肝症口服液含药血清对TGFα诱导SMMC-7721细胞增殖和ERK蛋白的影响

目的观察肝症口服液含药血清对TGFα诱导人肝癌细胞增殖和信号传导因子ERK影响.方法采用血清药理学方法,以病理鼠血清作对照,应用MTT比色法观察中药鼠血清对TGFα诱导人肝癌细胞SMMC-7721增殖的抑制作用.用免疫组化方法检测中药血清对信号传导因子ERK蛋白表达影响.结果中药血清作用24 h对SMMC-7721细胞抑制率达25%,P＜0.05;作用48 h抑制率达30%,P＜0.001;中药血清作用24 h对1μg·L-1 TGFα诱导的SMMC-7721细胞增殖抑制率为12.3%,P＞0.05;作用48 h抑制率为16%,P＜0.05;中药血清作用24 h对5μg·L-1TGFα诱导的SMMC-7721细胞增殖抑制率为8.9%,P＞0.05,作用48 h抑制率为17.2%,P＜0.001.中药血清对TGFα诱导的肝癌细胞SMMC-7721增殖有明显的抑制作用,抑制效应呈时间依赖性.中药血清能抑制ERK蛋白在细胞核中的表达.结论肝症口服液含药血清能够抑制TGFα诱导的人肝癌细胞增殖,阻断TGFα在细胞内的信号传导.     

清肝活血方及其拆方对脂多糖介导库普弗细胞活化ERK表达调控的研究

目的:探讨清肝活血方及其拆方对脂多糖介导库普弗细胞(Kupffercell,KC)活化表达细胞外受体活性激酶(ERK)的影响。方法:原代分离KC,筛选LPS(脂多糖)合适剂量和作用时间;制备清肝活血方及其拆方含药血清,以ELISA、Western方法检测该方及其拆方含药血清对KC表达肿瘤坏死因子α、细胞外受体活性激酶1/2(ERK1/2)和激活蛋白1(AP-1)的影响。结果:选择LPS合适剂量为100μg/L,合适时间为2小时。清肝方通过抑制磷酸化的ERK(P-ERK)来调节核因子AP-1的表达。活血方可以下调P-ERK,抑制效应产物TNF-α的表达。清肝活血方调控磷酸化P-ERK,抑制核因子AP-1的表达。结论:清肝活血方及其拆方含药血清通过影响ERK信号通路,抑制TNF-α的产生,从而起到保护肝细胞的作用。     

化瘀解毒方含药血清体外抑制A549肿瘤细胞作用及其机制

目的研究化瘀解毒方提取物抗人肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭的作用及机制。方法培养人肺癌A549细胞株,利用MTT法分析肿瘤细胞增殖抑制率,利用Transwell细胞培养系统检测细胞迁移、侵袭作用,采用实时荧光定量PCR法检测化瘀解毒方提取物对磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K),3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶(PDK)1和蛋白激酶B(Akt)mRNA的表达,进一步采用免疫印迹检测PI3K/Akt信号通路中蛋白及其磷酸化水平。结果化瘀解毒方提取物呈浓度依赖性抑制体外人肺癌A549肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭,与生理盐水组相比,差异均有统计学意义(P0.05)。化瘀解毒方含药血清和阳性对照药环磷酰胺对PI3K,PDK1和Akt总蛋白水平无影响。然而,化瘀解毒方含药血清显著抑制A549细胞中Akt蛋白的磷酸化水平。结论化瘀解毒方含药血清抑制A549细胞增殖、黏附、迁移和侵袭与抑制Akt蛋白的磷酸化有关,其作用机制可能与抑制PI3K/Akt通路有关。     

