顺铂对沉默β-catenin的卵巢癌SKOV3增殖、凋亡的影响

目的:通过沉默Wnt/β-catenin信号转导通路的核心蛋白β-catenin,探讨顺铂对人卵巢癌SKOV3细胞增殖、凋亡的影响,为卵巢癌的耐药逆转提供新思路。方法:用包含β-catenin基因特异RNA序列的慢病毒转染人卵巢癌SKOV3细胞,沉默β-catenin蛋白表达。分组:SKOV3组、SKOV3-neg组(转染空载体)、SKOV3-RNAi组(转染β-catenin-RNAi慢病毒)。Western blot法检测转染前后SKOV3细胞中β-catenin蛋白的表达。12.5μg/ml顺铂作用48h后,用MTT法检测顺铂对各组SKOV3细胞增殖抑制率的影响;流式细胞术检测各组中SKOV3细胞的凋亡率。结果:(1)Western blot结果显示,SKOV3-RNAi组中β-catenin蛋白表达水平显著低于SKOV3-neg和SKOV3组(P<0.05)。(2)相同浓度顺铂作用下,SKOV3-RNAi组的增殖抑制率显著高于SKOV3组及SKOV3-neg组(P<0.05),而后两组的增殖抑制率无显著差异(P>0.05)。(3)流式细胞术检测结果显示,SKOV3-RNAi、SKOV3-neg和SKOV3组的细胞凋亡率分别为(18.8±4.3)%、(1.8±0.3)%、(1.9±0.3)%,SKOV3-RNAi组凋亡率显著高于其余两组(P=0.008<0.05)。顺铂作用后,SKOV3-RNAi、SKOV3-neg和SKOV3组的细胞凋亡率分别为(67.7±2.5)%、(33.3±2.6)%、(32.3±2.1)%;顺铂作用后,各组凋亡率均显著升高(P均<0.05),且SK-OV3-RNAi组凋亡率显著高于其余两组(P=0.000<0.05)。结论:沉默β-catenin蛋白能有效增强SKOV3对cDDP的敏感性,β-catenin有可能成为逆转卵巢癌化疗耐药的治疗靶点。     

β-连环素对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响

目的:探讨信号分子β连环素(β-catenin)在多个卵巢癌耐药细胞系中的表达及其对顺铂耐药性的影响。方法:首先在2个卵巢癌耐药细胞系(C13K,SKOV-3),2个卵巢癌敏感细胞系(OV2008,A2780),A2780顺铂敏感株、A2780-cis顺铂耐药株,COC10顺铂敏感株、COC1-cis顺铂耐药株中检测β-catenin蛋白的水平。通过小干扰RNA(si RNA)介导的RNA干扰技术靶向沉默细胞中β-catenin的表达,实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)和蛋白质印迹法(Western blotting)验证β-catenin基因沉默效果。台盼蓝染色方法分析β-catenin基因沉默对细胞化疗药物顺铂敏感性的影响,流式细胞术检测顺铂处理后β-catenin基因沉默细胞的凋亡率。Western blotting筛选多个凋亡相关信号分子的改变。结果:β-catenin在2个卵巢癌耐药细胞系C13K,SKOV-3中蛋白水平较敏感细胞系明显上调。与亲本A2780和COC10细胞相比,在耐药株A2780-cis和COC1-cis中表达水平也明显增高。β-catenin si RNA能显著抑制细胞中β-catenin蛋白的水平。β-catenin基因沉默后,卵巢癌耐药细胞C13K,SKOV-3对顺铂敏感性显著增高;流式细胞术进一步分析发现β-catenin基因沉默可以促进顺铂介导的卵巢癌耐药细胞的细胞凋亡。Western blotting发现β-catenin基因沉默后,顺铂处理可以显著上调促凋亡分子p53和caspase-3蛋白水平。结论:β-catenin在卵巢癌耐药细胞系表达明显增高,β-catenin沉默可以促进卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性,并同时促进了顺铂介导的细胞凋亡。     

