银杏内酯A对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠T细胞的免疫调节作用

目的:明确银杏内酯A(GA)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠的疗效,探讨GA对T细胞的免疫调节作用.方法:将C57BL/6雌性小鼠分为用GA治疗EAE小鼠的EAE治疗组(ET)、用生理盐水治疗EAE小鼠的EAE对照组(EC)及用生理盐水处理正常小鼠的正常对照组(HC).用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(MOG...     

CD4~+ T细胞和小胶质细胞在实验性自身免疫性脑脊髓炎中的作用

实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是在动物体内诱导的神经系统慢性脱髓鞘性疾病。EAE的临床表现和病理改变与多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)极为相似,是研究MS理想的动物模型。近年来已有研究发现EAE主要是由自身反应性CD4+T细胞介导的自身免疫性脱髓鞘疾病,在EAE动物发病的不同阶段CD4+T细胞和小胶质细胞数量、形态和表型的改变对疾病的进展起重要作用。通过对EAE病理中CD4+T细胞和小胶质细胞的研究,将有助于进一步了解MS的免疫病理特征及发病机制,为MS的治疗和预防奠定基础。     

黄芪甲苷对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠T细胞免疫调节的影响

背景：多发性硬化初始阶段,中枢免疫细胞激活并释放大量炎症因子,引起白质脱髓鞘甚至累及灰质神经元。CD4⁺T细胞不同亚群之间的分化平衡在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的病程进展中发挥着重要作用。课题组前期研究结果表明黄芪内有效成分黄芪甲苷能够调节EAE小鼠体内免疫反应,其是否对T细胞亚群分化具有调节作用尚未明确。目的：探究黄芪甲苷对EAE小鼠治疗效果及其对T细胞的免疫调控机制。方法：将C57BL/6雌性小鼠分为正常对照组、EAE疾病模型组和黄芪甲苷治疗组,每组8只,后2组使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(MOG35-55)制备EAE模型,免疫后第10-28天,黄芪甲苷治疗组以40 mg/(kg·d)灌胃给药。免疫当天至第28天,记录各组小鼠的体质量及临床评分;免疫后第28天取小鼠脊髓制成冰冻切片行苏木精-伊红染色、固蓝染色观察脊髓病理改变,流式细胞术检测脾脏T细胞亚群百分比,Western blot法检测脊髓组织中γ干扰素、白细胞介素17、白细胞介素6的蛋白表达,ELISA检...     

间充质干细胞改善自身免疫性脑脊髓炎的作用研究

目的 探讨间充质干细胞(MSC)治疗自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的机制.方法 用MOG35-55肽和弗氏完全佐剂乳化剂诱导建立C57BL/6小鼠的EAE模型;分离纯化培养骨髓来源MSC细胞;临床评分和脊髓组织切片评估小鼠的发病情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测EAE组,MSC治疗组和对照组小鼠外周血细胞因子TNF-α,IFN-γ,IL-4和TGF-β的含量;流式细胞术分析3组小鼠脾脏细胞中CD4+ Foxp3+调节性T细胞(Treg)的比例变化.结果 分离纯化C57BL/6小鼠MSC成功;MSC治疗组小鼠的临床评分明显降低,且脊髓组织切片显示T细胞浸润显著减少;外周血中细胞因子IL-4,TGF-β显著高于对照组(t=7.719、17.17,P均＜0.01)和EAE组(t=54.45、48.36,P均＜0.01),IFN-γ,TNF-α低于对照组(t=104.90、1.998,P均＜0.01)和EAE组(t=270.1、13.58,P均＜0.01);脾脏细胞中CD4+ Foxp3+ Treg细胞的比例明显高于对照组(t=15.91,P＜0.01)和EAE组(t=33.39,P＜0.01).结论 MSC能够有效改善EAE小鼠的症状;其对EAE小鼠的治疗作用是通过上调抗炎细胞因子(IL-4,TGF-β)和Treg细胞并下调促炎因子(IFN-γ,TNF-α)的水平,来发挥免疫调节作用.     