细胞外信号调节激酶1/2途径参与甲状旁腺素1-34诱导的心肌细胞肥大

目的 观察丝裂素活化蛋白激酶的上游激酶1(MAPKK,MEK1)抑制剂PD98059对大鼠甲状旁腺素1-34(rPTH1-34)诱导的心室肌细胞肥大的影响及细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)表达的变化,分析MEK/ERK途径的可能作用. 方法 体外培养新生大鼠心室肌细胞,10-7mol/LrPTH1-34诱导建立心肌细胞肥大模型,在模型中加入2×10-5mol/L PD98059,Motic Images Advanced 3.0软件测定细胞直径、3H-亮氨酸掺入实验检测细胞蛋白合成速率、RT-PCR半定量测定心房利钠肽mRNA、Western blot方法观察ERK1/2、磷酸化ERK1/2蛋白表达的变化. 结果 与正常组相比,10-7mol/L rPTH1-34孵育24 h可使体外培养的心肌细胞直径增加13.6 μm、细胞蛋白合成速率增加898 cpm/well,使心房利钠肽mRNA表达增加73.9%,p-ERK1/2蛋白表达增加15%(P＜0.05).与PTH组相比,预先给予PD98059可使细胞直径减少7.1 μm,细胞蛋白合成速率减少644 cpm/well,心房利钠肽mRNA表达下降52.2%,磷酸化ERK1/2蛋白表达减少18%(P＜0.05).单独使用PD98059对正常心肌细胞没有影响(P＞0.05). 结论 PD98059通过抑制ERK1/2、磷酸化ERK1/2的表达阻断了心肌细胞肥大反应,MEK/ERK1/2途径的活化参与了rPTH1-34的致肥大作用.     

结直肠癌PTEN基因表达及与ERK2、p27kip1的相关性

目的:研究结直肠癌中的PTEN、ERK2及p27kip1蛋白的表达及相互关系,初步探讨他们在结直肠癌发生发展中的生物学意义.方法:用免疫组织化学染色快捷法,检测40例结直肠癌组织、18例结直肠腺瘤、13例结直肠正常黏膜中PTEN蛋白、p27kip1和ERK2蛋白的表达,比较PTEN蛋白表达与临床病理指标的关系,及其与p27kip1、ERK2蛋白表达的相关性.结果:结直肠癌癌组织PTEN,ERK2和p27kip1蛋白表达的阳性率与腺瘤及正常组织间比较差异有显著性(57.5% vs 72.2%,100%;70.0% vs 61.1%,23.1%;62.5% vs 77.8%,100%;P＜0.05);PTEN蛋白表达强度与ERK2蛋白表达强度之间呈负相关(r=-0.452,P＜0.05),与p27蛋白表达强度呈正相关(r=0.379,P＜0.05);PTEN,p27kip1蛋白与结直肠癌分化程度、淋巴结转移及Dukes分期相关(P＜0.05);ERK2蛋白随结直肠癌淋巴结转移、Dukes分期的进展而增高.结论:抑癌基因PTEN的表达与结直肠癌生物学行为密切相关;在结直肠癌发生、发展过程中,可能由于PTEN蛋白的低表达或失表达抑制p27kip1蛋白表达及Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的异常激活,使细胞发生癌变,并促进癌变细胞的浸润、转移.     

吉非替尼对神经胶质瘤细胞移植瘤生长的影响和机制研究

目的探究吉非替尼调控丝裂原激活的蛋白激酶(MEK)/细胞外调节蛋白激酶(ERK)通路对神经胶质瘤细胞移植瘤生长的影响及机制。方法通过皮下注射U87细胞的方法构建胶质瘤裸鼠模型,建模成功后将30只小鼠随机分为对照组、吉非替尼组和联合组(吉非替尼+MEK/ERK通路抑制剂PD98059),每组10只。建模28 d测量肿瘤体积和质量,通过检测Ki67、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)分析增殖水平,TUNEL染色检测凋亡。免疫组织化学染色检测CD34和血管内皮生长因子(VEGF)评估微血管密度和血管生成能力。并分析各组MEK和ERK mRNA和蛋白水平。结果吉非替尼组和联合组建模28 d肿瘤体积和质量明显低于对照组,且联合组建模28 d肿瘤体积和质量明显低于吉非替尼组(P0.05)。吉非替尼组和联合组凋亡指数明显高于对照组[(18.54±2.75)%、(28.82±3.91)%vs(4.64±0.75)%,P0.05],且联合组凋亡指数明显高于吉非替尼组(P0.05)。吉非替尼组和联合组Cyclin D1、Ki67、微血管密度、VEGF表达明显低于对照组,且联合组Cyclin D1、Ki67、微血管密度、VEGF表达明显低于吉非替尼组(P0.05)。吉非替尼组和联合组MEK、ERK mRNA和蛋白表达明显低于对照组,且联合组MEK、ERK mRNA和蛋白表达明显低于吉非替尼组(P0.05)。结论吉非替尼可能通过MEK/ERK通路抑制胶质瘤细胞的增殖和血管生成,并诱导凋亡,从而起到抑制胶质瘤的作用。     