siRNA抑制卵巢癌SKOV3细胞EPAS1表达及细胞增殖的体外研究

目的:探讨RNA干扰对卵巢癌SKOV3细胞中缺氧诱导因子2(EPAS1)表达及细胞增殖的抑制作用。方法:合成靶向EPAS1的小干扰RNA(siRNA)并进行转染。实验分为实验组、阳性对照组、阴性对照组及空白对照组。采用RT-PCR和western blotting检测各组细胞EPAS1 mRNA和蛋白表达水平,通过MTT法检测各组细胞增殖情况。结果:应用EPAS1-siRNA转染卵巢癌SKOV3细胞后,实验组的EPAS1mRNA和蛋白表达水平明显降低,细胞增殖明显受限,与其他三组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组基因沉默效率为63.9%,蛋白抑制率为48.1%,细胞增殖抑制率为56.9%。结论:靶向EPAS1基因的siRNA可以抑制卵巢癌SKOV3细胞中EPAS1的表达,从而抑制SKOV3细胞在体外的增殖。     

GOLPH3通过PI3K/Akt信号通路调控上皮性卵巢癌细胞增殖与凋亡的研究

目的:探讨GOLPH3基因对上皮性卵巢癌细胞增殖及凋亡的影响及作用机制。方法:siRNA干扰技术沉默SKOV3细胞株中GOLPH3基因表达,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot法检测PI3K/Akt信号通路相关基因Akt、p-Akt 473、p-Akt 308及Bcl-2表达。PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002处理卵巢癌SKOV3细胞后,检测SKOV3细胞的增殖能力及凋亡情况。结果:siRNA干扰SKOV3细胞株中GOLPH3基因,GOLPH3表达下调,细胞增殖减少,凋亡增多;PI3K/Akt信号通路相关基因p-Akt 473、p-Akt 308、抗凋亡基因Bcl-2蛋白表达水平均下降,Akt蛋白水平表达无显著变化。LY294002处理SKOV3细胞后,细胞增殖率降低,凋亡率升高。结论:GOLPH3基因可能通过激活PI3K/Akt信号通路促进卵巢癌细胞增殖,并抑制其凋亡的作用。     

沉默NAC-1基因对人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP裸鼠移植瘤化疗敏感的影响

目的:探讨核转录因子NAC-1基因沉默对人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP裸鼠移植瘤化疗敏感性的影响。方法:采用LV4-LUC-GFP慢病毒转染建立NAC-1基因沉默SKOV3/DDP细胞株,将细胞接种到免疫缺陷小鼠皮下,建立人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP裸鼠移植瘤模型,给予顺铂化疗,比较NAC-1基因沉默对SKOV3/DDP在裸鼠体内增殖的影响。取肿瘤组织进行转录组测序,利用Illumina平台进行转录组mRNA测序,筛选差异表达基因,并进行GO和KEGG功能注释和富集分析,揭示NAC-1基因影响移植瘤化疗敏感的可能分子机制。使用STRING数据库构建DEGs编码蛋白互作网络,筛选MCC算法、Degree算法、Closeness算法3种算法共有基因作为关键基因,使用Metascape网站在线分析这些共同基因的基因功能。结果:与对照组相比,抑制NAC-1基因后裸鼠皮下肿瘤体积变小,重量减轻,差异有统计学意义(P<0.05)。转录组学分析显示,抑制NAC-1基因导致肿瘤组织中460个基因显著下调,568个基因显著上调。差异基因(DEGs)在多项GO富集类别中具有显著差异,如...     

siRNA LSINCT5联合顺铂对卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨沉默LSINCT5联合顺铂对人卵巢癌SKOV3细胞增殖及凋亡的影响。方法:选取SKOV3细胞株,采用小干扰技术将LSINCT5基因片段转入卵巢癌SKOV3细胞中,同时联合顺铂作用于卵巢癌细胞。按不同处理因素将SKOV3细胞分为5组:对照组、NC-siRNA组、顺铂组、LSINCT5-siRNA+顺铂组和LSINCT5-siRNA组。CCK-8检测转染后SKOV3细胞对顺铂的敏感性。显微镜下观察细胞的生长状况及形态变化。Western blot和RT-PCR法分别检测与凋亡相关的Caspase 3蛋白和基因表达水平。结果:CCK-8显示,3μg/ml顺铂作用于卵巢癌细胞的抑制率较为适中,故作为后续实验的处理浓度。沉默LSINCT5能显著提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。LSINCT5-siRNA+顺铂组中Caspase 3蛋白和mRNA相对表达量均明显高于其他各组(P0.05)。结论:沉默LSINCT5提高了卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。沉默LSINCT5联合顺铂能明显抑制卵巢癌细胞的增殖,促进卵巢癌细胞凋亡。     