Th17细胞和调节性T细胞失衡参与实验性自身免疫性脑脊髓炎的发病

目的探讨Th17细胞和调节性T细胞(Treg)失衡在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)发病过程中的作用。方法建立EAE小鼠模型,在EAE发病的不同时期运用流式细胞术检测小鼠脾脏Treg比例变化,用实时定量PCR(qRT-PCR)分别检测小鼠脾淋巴细胞Foxp3、视黄酸相关的孤儿受体γt(RoR-γt)以及脑组织IL-17 mRNA表达,ELISA检测小鼠外周血IL-6、转化生长因子β(TGF-β)及IL-17A含量变化。结果与佐剂对照组比较,CD4+CD25+Foxp3+Treg比例和Foxp3 mRNA的表达,在EAE发病初期及高峰期明显下降,而在慢性期明显升高(P0.05);RoR-γt mRNA表达量在发病初期与佐剂对照组比较显著增加(P0.05),而高峰期及慢性期与佐剂对照组比较则无显著差异(P0.05)。EAE组小鼠外周血中TGF-β、IL-6浓度在发病初期和高峰期明显升高(P0.05);随病情发展,IL-6浓度逐渐降低,在发病慢性期与佐剂对照组比较无明显差异(P0.05),而TGF-β浓度在发病慢性期仍较高,与佐剂对照组比较明显升高(P0.05)。EAE组小鼠外周血中IL-17A含量在EAE不同时期均有明显升高,且高峰期升高最明显(P0.05)。结论 Th17细胞/Treg失衡参与了EAE发病过程。     

实验性变态反应性脑脊髓炎AQP-4、CD4~+CD25~+调节性T细胞研究

目的:以髓鞘少突胶质细胞糖蛋白细胞外免疫球蛋白样结构域(MOGIgd)为抗原免疫C57BL/6小鼠,建立EAE模型,并检测AQP-4、CD4+CD25+T细胞的表达水平。方法:①采用分子克隆技术诱导表达MOGIgd-TrxA融合蛋白,纯化后以此融合蛋白为抗原于侧腹壁皮下多点注射免疫C57BL/6小鼠作为实验组(MOG组);同时以硫氧还蛋白(TrxA)、豚鼠脊髓匀浆(GPSCH)免疫小鼠分别作为阴性、阳性组。评估动物的临床神经功能、组织病理情况,评价模型的质量。②免疫组化法、荧光定量PCR技术测定AQP-4表达水平;经流式细胞仪(FACS)检测小鼠脾脏中CD4+CD25+调节性T细胞。结果:①MOG组及GP-SCH组小鼠均呈慢性非缓解型病程,两组在发病时间、达峰时间、临床神经功能评分等方面差异无统计学意义(P0.05)。TrxA组无一动物发病。模型组(包括MOG组和GPSCH组)动物HE染色可见血管周围炎性细胞浸润,胶质结节形成,髓鞘染色可见斑片状髓鞘脱失,大脑、小脑、脑干和脊髓均有不同程度受累。免疫组化定性和半定量分析显示MOG组和GPSCH组病灶周围炎症浸润处AQP-4表达与TrxA组相比明显增高(P0.05);②MOG组CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞比例为(4.71±1.61)%,GPSCH组为(1.44±0.65)%,均明显低于TrxA组(P0.01),且MOG组和GPSCH组之间的差异亦具有统计学意义(P0.01)。结论:用MOGIgd免疫C57BL/6小鼠诱导EAE模型稳定,发病率高,为今后进一步研究MS的免疫发病机制和采取有效治疗措施打下基础。EAE模型动物AQP-4的表达量与炎症浸润的严重程度相关。     

MOG诱导小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎及其对CD4+CD25+调节性T细胞的影响

目的： 探讨采用分子克隆技术诱导表达出的含硫氧还蛋白基团的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白细胞外Ig样结构域(MOGIgd-TrxA)融合蛋白免疫C57BL/6小鼠,建立多发性硬化的动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎的可行性;通过检测模型小鼠脾脏中CD4+CD25+调节性T细胞的数量,初步探讨CD4+CD25+调节性T细胞在实验性自身免疫性脑脊髓炎发病机制中的作用。方法: (1)分子克隆技术合成MOGIgd-TrxA融合蛋白,纯化、超滤浓缩后Bradford法测定蛋白浓度。(2)动物实验:C57BL/6小鼠,随机分为4组：MOGIgd-TrxA组（MOG组）、豚鼠脊髓匀浆组、硫氧还蛋白（TrxA）组及生理盐水正常对照组,每组动物12只,各组以相应抗原乳剂免疫小鼠制作EAE模型后评估其临床神经功能、组织病理(HE染色和髓鞘luxol fast blue染色)并评价模型质量。(3)流式细胞仪(FACS)检测小鼠脾脏中CD4+CD25+调节性T细胞的百分比。结果:(1)纯化浓缩后MOGIgd-TrxA蛋白纯度达98%左右,浓度约2.3 g/L。(2)MOG组小鼠与豚鼠脊髓匀浆组小鼠在临床神经功能评分等方面无显著差异(P>0.05)。2组发病动物组织切片HE染色和髓鞘染色均有不同程度的病理改变。(3)CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+T细胞比例MOG组为(4.71±1.61)％,豚鼠脊髓匀浆组为(1.44±0.65)％,均明显低于生理盐水正常对照组（9.22±1.24）％和硫氧还蛋白（TrxA）组（8.97±1.20）％(P<0.01)。结论: (1)分子克隆技术合成的MOGIgd蛋白免疫C57BL/6小鼠能够成功诱导出EAE模型,且模型稳定、发病率高,为进一步研究MS免疫发病机制并采取有效治疗措施奠定基础;(2)CD4+CD25+调节性T细胞数量减少可能与EAE小鼠临床表现相关。     