沉默RET基因表达对甲状腺髓样癌细胞增殖的影响

目的 研究沉默RET基因表达对人甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma,MTC)细胞系TT细胞增殖的影响及其机制.方法 将含RET的双链DNA克隆入pSileneerTM 3.1-H1 neo真核载体,构建pSilencer-ret重组质粒,以脂质体转染高表达RET的TT细胞.实时定量PCR和Western印迹法检测RET mRNA和蛋白的表达,以及细胞外信号调节激酶(ERK)的磷酸化水平,CCK-8法测定细胞增殖.结果 质粒测序证实重组质粒构建成功,转染后能明显抑制TT细胞RET mRNA和蛋白的表达,抑制细胞的增殖(P＜0.05),ERK磷酸化水平降低62.4%.结论 构建的pSilencer-ret重组质粒能有效地降低人MTC细胞RET的表达,抑制细胞增殖,与其降低ERK通路的信号转导有关,为MTC的基因治疗提供新策略.     

MEK抑制剂治疗非小细胞肺癌的研究进展

随着对肿瘤分子机制的深入研究,非小细胞肺癌的分子靶向治疗已获得重大进展。蛋白激酶抑制剂是新近研发的靶向药物之一,其通过阻碍细胞内分子传导,影响肿瘤细胞的生存与增殖而起作用。丝裂原细胞外激酶（mitogenextracellularkinase,MEK）在Ras／Raf／MEK／ERK信号通路中发挥重要作用,大量的基础及临床研究提示MEK广泛作用于多种信号通路并在各类实体肿瘤中过度表达,因此MEK抑制剂可能具备广谱的抗肿瘤的优势。本文以新型MEK抑制剂司美替尼（selumetinib,AZD6244,ARRXY-142886）为例,重点阐述Ras／Raf／MEK／ERK信号通路、MEK抑制剂的作用机制及研究进展。     

二十二碳六烯酸治疗糖尿病白内障病变的MEK通路机制

目的探讨二十二碳六烯酸(DHA)治疗糖尿病(DM)白内障病变的MEK通路机制。方法小剂量链脲佐菌素(STZ)合并高糖高脂饮食复制DM大鼠白内障病理模型,对照组大鼠尾静脉注射生理盐水,DHA组大鼠尾静脉注射DHA。分析大鼠晶状体状态及胰岛素抵抗系数(HOMA-IR)的变化,检测大鼠晶状体组织MEK信号通路Ras、Raf、MEK及ERK1/2蛋白的表达。结果 DM白内障大鼠组晶状体浑浊,HOMA-IR升高(P0.01),Ras、Raf、MEK及ERK1/2明显升高(P0.01),细胞凋亡分子Caspase3及Caspase9水平也明显上升(P0.01),而DHA组大鼠上述指标的异常得到明显改善(P0.01)。结论 DHA能够有效缓解DM白内障大鼠症状,且其作用机制可能与抑制MEK信号转导通路激活相关。     

