牛视网膜微血管内皮细胞的体外分离培养

目的探讨一种方便可靠的牛视网膜微血管内皮细胞(borein retinal microvas cular endothelial cell,BREC)体外培养方法.方法采用机械剪碎牛视网膜血管,用含牛血清、肝素、血管内皮生长因子(Vascularendothelial growthfactor,VEGF)的条件化培养基培养牛视网膜血管内皮细胞,观察细胞生长状况,制作生长曲线.应用Von Willebrand因子抗体免疫鉴定BREC,并通过透射电镜观察BREC的超微结构.结果添加了VEGF的条件化培养基对BREC有很好的选择刺激作用,初期细胞呈鲤鱼样聚集在微血管碎片周围,对数生长期细胞似铺路石样大片单层生长,存在接触抑制.Von Willebrand因子抗体染色阳性,获得BREC纯度在95％以上,能够连续传代.培养的细胞电镜下符合内皮细胞的特征.结论含VEGF培养基的应用可以获得高纯度、具有良好生长特性的BREC,是一种简便、效果稳定可靠的体外培养牛视网膜微血管内皮细胞的方法.     

牛视网膜微血管内皮细胞和周细胞的体外培养

目的 探讨牛视网膜微血管内皮细胞（ bovine retinal endothelial cells, BREC ）和周细胞（bovine retinal pericytes, BRP）的体外选择性培养方法。 方法 结合视网膜微血管的消化分离，采用含10％人血清、100 μg/ml 肝素（Heparin）的Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium, DMEM)和含20％胎牛血清的DMEM培养基分别选择性培养BREC和BRP。通过荧光显微镜观察乙酰化低密度脂蛋白(acetylated low density lipoprotein, Dil-Ac-LDL)吞噬情况并应用Von Willebrand因子抗体通过免疫组织化学方法鉴定BREC；以及α-平滑肌肌动蛋白抗体免疫组织化学鉴定BRP。 结果 通过选择性培养获得的BREC和BRP的纯度达到98％以上，并能连续传代。BREC早期似小鲤鱼状聚集在微血管碎片周围，呈片状鹅卵石样单层生长，存在接触性抑制；周细胞多散布在距血管碎片稍远处，形状不规则，呈无接触性抑制的生长。BREC可吞噬Dil-Ac-LDL，细胞浆内有荧光表达 ；消化传代后BREC中Von Willebrand因子表达阳性，而α-平滑肌肌动蛋白表达阴性；BRP的α-平滑肌肌动蛋白表达阳性，而Von Willebrand因子表达阴性。 结论 选择性培养基的应用和培养皿的处理，可分别获得较高纯度的BREC和BRP，简单且具有良好的重复性，无需额外步骤来去除BREC中混杂的BRP。 （中华眼底病杂志，2004，20：23-26）     

牛视网膜微血管周细胞和内皮细胞的选择性培养

目的 建立视网膜微血管周细胞（ＰＣ）和内皮细胞（ＥＣ）选择性培养的简便方法。方法 采用含２０％胎牛血清（ＦＢＳ）的ＤＭＥＭ和在该培养基加入５％贫血小板人血浆（ＰＰＰ）及牛视网膜浸出液（２０ｕｌ／ｍｌ）,结合原代培养细胞克隆的分离、除杂。结果 获得的ＰＣ和ＥＣ能连续传代,纯净度〉９５％。ＰＣ形态不规则,无接触性抑制,对３Ｇ５和α－肌动蛋白单克隆抗体染色阳性,Ⅷ因子抗体染色阴性;ＥＣ呈鹅卵石状生长,有接触性抑制,对Ⅷ因子抗体染色阳性,３Ｇ５和α－肌动蛋白抗体染色阴性。结论 用２０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ或在该培养液中加入５％ＰＰＰ及视网膜浸出液,结合原代细胞克隆的分离、除杂,可分别获得较纯净的ＰＣ和ＥＣ培养物。     