小胶质细胞的活化在实验性自身免疫性脑脊髓炎中的作用

多发性硬化( multiple sclerosis,MS)是一种常见的以中枢神经系统(central nervous system,CNS)炎性脱髓鞘病变为特征的自身免疫性疾病.MS的病因和发病机制非常复杂,由于病理取材的困难性,在体外建立了该病的动物模型-实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE).人MS及其动物模型EAE发病过程中大量炎性细胞入侵CNS并产生多种致炎因子,脑内微环境受到影响.诸多研究表明在EAE或MS发病中静息态小胶质细胞在浸润的T细胞及释放的细胞因子刺激下发生活化,但它们在EAE中的作用目前尚无统一意见.兹将小胶质细胞在EAE中的活化机制及其在炎症/免疫反应中的作用作一综述.     

细胞因子在实验性自身免疫性脑脊髓炎耐受中的作用

细胞因子(CK)在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的免疫机制中起着重要作用。Th细胞的不同转化决定EAE的发生、发展或抑制。由多种CK构成的免疫调节网络操纵着Th细胞的免疫应答。通过作用Th细胞使之向抑制EAE方向转化,从而寻找对EAE耐受的途径,是目前EAE研究的一个重要方面。以下就与EAE耐受相关的CK研究进行综述,探讨EAE免疫病理机制。     

MOG诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中枢及外周神经系统CD4~+ T及CD8~+ T调节性细胞变化

目的:观察实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中枢及外周CD4+ CD25+调节性T细胞(CD4+ CD25+ Treg),CD8+ CD28-调节性T细胞(CD8+ CD28- Treg)表达的变化情况,并探讨相关的细胞免疫学机制。方法:雌性C57BL/6小鼠随机分为未使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(MEVGWYR-SPFSRVVHLYRNGK)(MOG35-55)免疫的对照组和使用MOG35-55免疫诱导的EAE小鼠模型组,采用临床症状评分记录小鼠行为学变化、HE染色观察CNS炎症细胞浸润及病理改变,使用流式细胞术(FCM)检测小鼠中枢及外周CD8+ CD28- Treg,CD4+ CD25+ Treg细胞表达水平。结果:MOG35-55诱导的EAE模型组动物出现典型的EAE临床行为学及病理学表现,FCM检测EAE模型组小鼠脾细胞CD4+ CD25+ Treg较对照组升高但无统计学差异,CD8+ CD28- Treg表达水平明显低于对照组(P0.01),EAE模型组中枢有CD4+ CD25+ Treg,CD8+CD28-Treg淋巴细胞的浸润,且CD4+ CD25+ Treg,CD8+ CD28- Treg在中枢的表达均高于外周,对照组中枢神经系统未检测到淋巴细胞浸润。结论:CD4+ CD25+ Treg,CD8+ CD28- Treg均参与调控EAE的病理过程,CD4+ CD25+ Treg,CD8+ CD28- Treg在EAE小鼠中枢及外周分布及变化的不同,提示其进入中枢神经系统(CNS)并参与调节中枢局部炎症。     

Fasudil对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠小胶质细胞和星形胶质细胞的作用

目的:确认法舒地尔(Fasudil)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的治疗效果,观察法舒地尔对小胶质细胞和星形胶质细胞的作用.方法:成年雌性C57BL/6小鼠用MOG35-55肽免疫制作慢性EAE模型,分别随机在免疫后第3天(Fasudil早期治疗组)和发病时给予Fasudil(Fasudil晚期治疗组),以同样方式给予生理盐水作为对照.观察临床症状和体质量变化;采用免疫荧光组织化学染色、Western blot 法检测脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞iNOS和p-NF-κB/p65的表达,ELISA测定脊髓匀浆中IL-1β和TNF-α水平.结果:Fasudil推迟EAE起病,减轻EAE症状,抑制脊髓中小胶质细胞iNOS以及星形胶质细胞p-NF-κB/p65表达,并伴随炎性因子IL-1β和TNF-α释放降低.结论:Fasudil可抑制EAE小鼠小胶质细胞和星形胶质细胞炎性分子的释放.     

