｐ（心肌ＶＳＭＣ）;Ⅱ型ＩＰ３Ｒ,４０５ｂｐ;Ⅲ型ＩＰ３Ｒ,１６９ｂｐ。结论序列分析发现克隆的Ⅱ型ＩＰ３Ｒ ｃＤＮＡ序列与设计的目的 ｃＤＮＡ一致,证实了本文 ＲＴ－ＰＣＲ的特异性和准确性,提示本文所建立的ＲＴ－ＰＣＲ方法能可靠地研究动物组织中ＩＰ３Ｒ不同亚型的基因表达。     

巨细胞病毒mRNA表达与活动性感染关系的研究

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）ＤＮＡ在９０年代初已广泛应用，但其亚临床型或潜伏感染均呈阳性反应。本文用两对引物对ＨＣＭＶｍＲＮＡ进行即刻早期（ＩＥ）、晚期（Ｌ）基因反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增，首次在国内从临床标本中检测出...     

我国彝族另一新的DR15(2)等位基因的核苷酸序列分析

目的对在用ＰＣＲ／ＳＳＯ方法作我国彝族群体样本ＨＬＡＤ区寡核苷酸分型中发现的１例ＤＲＢ１的杂合子进行等位基因序列分析。方法用ＤＲＢ基因类引物扩增该特殊的ＤＲＢ１杂合子细胞基因组的ＤＲＢ基因的第二外显子。扩增产物经纯化转染大肠杆菌ＪＭ１０１,克隆后再经酚／氯仿抽提后得到单链Ｍ１３ＤＮＡ。利用ＡＢＩ３７７测序仪自动测序。结果彝族这一特殊的ＤＲＢ１杂合子细胞的ＤＲＢ１基因阳性克隆,经序列分析证实了该ＤＲＢ１杂合子中一个等位基因确为ＤＲＢ１＊１２０２,与ＰＣＲ／ＳＳＯ分型一致;另一个新等位基因ＤＲＢ１＊１５Ｙ２（暂定）等位基因在第二外显子的４７位由编码苯丙氨酸的ＴＴＣ（ＤＲＢ１＊１５０２）变为编码酪氨酸的ＴＡＣ。结论在云南彝族样本中发现的ＤＲＢ１＊１５Ｙ２,其４７位由ＴＡＣ（酪氨酸）置换了相应于ＤＲＢ１＊１５０２的ＴＴＣ（苯丙氨酸）。在我国这样一个多民族国家中,就ＨＬＡ系统而言,可能还有更多新等位基因有待鉴定。这样有助于完善群体遗传资料     

20例中国人HCVⅡ/1b型高变区1序列变异的动态观察

目的 动态研究中国人群ＨＣＶⅡ／１ｂ型包膜蛋白Ｅ２／ＮＳ１高变区１（ＨＶＲ１）序列变异规律、意义及影响因素。方法 应用逆转录巢式ＰＣＲ技术从２０例ＨＣＶⅡ／１ｂ型感染的中国病人血清中扩增了ＨＣＶ部分包膜区基因片段（ｎｔ１４４９～１５８６，ＨＣＶ－Ｊ），纯化后直接采用双脱氧链末端终止法进行序列分析。结果 中国人群ＨＣＶ ＨＶＲ１位于氨基酸（ＡＡ）３８４～４１０位，有６个较保守的ＡＡ位点；３８５位Ｔｈ     

应用反向PCR方法进行YAC末端的分离分析

目的建立有效分离酵母人工染色体（ｙｅａｓｔａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＹＡＣ）末端的方法。方法根据反向ＰＣＲ原理，在分析ＹＡＣ载体ＤＮＡ序列的基础上，选用ＹＡＣ载体上存在切点的限制性内切酶酶解ＹＡＣＤＮＡ，通过连接反应形成环状ＤＮＡ分子，再用与ＹＡＣ载体两末端互补的引物进行扩增，扩增产物经进一步纯化后测序，即可得到ＹＡＣ末端的序列。结果用反向ＰＣＲ方法，分别从７７６Ｅ２、９６４Ｃ５、１１Ｄ８和８Ｄ１共４个ＹＡＣ分离得到各自的左右末端。结论该方法简便、有效，适用于所有的ＹＡＣ克隆