大鼠视网膜微血管内皮细胞的分离和培养

目的探讨大鼠视网膜毛细血管内皮细胞(rat retinal capillary endothelial cells,RRCEC)的体外分离和选择性培养方法。方法采用单纯视网膜剪碎法获得的视网膜微血管碎片,结合0.25%胶原酶消化,经细胞筛网过滤,原代细胞悬液接种于纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)包被的培养皿中,培养液为含20%胎牛血清(FBS)、100×103U·L-1肝素钠、10mg·L-1碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的DMEM液。原代培养5～6d细胞较少时,采用机械除杂法进行细胞分离,而在传代时利用进行选择性消化和贴壁法除杂分离以获得较纯RRCEC。应用Ⅷ因子相关抗体通过免疫组化方法对所培养的RRCEC进行鉴定。结果大鼠视网膜组织经过胶原酶适当消化后,产生大量具有良好生长能力的微血管碎片,贴壁后可见RRCEC自微血管碎片中游出,融合后呈铺路石样单层生长。传代培养时5～6d可融合生长。选择性培养获得的RRCEC纯度高,能连续传代,保持性状不变。对Ⅷ因子相关抗体染色阳性。结论视网膜剪碎、胶原酶、FBS、bFGF、培养皿处理及机械除杂法分离,选择性消化和贴壁等应用可获得较纯的RRCEC,方便简单,具有良好的重复性。     

大鼠视网膜微血管内皮细胞的原代培养及鉴定改进

【摘要】 目的 探讨大鼠视网膜微血管内皮细胞原代培养改进方法,为研究视网膜新生血管疾病的病理机制奠定基础。设计 实验研究。研究对象 大鼠视网膜微血管内皮细胞。方法 采用机械剪除大鼠视网膜血管联合酶消化分离,用含胎牛血清、内皮细胞培养特制添加剂等的条件培养基培养及纯化大鼠视网膜微血管内皮细胞,倒置相差显微镜下观察细胞生长状态。应用因子VIII、血小板内皮细胞黏附分子-1（CD31）免疫鉴定细胞。主要指标 微血管内皮细胞形态,免疫荧光染色。结果 原代培养的大鼠视网膜微血管内皮细胞贴壁后散在分布,呈单层排列,多为梭形,边界清楚,少量呈铺路石样螺旋向外生长,3~5天后融合,呈簇状单层分布。免疫荧光细胞染色显示,因子VIII抗体染色核周出现黄绿色荧光反应,CD31因子抗体染色以胞浆着色为主。细胞纯度较高,荧光染色阳性细胞率为95%。结论 采用机械剪除大鼠视网膜血管、胰蛋白酶和胶原酶消化、含特制添加剂培养基的应用、明胶包被培养瓶等综合法可获得较纯的大鼠视网膜微血管内皮细胞。（眼科,2012,21：261-263）     

视网膜色素上皮细胞对培养视网膜微血管内皮细胞的抑制作用

新生血管的形成是许多眼底疾病的一个重要环节，是致盲的常见原因．但在临床上尚无满意的治疗措施．人们发现：在眼底新生血管周围，往往有视网膜色素上皮细胞（RPE）的存在，而且当增生的RPE包裹新生血管时，新生血管便停止．[1]但RPE对于新生血管的确切作用仍不清楚，有的研究甚至截然相反。[2-3]因此，为了进一步研究RPE对新生血管的作用，我们采用细胞培养的方法，观察了正常及缺氧条件下，RPE对视网膜微血管内皮细胞（RCEC）的影响。1、材料与方法1．1材料M199培养基（GIBCO），新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所…     

糖尿病患者视网膜前新生血管膜中血管内皮细胞的增殖和激活

目的研究Ⅰ型糖尿病患者增殖型糖尿病视网膜病变（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｄｉａｂｅｔｉｃｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ，ＰＤＲ）视网膜前新生血管膜中血管内皮细胞的增殖和激活状态。方法用双重免疫荧光及碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法检查Ⅰ型糖尿病患者１８例ＰＤＲ视网膜前新生血管膜血管内皮细胞的增殖和激活状态，并与患者的主要临床特征相比较。结果１８例标本中，１６例（８８．９％）含增殖状态的血管内皮细胞，１４例（７７．８％）的内皮细胞呈激活状态；应用双重染色技术，发现在含增殖状态内皮细胞的１６例中有１４例（８７．５％）内皮细胞同时处于激活状态。结论ＰＤＲ视网膜前新生血管膜中大多数新生血管内皮细胞呈增殖和激活状态，提示血管内皮细胞在ＰＤＲ的病理生理和发展中起重要作用     