顺铂抑制SKOV3细胞转移的动态监测及相关机制探讨

目的:在细胞水平实时动态监测顺铂抑制SKOV3细胞黏附和转移特性,探讨其相关机制.方法:CCK8法检测顺铂对SKOV3细胞增殖的抑制;采用RTCA监测仪24h实时动态观察顺铂对SKOV3细胞的黏附、迁移和侵袭的抑制作用;细胞组化法检测顺铂作用SKOV3细胞24h后细胞表面CD44v6的表达情况.结果:(1)顺铂对SKOV3细胞增殖的抑制作用呈浓度和时间依赖性,24、48h的IC50分别为24.065±1.031、5.083±0.128μg/ml;(2)在第50min时点,25 μg/ml顺铂组与对照组对SKOV3细胞黏附力的抑制作用差异最显著(P＜0.05).第2h时点,12.5、25 μg/ml顺铂组对SKOV3细胞迁移的抑制作用显著高于对照组(P＜0.05).第10h 15min时点,25μg/ml顺铂组对SKOV3细胞侵袭的抑制作用显著高于对照组(P＜0.05).(3)与对照组比较,25 μg/ml顺铂组细胞表面表达CD44v6明显减少(P＜0.05),而5μg/ml顺铂组减少不明显.结论:顺铂抑制SKOV3细胞转移特性首先表现为抑制细胞的黏附和迁移,这与顺铂减少细胞表面CD44v6蛋白的表达密切相关.CD44v6将成为上皮性卵巢癌治疗的新靶点.     

高表达ALDH1对卵巢癌HEY细胞株干细胞特性的影响

目的:探讨通过无血清悬浮培养的方法培养卵巢癌HEY细胞株,富集悬浮细胞球并检测悬浮细胞中乙醛脱氢酶1(ALDH1)表达的情况,评价ALDH1是否可作为卵巢癌干细胞的标志物。方法:1用含有生长因子的无血清培养基对卵巢癌HEY细胞株进行悬浮培养获得细胞球,与贴壁生长的细胞进行比较。2通过流式细胞检测技术筛选出ALDH1阳性(ALDH1~+)及ALDH1阴性(ALDH1~-)细胞,通过软琼脂克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验检测两组细胞的自我复制、增殖、克隆形成及侵袭能力。3通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)方法检测两组细胞经卡铂药物处理后体外增殖能力。4Western blotting检测两组细胞中的β-连环素(β-catenin)的表达情况。结果:1悬浮细胞中ALDH1~+细胞比例明显高于贴壁细胞(P0.05)。2显微镜下观察,ALDH1~+细胞球克隆形成率高于ALDH1~-(P0.05);ALDH1~+裸鼠瘤体积大于ALDH1~-移植瘤(P0.05)。3经卡铂药物处理后,ALDH1~+细胞球从第4天开始增殖情况明显高于ALDH1~-组(P0.05)。4Western blotting检测示,ALDH1~+中β-catenin的表达明显高于ALDH1~-(P0.05)。结论:用含有生长因子的无血清培养基培养卵巢癌HEY细胞株能够形成卵巢癌干细胞球并高表达ALDH1,ALDH1~+细胞恶性程度更高,化疗耐药性能更强,ALDH1可作为一种卵巢癌干细胞标志物。     

慢病毒介导的EZH2靶向RNA干扰对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响

目的:通过慢病毒介导的EZH2-shRNA干扰载体,沉默人卵巢癌SKOV3细胞中果蝇zeste基因的人类同源物(EZH2)的表达,探讨靶基因EZH2对卵巢癌细胞增殖的影响。方法:设计含EZH2基因序列的shRNA慢病毒干扰载体,转染人卵巢癌SKOV3细胞株;利用CCK-8比色法检测EZH2基因沉默后对SKOV3细胞增殖的影响;利用RT-PCR、Western blot分别检测EZH2、PCNA mRNA及蛋白的表达情况。结果:EZH2-shRNA载体感染SKOV3细胞后,可显著抑制SKOV3细胞生长(P<0.05),并下调EZH2、PCNA mRNA和蛋白的表达(P均<0.05),而在空白对照组和空载体转染组中,无抑制作用。结论:沉默EZH2基因可抑制人卵巢癌SKOV3细胞增殖,可能是一种新的基因治疗方法。     