七方胃痛颗粒对H.pylori感染的AGS细胞TFF1表达及ERK/NF-κB信号通路的影响

目的:探讨七方胃痛颗粒对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染的人胃腺癌AGS细胞三叶因子1(trefoil factor family1,TFF1)的表达及其细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)/核因子κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)信号通路的调控机制.方法:采用实时荧光定量PCR(RFQ-PCR)法检测TFF1 mRNA的表达,Western blot法检测TFF1、磷酸化ERK及NF-κB蛋白的表达水平;同时采用U0126抑制ERK信号通路后,观察AGS细胞TFF1蛋白表达的变化.结果:10%、20%、30%浓度七方胃痛颗粒药物血清作用H.pylori感染的AGS后,TFF1mRNA表达量为271±33、305±23、327±13,显著高于实验对照组的187±30,(P<0.05);TFF1、p-ERK及NF-κB蛋白表达量分别为271±22、358±31、428±34;175±9、141±3、107±15;116.0±2.6、83±2、53.0±6.6;与实验对组的210±13比较,差异具有统计学意义(均P<0.05).加入U0126阻断ERK信号通路后,TFF1蛋白表达量为115±6,与实验对照组的210±13比较,差异具有统计学意义(P<0.05).结论:七方胃痛颗粒可能通过抑制ERK/NF-κB信号通路参与调控H.pylori诱导的AGS细胞TFF1表达,促进上皮修复,是其防治H.pylori诱发胃癌可能的机制之一.     

丹皮酚对高血压患者血管内皮细胞Toll样受体4、核因子-κB表达的影响

目的 观察丹皮酚对Toll样受体(TLR)、核因子(NF) -κB信号转导通路的影响,探讨其对高血压患者血管内皮细胞的保护机制.方法 10％高血压患者及健康人血清干预人脐静脉内皮细胞(HUVEC-C)24 h,实时荧光定量(PCR)法检测TLR4 mRNA表达.不同浓度的丹皮酚干预脂多糖(LPS)诱导的HUVEC-C TLR4表达(24 h)及NF-κB活化(2 h),PCR法测TLR4 mRNA及NF-κB mRNA的表达,免疫印迹技术测TLR4蛋白及NF-κB蛋白的表达.结果 血清作用24 h后,高血压病组TLR4 mRNA的表达较健康组增高(P＜0.01).丹皮酚可呈剂量依赖性减少LPS诱导的TLR4 mRNA高表达,抑制LPS诱导的TLR4蛋白高表达和IκBα蛋白的降解(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001).结论 TLR-NF-κB信号途径介导的炎症反应和免疫紊乱是高血压病血管内皮损伤的机制之一,丹皮酚可通过抑制其表达保护血管内皮细胞损伤.     

钙拮抗剂改善铁诱导的大鼠胚胎海马神经干细胞凋亡

目的探讨钙拮抗剂对铁诱导的原代神经干细胞损伤是否具有保护作用。方法以大鼠胚胎(E17.5)海马神经干细胞(hNSC)为细胞模型。首先鉴定hNSC的神经干细胞特征,确认其表达L型钙通道Cav1.2基因mRNA及相关蛋白;然后分别给予细胞如下处理:1对照;2加铁(0.9mmol/L铁剂);3加钙拮抗剂(氟桂利嗪0.1μmol/L或尼莫地平10nmol/L);4钙拮抗剂+铁,观察钙拮抗剂对铁诱导的hNSC细胞活性及凋亡的影响;最后观察铁超负荷对细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化的影响及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK激酶(MEK)抑制剂U0126对铁诱导细胞活性的影响。免疫组化法鉴定细胞神经干细胞特征;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测Cav1.2基因mRNA表达,免疫组化法及流式细胞仪法检测蛋白表达;XTT比色法检测细胞活性;Annexin V/碘化丙啶(PI)流式细胞仪检测细胞凋亡;抗磷酸化-ERK1/2流式细胞仪检测ERK磷酸化水平。结果 hNSC呈现典型神经干细胞特征,表达Cav1.2基因mRNA(158bp)及相关蛋白;钙拮抗剂可以显著增加临床相关浓度(0.9mmol/L)铁超负荷诱导的hNSC的细胞活性(尼莫地平,P0.01),以及减少细胞凋亡;临床相关浓度铁超负荷可以诱导hNSC ERK磷酸化,MEK抑制剂U0126可显著增加铁损伤hNSC的细胞活性(P0.01)。结论钙拮抗剂改善铁诱导的大鼠胚胎hNSC凋亡,可能通过抑制ERK磷酸化过程。     