牛视网膜微血管内皮细胞的培养方法学原理和生长性状初探

视网膜血管内皮细胞培养的主要问题是细胞不易获取和纯化.尽管国内文献已有较多报告[1～3],但对方法学原理和细胞生长性状描述不够详尽,欠指导性.我们将所做的工作作一总结,报告如下.     

缺氧对牛视网膜血管内皮细胞整合素受体αvβ3表达及功能的影响

目的 探讨缺氧对牛视网膜血管内皮细胞整合素受体αvβ3表达及功能的影响。 方法 以玻璃粘连蛋白(Vn)包被培养皿，将牛视网膜血管内皮细胞置入正常及缺氧条件下，孵育12、24、48、60、72 h后以酶联免疫吸附方法检测细胞表面整合素受体αvβ3的表达，并通过细胞粘附分析检测其功能。 结果 缺氧条件下，αvβ3的表达逐渐增加，在48h达到顶峰，在60、72h仍较正常环境高。缺氧24h后，牛视网膜血管内皮细胞对细胞外基质Vn的粘附明显增加。 结论 缺氧可上调培养的牛视网膜血管内皮细胞αvβ3的表达，从而促进内皮细胞的粘附。 （中华眼底病杂志，2004，20：361-363）     

玻璃体液对培养人视网膜微血管内皮细胞和色素上皮细胞增生的影响

目的 探讨玻璃体液对培养的人视网膜微血管内皮细胞(human retinal capillary endothelialcells,HRCECs)和色素上皮(retinal pigmental epithelial cells,RPE)细胞增生的影响.方法 原代培养HRCECs和RPE细胞,鉴定并传至第3代,再分别培养在1:8、1:4、1:2(玻璃体液在总培养液中的体积比)的人玻璃体条件培养液(vitreous-conditioned medium,VCM)中,其中VCM分为有无血清2组,在不同作用时间(24～72h),采用四唑盐(tetrazolium,MTT)比色法检测VCM对人HRCECs和RPE细胞增生的影响.结果 在有血清时.与对照组比较,1:4、1:2的VCM在培养的各时间段对HRCECs的抑增生作用差异有显著性意义(P<0.05),而对RPE细胞和混合细胞(HRCECs和RPE混合1:1)的促增生作用差异有统计学意义(P<0.01).在无血清时与对照组比较,1:4VCM组在培养60、72h时以及1:2VCM组在培养24h,RPE细胞的增生差异有统计学意义(P<0.05),而1:2VCM组在培养48、印、72h时RPE细胞的增生差异有非常统计学意义(P<0.01);1:2VCM组在培养各时间段混合细胞的增生差异有统计学意义(P<0.05),均表现为促增生效应.结论 一定体积分数的人VCM抑制HRCECs的增生,但明显促进人RPE细胞以及混合细胞的增生,提示玻璃体中RPE细胞浸润是加重外伤增生性玻璃体视网膜病变和眼内血管增生性疾病的高危因素.     