NAC-1通过自噬介导卵巢癌细胞顺铂耐药的研究

目的:探讨NAC-1在自噬介导的卵巢癌细胞顺铂耐药中的作用。方法:Western blot及流式细胞术检测顺铂诱导的耐药卵巢癌细胞(SKOV3/DDP)自噬及凋亡过程中,NAC-1蛋白的表达情况。采用siRNA下调NAC-1表达,检测其对SKOV3/DDP细胞自噬及凋亡的影响,并检测其对顺铂耐药性的影响。结果:顺铂处理SKOV3/DDP细胞后,细胞自噬及凋亡水平升高,NAC-1蛋白表达升高。siRNA下调NAC-1基因后,顺铂处理SKOV3/DDP细胞的自噬水平降低,凋亡升高,细胞顺铂耐药性降低。结论:NAC-1基因可能通过调节自噬参与卵巢癌细胞顺铂耐药,降低NAC-1基因表达有助于提高顺铂对卵巢癌细胞的杀伤作用。     

RNAi沉默CD147基因对卵巢癌细胞HO-8910pm生物学行为的影响

目的:采用RNA干扰(RNA interference,RNA i)技术,利用构建的稳定转染CD147 shRNA表达质粒载体的HO-8910pm/pGE-1 CD147shRNA细胞株观察卵巢癌细胞系HO-8910pm CD147基因的沉默作用及生物学效应。方法:用免疫细胞化学法、激光共聚焦检测HO-8910pm细胞CD147的表达;MTT法绘制细胞生长曲线,观察裸鼠卵巢癌皮下移植瘤的成瘤性。结果:pGE-1CD147shRNA转染人卵巢癌细胞系后,CD147的表达受到高效且特异的抑制,细胞侵袭力减弱,荷瘤裸鼠成瘤力下降,抑瘤率达58.8%(P<0.01)。结论:RNA i沉默CD147基因可影响卵巢癌的侵袭和成瘤,有可能成为治疗卵巢癌的新途径。     

WWOX基因干扰对卵巢上皮性癌细胞顺铂耐药的影响

目的 研究应用RNA干扰(RNAi)技术逆转卵巢上皮性癌(卵巢癌)耐药细胞中WWOX基因的表达,并探讨WWOX基因与卵巢癌细胞顺铂耐药的关系.方法 将设计合成的针对WWOX基因的特异性小分子干扰RNA(siRNA),用脂质体瞬时转染法将其转染进WWOX基因高表达的卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/SB细胞中,用RT-PCR技术和蛋白印迹法分别测定转染前后SKOV3/SB细胞中WWOX Mrna及蛋白表达的变化;采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测转染前后SKOV3/SB细胞对顺铂的耐药指数;应用流式细胞仪检测转染前后SKOV3/SB细胞的生长周期,高效液相色谱仪测定转染前后SKOV3/SB细胞中顺铂的药物浓度.实验分为5组:(1)SKOV3组:接种SKOV3细胞;(2)SKOV3/SB组:接种SKOV3/SB细胞;(3)SKOV3/SB阴性对照转染组:接种转染阴性对照序列的SKOV3/SB细胞;(4)SKOV3/SB脂质体转染组:接种转染脂质体的SKOV3/SB细胞;(5)SKOV3/SB siRNA转染组:接种转染siRNA的SKOV3/SB细胞.结果 转染48 h后,SKOV3、SKOV3/SB、SKOV3/SB阴性对照转染、SKOV3/SB脂质体转染、SKOV3/SB siRNA转染组细胞中WWOX Mrna的表达水平分别为0.647±0.025、2.239±0.030、2.392±0.041、2.379±0.047、1.219±0.032,WWOX蛋白的表达水平分别为1.368±0.028、1.639±0.031、1.580±0.025、1.552±0.034、0.653±0.017,SKOV3/SB siRNA转染组与其他各组比较,差异均有统计学意义(P<0.05).转染siRNA前、后,SKOV3/SB细胞对顺铂的耐药指数由5.04降至3.89;细胞周期中G1期由39.2%增至45.6%,S期由50.4%降至37.5%;耐药细胞内顺铂浓度由9.43 ns/L升至23.45 w/L,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 针对WWOX基因合成的特异性siRNA能明显抑制SKOV3/SB细胞中WWOX Mrna和蛋白的表达,并能在一定程度上恢复其对顺铂的敏感性,推测WWOX基因可能参与了卵巢癌细胞的顺铂耐药过程.     