胸腺五肽治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的实验研究

目的 应用胸腺五肽(thymopentin,TP-5)干预实验性自身免疫性脑脊髓炎(experiment autoimmue encephalomyelitis,EAE)大鼠,探讨该药物对EAE的治疗作用及其机制.方法 以豚鼠全脊髓匀浆(guinea pig spinal cord homogenate,GPSCH)与完全弗氏佐剂(CFA)为抗原免疫Wistar大鼠建立EAE模型.Wistar大鼠随机分为正常对照组、EAE组、地塞米松(dexamethasone,DXM)组、TP-5小剂量组、TP-5大剂量组.采用双抗体夹心ELISA法检测Wistar大鼠免疫后7、14、21 d不同时间点血清中IL-12、IL-10的含量.结果 与EAE组和TP-5大剂量组比较,TP-5小剂量组和DXM组大鼠的发病率和临床评分显著性降低(P＜0.01);DXM组大鼠的发病率和临床评分低于TP-5小剂量组(P＜0.01).各个时间点EAE组、DXM组、TP-5小剂量组、TP-5大剂量组IL-12含量均较正常对照组明显升高(P＜0.01),免疫后14、21 d DXM组和TP-5小剂量组IL-12水平比EAE组低(P＜0.01);免疫后14、21 dDXM组、TP-5小剂量组IL-10水平与其余3组比较明显升高(P＜0.01).结论 TP-5对EAE有保护作用,其作用机制可能与上调IL-10水平以及下调IL-12水平有关,通过双向调节作用逆转TH1/TH2失衡.     

银杏提取物对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的影响

目的:探讨银杏提取物(GBE)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠炎症脱髓鞘病变的影响。方法:应用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白33-55(MOG33-55)配以完全弗氏佐剂(CFA)免疫小鼠,诱发EAE模型。将小鼠分为CFA对照组、EAE模型组和GBE治疗组(每日腹腔注射GBE70mg/kg)。通过神经功能评分、行为学实验以及免疫荧光染色,观察GBE对EAE小鼠的影响。结果:GBE组小鼠各时间段神经功能评分均低于EAE组(P0.05),行为学检测显示发病高峰期falling latency时间较EAE组延长10s;GBE组较EAE组视神经髓鞘碱性蛋白(MBP)表达水平增高,可见MBP阳性髓鞘结构包绕轴突;海马伞矢状切片免疫荧光染色证实GBE组CD11b阳性小胶质细胞较EAE组明显减少,但是GFAP阳性星形胶质细胞数量与EAE组无明显差别。结论:GBE可能通过抑制小胶质细胞激活从而延缓EAE小鼠脱髓鞘进程,提示GBE对多发性硬化具有一定的治疗作用。     

外源性髓鞘抗原的清除在实验性自身免疫性脑脊髓炎中的作用

目的探讨外源性髓鞘抗原的清除对其诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)的作用。方法用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35～55肽(myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55, MOG35-55)或FITC标记的MOG35-55免疫C57BL/6J小鼠诱导EAE, 通过分析过继转移的CFSE标记的mT/mG-2D2 CD4+T细胞在脾脏内的增殖情况评估免疫系统内外源性髓鞘抗原的含量;免疫组织化学法和流式细胞术分析接种部位外源性髓鞘抗原的释放;组织切片HE染色探讨外源性髓鞘抗原快速清除的原因;通过对比分析背部和足垫免疫诱导的EAE, 以及可溶性MOG35-55的治疗效果验证外源性髓鞘抗原的清除在EAE中的作用。结果免疫第2天小鼠脾脏内mT/mG-2D2 CD4+T细胞增殖占比显著高于免疫第7天[(52.6±6.8)%vs(18.5±4.9)%,P<0.01];在发病小鼠(第13天)脾脏内mT/mG-2D2 CD4+T细胞增殖与在初始小鼠脾脏内的增殖差异无统计学意义[(4...     