人玻璃体液对培养的人视网膜色素上皮细胞和血管内皮细胞增生的影响

目的 探讨人玻璃体液对培养的人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）细胞和血管内皮细胞增生的影响。 方法 将人RPE细胞和血管内皮细胞株（vascular endothelial cell lines 304, VEC304）分别培养在1∶8、1∶ 4、1∶2（玻璃体液在总培养液中的体积比）的人玻璃体条件培养液（vitreous-conditioned medium, VCM）中，其中VCM分为有无血清2组，在不同作用时间（2～6 d），采用四唑盐(tetrazolium, MTT)比色法检测VCM对人RPE细胞和VEC304增生的影响。 结果 在有血清时，1∶4、1∶2的VCM在培养的各时间段对RPE细胞的促增生作用与对照组比较，差异有非常显著性意义（P＜0.01），对VEC304的抑增生作用与对照组比较，差异有显著性意义（P＜0.05）；在无血清时，1∶2的VCM在培养2 d时对RPE细胞的促增生作用与对照组比较，差异有显著性意义（P＜0.05），在培养4、6 d时的差异有非常显著性意义(P＜0.01）。 结论 一定体积分数的人VCM促进人RPE细胞的增生，抑制VEC304的增生，提示玻璃体液在增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR) 和眼内血管增生性疾病中可能发挥不同的调控作用。 (中华眼底病杂志, 2002, 18: 140-142)     

miR-375对缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞功能的抑制作用及其机制

背景 研究表明miR-375抑制肿瘤细胞的增生、凋亡、迁移和黏附,并对肿瘤组织中血管内皮生长因子(VEGF)含量的变化进行调控,进而影响血管的生成,但miR-375是否干预视网膜新生血管的形成鲜见报道. 目的 探讨miR-375对缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞(HRCECs)功能的影响及其可能的作用机制.方法 用IMDM完全培养液培养HRCECs,并将细胞分为正常对照组、CoCl2处理组、CoCl2 +miR-375拟似剂组、CoCl2+miR-375拟似剂对照组、CoCl2+miR-375抑制剂组和CoCl2+miR-375抑制剂对照组,待细胞生长至对数生长期后用200 μmol/L CoCl2处理HRCECs以制备缺氧细胞模型;制备终浓度为50 nmol/L的miRNA-脂质体复合物和小干扰RNA(siRNA)-脂质体复合物将miR-375和卷曲蛋白4(FZD4) siRNA转染各组细胞48 h.采用MTT法检测各组细胞的增生情况(A值)并计算增生倍数;采用Transwell小室法检测各组迁移的细胞数目;采用ELISA法检测细胞培养液中VEGF和血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)含量;采用实时荧光定量PCR法检测细胞中miR-375 mRNA和FZD4 mRNA的相对表达量变化;采用Western blot法分析细胞中Wnt通路相关蛋白的相对表达量变化;采用Matrigel小管形成实验检测细胞的体外形成血管的长度.将培养的细胞分为正常对照组、CoCl2处理组、CoCl2+mock组和CoCl2+FZD4 siRNA组,采用荧光素酶报告基因法探测miR-375靶基因FZD4的表达. 结果 miR-375处理组miR-375 mRNA相对表达量明显高于正常对照组,miR-375拟似剂组细胞中miR-375 mRNA相对表达量明显高于miR-375拟似剂对照组,miR-375抑制剂组细胞中miR-375 mRNA相对表达量明显低于miR-375抑制剂对照组,差异均有统计学意义(t=-19.237、8.764,均P＜0.01),提示miR-375的转染效率较高.正常对照组、CoCl2处理组、CoCl2+ miR-375拟似剂组、CoCl2+miR-375拟似剂对照组、CoCl2+miR-375抑制剂组、CoCl2+miR-375抑制剂对照组间细胞增生倍数、迁移细胞数、细胞培养液中VEGF和VE-Cadherin含量以及体外小管形成长度的总体比较差异均有统计学意义(F=24.324、26.776、14.113、19.225、15.040,均P＜0.001),CoCl2 +miR-375拟似剂组细胞增生倍数、迁移细胞数体外小管形成长度及细胞分泌VEGF和VE-cadherin量均较CoCl2+miR-375拟似剂对照组明显减少,而CoCl2+miR-375抑制剂组较CoCl2+miR-375抑制剂对照组明显增加,差异均有统计学意义(均P＜0.01).正常对照组、CoCl2处理组、CoCl2+miR-375拟似剂组、CoCl2+miR-375拟似剂对照组、CoCl2 +miR-375抑制剂组、CoCl2+miR-375抑制剂对照组细胞中β-catenin、cyclinD1、MMP2和VEGF蛋白表达量的总体比较差异均有统计学意义(F=11.753、13.283、16.770、10.334,均P＜0.001),CoCl2+ miR-375拟似剂组细胞中β3-catenin、cyclinD1、MMP2、VEGF蛋白表达量较CoCl2+miR-375拟似剂对照组均明显下降,CoCl2+miR-375抑制剂组较CoCl2+miR-375抑制剂对照组明显增加,差异均有统计学意义(均P＜0.01).CoCl2处理组和CoCl2+mock组细胞增生倍数、迁移细胞数和小管形成长度均较正常对照组明显增加,CoCl2+FZD4 siRNA组细胞增生倍数、迁移细胞数和小管形成长度均明显低于CoCl2+mock组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 miR-375抑制缺氧条件下HRCECs的增生、迁移以及血管形成能力,其作用机制与miR-375直接靶向FZD4调控Wnt通路活性有关.     