RNA干扰技术抑制卵巢上皮性癌耐药细胞Topo Ⅱα基因表达并逆转耐药的体外研究

目的 探讨RNA干扰技术抑制卵巢上皮性癌(卵巢癌)耐药细胞TopoⅡα基因的表达是否能逆转耐药.方法 (1)设计并筛选针对Topo Ⅱα基因的、沉默效果最佳的小分子干扰RNA(siRNA),将其克隆到psilencer4.1-CMV-neo载体上;将psilencer4.1-CMV-neo-Tope Ⅱα重组质粒转染至受试细胞,建立稳定转染重组质粒的细胞Topo Ⅱα siRNA(+)SKOV3/DDP.(2)采用RT-PCR技术和蛋白印迹法测定稳定转染细胞中TopoⅡαmRNA和蛋白的表达;分别采用四甲基偶氮唑蓝比色法、流式细胞仪和高效液相色谱法测定TopeⅡαRNA干扰前后细胞的耐药指数、细胞周期和细胞内顺铂含量的变化.结果 (1)转染psilencer4.1-CMV-neo-Topo Ⅱα质粒后能抑制SKOV3/DDP细胞中TopoⅡα基因的表达,TopeⅡα siRNA(+)SKOV3/DDP和SKOV3/DDP细胞中TopoⅡα mRNA的表达水平分别为0和0.92±0.08;两种细胞中TopoⅡα蛋白的表达水平分别为0.51±0.04和1.95±0.09,两者比较,差异有统计学意义(P<0.01).(2)SKOV3/DDP细胞转染Topo Ⅱα siRNA后耐药指数下降,TopoⅡα siRNA(+)SKOV3/DDP和SKOV3/DDP细胞的耐药指数分别为3.46和5.05,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05).(3)TopoⅡα siRNA(+)SKOV3/DDP细胞的G_0/G_1期、G_2/M期细胞比例较SKOV3/DDP细胞增加,S期细胞比例减少(P均<0.05).(4)Topo Ⅱα siRNA(+)SKOV3/DDP细胞经20 μg/ml顺铂处理24 h后,其顺铂含量(157.20 ng)较SKOV3/DDP细胞(63.99 ng)升高,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 阻断卵巢癌耐顺铂细胞中Topo Ⅱα基因的表达能逆转其对顺铂的耐受性.     

MicroRNA-16逆转上皮性卵巢癌耐药的动物实验研究

目的:研究微小RNA-16(miR-16)对人上皮性卵巢癌裸鼠皮下移植瘤耐药性的逆转作用,并初步探讨其逆转作用机制。方法:24只BALB/c裸鼠,随机分为四组,每组6只:Ⅰ组给予皮下接种卵巢癌SKOV3细胞株,成瘤后应用顺铂治疗;Ⅱ组皮下接种卵巢癌SKOV3/DDP顺铂耐药细胞株,成瘤后给予顺铂治疗;Ⅲ组皮下接种卵巢癌SK-OV3/DDP顺铂耐药细胞株,成瘤后给予顺铂与miR-16阴性对照试剂(miR-16 Negative)协同治疗;Ⅳ组接种卵巢癌SKOV3/DDP顺铂耐药细胞株,成瘤后给予顺铂与miR-16化学修饰模拟物(miR-16 Agomir)协同治疗。观察比较四组皮下肿瘤生长情况,种瘤后第35天处死裸鼠,称取肿瘤组织质量,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测肿瘤组织中bcl-2 mRNA表达,免疫组化方法检测各组肿瘤组织中bcl-2蛋白表达。结果:顺铂与miR-16 Agomir协同治疗组裸鼠皮下肿瘤生长受到明显抑制,其肿瘤组织中bcl-2 mRNA表达水平较其余各组降低,差异具有显著性(P<0.05),其bcl-2蛋白表达亦明显低于其余各组(P<0.05)。结论:miRNA-16可能通过对其靶基因bcl-2的反向调控作用,逆转裸鼠卵巢癌皮下移植瘤顺铂耐药性。     