健脾理气药诱导人肝癌细胞SMMC7721凋亡的研究

目的观察健脾理气药的诱导凋亡效应,为其临床应用进一步提供依据.方法采用血清药理学方法研究中药的体外效应.应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测含中药兔血清对肝癌细胞的抑制效应,以Annexin V标记法、DNA含量测定、电子显微镜方法检测含中药血清诱导凋亡及细胞周期阻滞效应.免疫组化法观察含中药血清对P53,P21WAF1/CIP1蛋白的影响,RT-PCR法观察含中药血清对P21WAF1/CIP1 mRNA表达水平的影响.结果含中药血清有一定的抑制肝癌细胞作用,其作用3 d的抑制率为6.6%,作用6 d的抑制率为36.2%.含中药血清作用2 d诱导9.8%±4.0%的肝癌细胞凋亡,使细胞周期阻滞于S期,并上调P53蛋白、P21WAF1/CIP1 mRNA及蛋白的表达.结论健脾理气药具一定的诱导凋亡及抑制肝癌细胞效应,上调p53,p21WAF1/CIP1基因的表达为分子机制.     

GCS通过影响bcl-2的表达介导结肠癌细胞的多药耐药

目的:本文旨在通过检测在不同条件下结肠癌耐药细胞HCT-8/VCR及其敏感株细胞HCT-8中葡萄糖神经酰胺合成酶(glucosylceramide synthase,GCS)、bcl-2及细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)的表达,探讨其相互关系及可能的作用机制.方法:将细胞分为3组,A组:结肠癌敏感细胞HCT-8常规培养;B组:耐药细胞HCT-8/VCR加VCR 1μg/mL培养,维持其耐药性;C组:GCS抑制剂PPMP处理耐药细胞HCT-8/VCR.Western blot检测各组细胞中GCS、bcl-2及ERK蛋白水平的表达.实时定量PCR检测(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)检测GCS、ERK、bcl-2基因表达情况.结果:与敏感细胞相比,多药耐药(multidrug resistance,MDR)细胞中GCS与bcl-2的mRNA和蛋白表达量明显升高(P0.05),PPMP处理HCT-8/VCR细胞,GCS蛋白和mRNA的表达受到明显抑制(P0.05),同时bcl-2蛋白及mRNA的表达也明显下降(P0.05),ERK蛋白的表达量在加入PPMP后也较前下降(P0.05).结论:GCS通过影响抗凋亡蛋白bcl-2的表达,从而介导结肠癌细胞MDR,这一过程可能是通过ERK信号通路完成的.加入GCS抑制剂PPMP,可抑制bcl-2的表达,逆转细胞耐药.     