体外光动力疗法致血管内皮细胞和视网膜色素上皮细胞凋亡的研究

目的 研究体外光动力疗法（PDT）诱导的血管内皮细胞和视网膜色素上皮（RPE）细胞凋亡情况。 方法 将体外培养的血管内皮细胞和人RPE细胞与血药浓度（1.0 μg/ml）相当的光敏剂verteporfin共同孵育，根据孵育时间的不同，每种细胞分成6组：0、5、15、30、60、120 min组。孵育至上述时间后，分别用光敏剂最大吸收波长光照（689 nm、功率密度为600 mW/cm2的二极管激光），能量密度为2.4 J/cm2，光照时间为83 s。用流式细胞仪检测3 h后各组细胞凋亡比例，实验重复进行3次。 结果 PDT后3 h，血管内皮细胞在6组的凋亡比例分别为：0.01±0.01、0.25±0.02、0.32±0.02、0.41±0.04、0.49±0.03和0.61±0.02；RPE细胞各组的凋亡比例分别为：0.02±0.01、0.22±0.01、0.31±0.02、0.38±0.03、0.47±0.05和0.58±0.03；两种细胞的凋亡比例均随细胞与光敏剂孵育时间的延长而增加；两种细胞在相同时间组的凋亡比例经t检验差异均无统计学意义(P>0.05)。 结论 PDT可致RPE细胞和血管内皮细胞快速凋亡，在相同的体外环境下，PDT对两种细胞所诱导的凋亡反应无明显选择性。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 253-255)     

二十碳五烯酸对体外培养的人血管内皮细胞增殖抑制效应的研究

目的探讨二十碳五烯酸（EPA）对体外培养的人血管内皮细胞增殖的抑制效应及其机制。方法采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法,应用酶联免疫检测仪,测定不同浓度EPA对体外培养的人血管内皮细胞吸光度（A）值的影响。采用重复测量的实验设计类型,观察EPA对体外培养的人血管内皮细胞抑制效应的剂量和时间依赖性。应用SPSS13．0软件对数据进行统计学处理。各组间A值和细胞增殖抑制率的比较,采用单因素和重复测量设计的方差分析。应用流式细胞仪检测EPA对体外培养的人血管内皮细胞周期、增殖指数及凋亡的影响,检测结果应用R×C列联表的x^2检验进行统计学分析。结果MTT比色法显示EPA浓度≥0．15g／L时,对体外培养的人血管内皮细胞A值降低的影响有统计学意义（0．15g／L EPA组与空白组比较P=0．014,0．20g／L EPA组与空白组比较P=0．001）,并随时间的延长而增强,与浓度无关;对其细胞增殖抑制率的影响亦有统计学意义（0．15g／L EPA组与空白组比较P=0．02,0．20g／LEPA组与空白组比较P=0．001）,且随时间的延长而增强。流式细胞仪分析结果显示,用药组细胞增殖指数为23．9％,低于未用药组（26．9％）,无凋亡峰出现,表明EPA仅通过影响细胞增殖周期的变化抑制细胞增殖,无直接促进凋亡的作用。结论EPA对体外培养的人血管内皮细胞增殖具有抑制效应,该效应是通过封闭flk-1受体和影响细胞增殖周期实现;EPA对体外培养的人血管内皮细胞无直接促进凋亡的作用,因此不会对体内正常的血管内皮细胞产生损害,具有良好的临床应用前景。     