IDO与卡铂诱导卵巢癌耐药的免疫学研究

目的:通过卡铂诱导卵巢癌耐药的细胞系对免疫细胞功能影响的研究,从免疫学角度探讨耐药卵巢癌转移或复发的机制。方法:建立卵巢癌SKOV3细胞对卡铂耐药的细胞系SKOV3/CBP,ELISA法检测SKOV3和SKOV3/CBP细胞吲哚2,3双加氧酶(IDO)表达;将两组细胞分别与淋巴细胞、NK细胞及C8~+T细胞培养,MTT法检测淋巴细胞的增殖能力、LDH检测NK细胞的杀伤能力及ELISPOT检测C8~+T细胞的杀伤能力。结果:与SKOV3细胞株相比,耐药细胞株SKOV3/CBP内IDO表达明显增强(P0.05),且与其共培养的淋巴细胞的增殖能力、NK细胞的杀伤能力及CD8+T细胞的杀伤能力较SKOV3组降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论:卡铂耐药SKOV3细胞内IDO表达增加,其可通过降低免疫细胞作用的敏感性而发生免疫逃逸促进耐药肿瘤的转移和复发,IDO可作为卵巢癌卡铂耐药治疗新的靶点。     

ATP7B siRNA阳离子纳米脂质体逆转卵巢癌细胞株顺铂耐药的体内外实验研究

目的:探讨负载P型铜转运ATP酶(ATP7B)、小干扰RNA (siRNA)阳离子纳米脂质体( ATP7B/DC-Lip)逆转卵巢癌细胞株SKOV3顺铂(DDP)耐药的作用及意义.方法:通过DDP梯度诱导法构建卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP,利用细胞增殖抑制实验测定其耐药指数.薄膜分散法制备ATP7B/DC-Lip并测定其各项纳米表征.利用细胞增殖抑制实验和裸鼠体内实验分别检测ATP7B/DC-Lip的体内外抗肿瘤效果.结果:成功构建了卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP,ATP7 B/DC-Lip在体外条件下可以分别沉默75％(48小时)和78％(72小时)的ATP7B蛋白表达.在体内外抑制肿瘤生长实验的结果显示,当转染ATP7 B/DC-Lip后,体外条件下SK-OV3/DDP的IC50显著下降为3.51±0.93 μg/ml(n=6);体内DDP耐药型肿瘤模型中DDP+ATP7B/DC-Lip组的肿瘤大小较其他组明显更小(P＜0.05).结论:ATP7B/DC-Lip可以逆转卵巢癌细胞株SKOV3的DDP耐药,可能作为一种有效的纳米药物用于治疗DDP耐药性卵巢癌.     

针对Her-2基因的小分子干扰RNA对卵巢上皮性癌细胞生物学行为影响的研究

目的通过小分子干扰RNA(siRNA)对Her-2基因表达的影响,探讨其对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞生物学行为的影响。方法针对Her-2基因的siRNA质粒和阴性对照质粒在脂质体介导下转染到包装病毒细胞株PT67中,嘌呤霉素筛选细胞克隆,收集其上清液并感染SKOV3细胞,经过嘌呤霉素筛选得到稳定转染的细胞株SKOV3/siRNA、SKOV3/siRNA-negative,并通过RT-PCR和免疫组化方法鉴定Her-2基因表达的抑制效果。用四甲基偶氮唑蓝法检测细胞增殖并绘制生长曲线,通过流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡,并将稳定转染的细胞株接种到裸鼠皮下检测成瘤情况。结果(1)SKOV3/siRNA细胞Her-2基因的表达明显减弱。(2)SKOV3/siRNA细胞的G0/G1期细胞占68·6%,S期细胞占15·1%,SKOV3/siRNA-negative细胞的G0/G1期占55·8%,S期占23·3%。(3)SKOV3/siRNA细胞的早期凋亡率为(10·500±0·250)%,而SKOV3/siRNA-negative细胞为(0·340±0·010)%,两者比较,差异有统计学意义(P<0·01)。(4)与SKOV3/siRNA-negative细胞比较,SKOV3/siRNA细胞的生长速度减慢(P<0·05),接种于裸鼠皮下的肿瘤生长速度明显减慢(P<0·01)。结论siRNA可以有效抑制Her-2基因的表达,抑制卵巢癌细胞的生物学行为。     