化瘀祛痰方药及其拆方对内皮细胞TLR4/NF-kB炎症信号通路干预的研究

目的 探讨化瘀祛痰方药及其拆方含药血清对脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞EA.hy926 TLR4/NF-kB信号通路活化的干预作用.方法 40只SD大鼠随机分为5组,即空白对照组、全方组、补气组、化瘀组、祛痰组,各组大鼠分别以生理盐水和相应中药煎剂连续灌胃9d,末次灌胃给药2h后,腹主动脉采血,离心后分离血清.体外培养EA.hy926细胞,随机分为7组,即①正常对照组、②LPS刺激组、③全方组、④补气组、⑤化瘀组、⑥祛痰组、⑦空白血清对照组.其中②组加入终浓度为10μg/ml的LPS,③～⑦组用各组含药血清(浓度为10％)预处理24 h后加入终浓度为10 μg/ml的LPS,各组细胞培养24 h后进行各项指标测定.采用实时定量反转录-聚合酶链反应(Real-time PCR)定量分析TLR4、NF-kB和TNF-α mRNA表达;ELISA法检测TNF-α含量;Western印迹检测TLR4、NF-kB蛋白表达.结果 与正常对照组相比,LPS刺激后TLR4、NF-kB和TNF-α表达显著增加(P＜0.01),全方组TLR4、NF-kB和TNF-α的表达与刺激组相比显著减少(P＜0.01);拆方各组中,化瘀组TLR4、NF-kB和TNF-α水平均显著减少(P＜0.01),而补气组和祛痰组TLR4、NF-kB和TNF-α水平降低不明显.结论 化瘀祛痰方药及化瘀拆方可显著抑制内皮细胞TLR4/NF-kB炎症信号通路的活化,这可能是其抗AS的作用机制之一.     

阿托伐他汀通过ERK1/2通路抑制内皮微粒诱导的人脐静脉内皮细胞ICAM-1的表达

目的探讨阿托伐他汀对内皮细胞微粒(EMPs)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达的影响及其与ERKl/2信号通路的关系。方法将HUVECs分为不同浓度EMPs作用组与阿托伐他汀干预组。应用Western印迹检测磷酸化ERK1/2和ICAM-1蛋白的表达,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ICAM-1 mRNA的表达。结果 EMPs可诱导HUVECs ICAM-1 mRNA和蛋白及磷酸化ERK1/2蛋白表达增加,且具有浓度和时间依赖关系(均P<0.01);阿托伐他汀及ERK1/2特异性抑制剂PD98059显著抑制EMPs诱导的HUVECs ICAM-1 mRNA和蛋白及磷酸化ERK1/2蛋白的表达(均P<0.01)。结论阿托伐他汀通过ERK1/2信号通路抑制EMPs诱导HUVECs ICAM-1表达。     

泽泻汤对巨噬细胞源性泡沫细胞MMP-9表达的影响及其与ERK通路的相关性

目的 以大鼠腹腔巨噬细胞为研究对象,经ox-LDL（50 mg/L）诱导后建立巨噬细胞源性泡沫细胞模型,观察泽泻汤对泡沫细胞MMP-9表达的影响及其与ERK通路的相关性。方法 用ox-LDL（50 mg/L）处理大鼠腹腔巨噬细胞24 h,经20%泽泻汤含药血清干预24 h,油红O染色检测泡沫细胞形成情况,RT-PCR检测泡沫细胞MMP-9 mRNA的表达,蛋白免疫印迹检测泡沫细胞MMP-9和ERK信号分子的表达情况。结果 ox-LDL（50 mg/L）处理巨噬细胞成功建立巨噬细胞源性泡沫细胞模型;与空白组比较,模型组MMP-9mRNA和蛋白表达明显增加,经20%泽泻汤含药血清、U0126干预后,MMP-9 mRNA和蛋白、p-ERK蛋白表达水平较模型组显著降低。结论 ox-LDL（50 mg/L）处理巨噬细胞可以成功建立巨噬细胞源性泡沫细胞模型;ERK通路受抑制能减少泡沫细胞中MMP-9的表达,泽泻汤能抑制巨噬细胞源性泡沫细胞MMP-9表达,其作用机制可能与ERK的磷酸化密切相关。     

细小病毒H-1感染对有丝分裂原激活蛋白激酶信号传导相关基因表达的影响

目的 探讨具有选择性杀伤和抑制肿瘤细胞生长特性的细小病毒H－1所诱导的胃癌细胞死亡的信号传导通路及可能机制。方法 采用RT－PCR的方法，检测H－1病毒感染后胃癌细胞HGC27的有丝分裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号传导途径相关基因在mRNA水平的表达改变。结果 MAPK信号传导相关基因的扩增结果显示：在H－1病毒感染HGC27细胞48h后，细胞CREB基因的表达明显增高，ERK1、STAT2、p38-γ、MEK2、β－RAF、MTK1基因的表达明显降低，而JNK2、ETS2、ERK2大mRNA水平的表达无明显改变。结论 细小病毒H－1的细胞毒作用可能与其影响胃癌细胞MAPK信号传导途径中相关基因的表达有关。即H－1病毒通过干预癌细胞信号传导的特定通路而诱导细胞死亡。由此我们认为，可修饰改造的细小病毒H－1，将是抗肿瘤研究中的一个非常有价值的工具。     