verteporfin光动力疗法对体外培养的成人视网膜色素上皮细胞色素上皮衍生因子、血管内皮生长因子表达水平的影响

目的 观察经光敏剂verteporfin光动力疗法（PDT）处理后的体外培养的成人视网膜色素上皮（RPE）细胞色素上皮衍生因子（PEDF）、血管内皮生长因子（VEGF）mRNA表达水平的改变。 方法 采用噻唑蓝比色法（MTT）测定PDT前后体外培养的成人RPE细胞活性的变化。应用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定PDT前后RPE细胞PEDF和VEGF mRNA表达水平的变化。 结果 PDT可造成RPE细胞死亡，死亡率与激光能量密度和光敏剂浓度成正相关。PDT后RPE细胞表达PEDF、VEGF mRNA水平下降，下降程度与激光能量密度和光敏剂浓度成正相关。 结论 PDT可下调体外培养的成人RPE细胞PEDF、VEGF mRNA的表达水平，这可能与PDT治疗黄斑下脉络膜新生血管膜（CNVM）后CNVM的消退或再生有关。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 256-260)     

miR-191抑制视网膜血管内皮细胞增生和血管形成

目的:观察慢病毒（LV）介导miR-191对体外培养的人视网膜血管内皮细胞（hREC）增生和血管生成的抑制作用。方法:体外培养hREC细胞系,分为对照组、缺氧组、LV-空载体（LV-vector）组、LV-miR-191 （LV-191）组。LV-vector组、LV-191组分别转入相应的慢病毒载体。采用流式细胞仪检...     

人类视网膜血管内皮细胞的培养与鉴定

目的建立人视网膜血管内皮细胞培养的简便方法。方法胰蛋白酶消化供角膜移植术后留下的眼球，获得新鲜视网膜血管，用5％胎牛血清的人内皮细胞培养基培养(HE—SFM BGM)，添加生长因子和胰岛素-转铁蛋白-硒添加物，并用纤维连接蛋白促进内皮细胞贴壁。第Ⅷ因子相关抗原鉴定内皮细胞。结果内皮细胞第1d贴壁，第6d形成克隆，第15d细胞融合。传至7～8代转化为成纤维细胞。第Ⅷ因子相关抗原鉴定纯净度达95％。结论利用5％胎牛血清的人内皮细胞培养基，添加生长因子和胰岛素-转铁蛋白-硒添加物，并用纤维连接蛋白包被培养瓶，能简单有效地培养人视网膜血管内皮细胞。     

Müller细胞对视网膜血管内皮细胞紧密连接蛋白表达的影响

目的
探讨体外培养的Müller细胞在糖基化终末产物（AGEs）作用下增殖活性的变化，以及这种改变对牛视网膜血管内皮细胞（BREC）紧密连接蛋白（occludin）表达的影响。
方法
培养新生大鼠Müller细胞和BREC，两类细胞均用特异性抗体进行免疫鉴定。将培养的BREC分4组观察：第1组未添加任何细胞上清液；第2组添加正常Müller细胞上清液；第3组添加糖基化终末产物(AGEs)作用后的Müller细胞上清液；第
4组无细胞组，为空白对照组。酶联免疫吸附法（ELISA）测定4组细胞上清液中紧密连接蛋白的含量，比较其变化。
结果
添加正常Müller细胞上清液组紧密连接蛋白表达量最多，未添加任何细胞上清液组次之，添加AGEs作用后的Müller细胞上清液组更少。
结论
AGEs能促进Müller细胞异常增殖、抑制BREC表达紧密连接蛋白。
(中华眼底病杂志, 2006, 22: 28-30)