人卵巢癌干细胞的分离培养和初步鉴定

目的:从人卵巢癌细胞株SKOV-3中分离培养卵巢癌干细胞,并鉴定其生物学性质。方法:卵巢癌SKOV-3细胞在含有生长因子的无血清培养基(SFM)中悬浮培养得到肿瘤细胞球。流式细胞术、Transwell小室侵袭实验分别检测SKOV-3细胞及其细胞球CD44和CD117的表达,筛选细胞表面标记物和观察体外侵袭能力;将肿瘤细胞球传代扩增,并用含血清培养基(SSM)培养促使其分化,并将细胞球和普通SKOV-3细胞分别接种于96孔板,CCK-8法检测增殖能力及其耐药性。结果:卵巢癌SKOV-3细胞能在SFM中形成可以稳定传代的细胞球,并显示很强的自我更新和增殖能力,含血清环境能够诱导其分化而贴壁生长;肿瘤细胞球中高表达CD44和CD117抗原标记,特别是CD44,其侵袭能力显著高于正常SKOV-3细胞(P0.05);细胞球对顺铂具有更强的耐药性,将顺铂作用于细胞球及贴壁分化细胞24,48及72h后,细胞球抑制率分别为2.59%,8.43%,12.08%,显著低于分化贴壁细胞(抑制率分别为10.73%,28.13%,39.17%),分别比较,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:采用无血清悬浮培养法从人卵巢癌细胞系中获取的细胞球,可能含有一小部分具有增殖和分化能力的卵巢癌干细胞,多表达CD44和CD117抗原标记,且CD44更具有特异性。     

O-GLcNAc糖基化介导的β-catenin水平变化对卵巢癌细胞增殖的影响

目的:探讨O-GLcNAc糖基化修饰对卵巢癌细胞内β-catenin水平以及细胞增殖的影响。方法:利用慢病毒转染技术构建O-GLcNAc低表达SKOV3细胞模型。利用O-GLcNAc水解酶(OGA)抑制剂PUGNAc构建高表达A2780细胞模型。流式细胞技术检测构建O-GLcNAc糖基化对细胞周期的影响。MTT法检测O-GLcNAc糖基化对细胞增殖的影响。Westernblot法检测不同细胞模型内β-catenin表达情况。CO-IP法检测不同细胞模型内β-catenin的糖基化修饰水平。结果:下调细胞内O-GLcNAc糖基化水平能抑制细胞的增殖能力,上调细胞内O-GLcNAc糖基化水平能增强细胞的增殖能力。下调细胞内O-GLcNAc糖基化水平后,β-catenin表达以及糖基化修饰水平降低;上调细胞内O-GLcNAc糖基化水平后,β-catenin表达以及糖基化修饰水平增高。结论:卵巢癌细胞内OGLcNAc糖基化水平变化能通过β-catenin对细胞增殖产生影响。     

卵巢癌淋巴结定向转移裸鼠动物模型的建立

目的:在裸鼠体内建立人卵巢癌定向淋巴道转移动物模型。方法:将卵巢癌细胞株SKOV3移植于裸鼠爪垫下,待裸鼠卵巢癌发生转移时,取其淋巴结转移灶癌细胞再次移植裸鼠爪垫下传代,反复传3代。结果:SKOV3卵巢癌细胞在裸鼠体内传3代后,各代裸鼠的淋巴结转移率一直稳定,且转移途径较为单一;各代癌细胞的体内外增殖能力不断增强。结论:成功建立了人卵巢癌定向高淋巴道转移模型。