骨桥蛋白参与血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞迁移

目的检测血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对骨桥蛋白(OPN)表达的影响及其涉及的信号传导途径,并探讨OPN在AngⅡ诱导中膜平滑肌细胞(VSMCs)迁移中的作用.方法采用贴壁法培养SD大鼠胸主动脉的VSMCs.以免疫印迹(Western blot)法检测OPN表达.运用Transwell观察反义OPN在AngⅡ诱导的VSMCs迁移中的作用.结果 (1)体外培养的大鼠VSMCs在基础状态下表达一定水平的OPN蛋白,经10-7mol/L AngⅡ诱导24 h后,OPN蛋白水平与对照组相比增加1.3倍(P＜0.05);(2)预先给予AngⅡ1型(AT1)受体拮抗剂氯沙坦(losartan)、胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂PD98059和P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂SB202190后,AngⅡ诱导的OPN的表达分别下降44.2%、23.6%及72.5%(P＜0.05),而其2型(AT2)受体拮抗剂PD123319对OPN的表达没有影响.(3)反义OPN可以明显抑制AngⅡ诱导的VSMCs迁移(每个视野平均迁移细胞数目26.34±5.47 vs 50.23±6.12,P＜0.05),而OPN正义、错配义组无此变化.结论 (1)AngⅡ上调VSMCs中OPN的表达;(2)AT1受体、ERK和P38MAPK信号系统参与AngⅡ诱导的OPN表达.(3)OPN参与AngⅡ诱导的VSMCs迁移.     

淫羊藿甙逆转地塞米松抑制成骨细胞分化及其机制

目的研究淫羊藿甙对地塞米松诱导的成骨细胞分化抑制的作用及其分子机制。方法采用0.25%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶两步消化法,由出生24h以内的新生SD大鼠头盖骨分离成骨细胞,用含10%胎牛血清的DMEM培养；细胞80%～90%汇合时改用含0.2%牛血清白蛋白的DMEM孵育12h后分组试验,抑制试验在丝裂原激活的蛋白激酶激酶(MEK)抑制剂PD89059预培养1h后加入相关干预药物,pNPP法检测碱性磷酸酶(ALP)活性,RT-PCR检测相关基因表达,Westem印迹检测蛋白表达及磷酸化水平。结果(1)与对照组比较,1μmol/L的地塞米松显著抑制成骨细胞ALP活性(0.72±0.05vs 0.78±0.03,P＜0.05)；20μg/L淫羊藿甙对成骨细胞ALP活性具有促进作用(0.91±0.07vs 0.78±0.03,P＜0.05),并逆转了地塞米松对成骨细胞ALP活性的抑制作用(0.83±0.04vs 0.72±0.05,P＜0.05)。(2)与对照组比较,1μmol/L地塞米松刺激MKP-1、RANKL mRNA表达,抑制GSK-3B、OPG mRNA表达,20μg/L淫羊藿甙的作用与之相反,两者共同作用时,淫羊藿甙能逆转地塞米松的作用。(3)1μmol/L地塞米松抑制细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化,1h达峰值；20μg/L淫羊藿甙刺激ERK磷酸化,峰值在10min。(4)MEK抑制剂PD98059显著降低20μg/L淫羊藿甙刺激ERK磷酸化的同时,降低了其刺激的ALP活性。结论淫羊藿甙可以逆转地塞米松抑制的成骨细胞分化,这种作用可能与丝裂原激活的蛋白激酶途径有关。