T细胞定向迁移诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠胸腺萎缩

目的 初步探讨实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠胸腺萎缩的机制.方法 髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)免疫C57BL/6小鼠诱导EAE,卵清白蛋白(OVA)免疫的小鼠作为对照;不同时间点计数胸腺、脾脏、淋巴结细胞总数,检测脾脏中胸腺来源细胞及中枢神经系统(CNS)浸润细胞.结果 MOG肽成功诱导EAE动物模型,小鼠出现典型的肢体运动功能障碍,脊髓可见大量炎性细胞浸润;MOG和OVA免疫均诱导胸腺细胞增加,第5天达到高峰,随后逐渐下降;EAE发病后胸腺细胞迅速减少,发病高峰期几乎完全消失,胸腺严重萎缩;MOG和OVA免疫后脾脏和淋巴结细胞总数持续升高,新近胸腺来源的T细胞增加尤其明显;EAE发病后脾脏T细胞总数减少,CNS浸润淋巴细胞总数增加.结论 大量T细胞在胸腺发育成熟并释放到外周,进而定向迁移至CNS诱导EAE是胸腺萎缩的主要原因.     

补阳还五汤对实验性自身免疫性脑脊髓炎单核巨噬细胞的免疫调控作用

目的:探讨补阳还五汤(BYHWD)治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的有效性及对单核巨噬细胞免疫调控的作用及机制。方法:雌性C57BL/6小鼠用小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55肽段(MOG_(35-55))免疫制作慢性EAE模型,随机分为生理盐水处理组和BYHWD组。在免疫后第3天开始分别予以生理盐水和BYHWD灌胃,500μL/d,持续观察临床症状和体质量变化。免疫后17 d各组统一处死部分动物,HE染色观察炎性细胞浸润情况,髓鞘染色观察脊髓髓鞘脱失比例,流式细胞术检测脾细胞M1型和M2型巨噬细胞表型;免疫荧光组织化学染色和Western blotting检测脊髓巨噬细胞iNOS、TNF-α、arginase及IL-10的表达。结果:BYHWD推迟EAE起病,减轻EAE症状,抑制中枢神经系统脊髓的炎性浸润和髓鞘脱失,促进脊髓及脾组织中M1型巨噬细胞转化为M2型。结论:BYHWD干预可缓解EAE行为学和病理学的改变,其作用机制可能与其诱导巨噬细胞极性转化相关。     

Irgm1基因敲除对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠CD4~+ T细胞亚群的影响

目的:探讨免疫相关GTP酶1(Irgm1)基因敲除对实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠CD4+T细胞的影响。方法:C57BL/6纯系小鼠与Irgm1基因敲除杂合小鼠(Irgm1+/-)回交十代繁殖C57BL/6背景下Irgm1+/-小鼠,用C57BL/6 Irgm1+/-小鼠杂交获取Irgm1-/-、Irgm1+/-、Irgm1+/+三种基因型小鼠,PCR扩增DNA检测基因型。用髓鞘少突胶质糖蛋白(Myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG33-55)多肽与弗氏完全佐剂等量混合制成乳剂,免疫C57BL/6野生型(Wt.)和Irgm1基因敲除(Irgm1-/-)小鼠,建立EAE模型,并进行临床评分。MTT法测定MOG33-55免疫后7 d的EAE小鼠淋巴结细胞中MOG33-55特异性T细胞增殖分化水平。取MOG33-55免疫后14 d EAE小鼠脊髓切片,HE染色检测炎细胞浸润情况。取MOG33-55免疫后16 d的EAE-小鼠淋巴结、脊髓和脑组织,提取单个核细胞,用MOG33-55(20μg/ml)体外刺激培养7 d,收集细胞,用流式细胞仪分析EAE小鼠淋巴结、中枢神经系统浸润细胞中Th1、Th17的改变。结果:成功诱导了EAE小鼠模型;HE染色结果显示Wt.小鼠脊髓周围出现明显炎细胞浸润,而Irgm1-/-小鼠则无明显变化;MTT实验表明Irgm1-/-小鼠与Wt.小鼠相比,淋巴结中T细胞对MOG33-55特异性增殖能力降低;流式细胞分析表明相对于Wt.小鼠,Irgm1-/-小鼠EAE模型在淋巴结及中枢神经系统浸润细胞中Th1细胞亚群比例明显增高而Th17细胞亚群比例下降。结论:Irgm1基因敲除可部分保护EAE小鼠的脊髓功能及临床症状。在EAE发病早期,Irgm1可能起到了关键性的作用,因此Irgm1有可能成为EAE治疗的重要分子靶点。     

Wistar大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎模型性别差异研究

目的:分别建立雌性和雄性Wistar大鼠的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型,并研究两者的差别。方法:应用非灌注法制备的豚鼠全脊髓匀浆分别免疫雌性和雄性两组Wistar大鼠,诱导建立EAE模型,观察30天,取脊髓组织石蜡包埋,病理切片,HE染色,光镜观察。观察两组大鼠在发病时间、发病率、神经功能评分及病程等方面的区别。结果:雌性Wistar大鼠的平均发病时间(13.67±3.50)天,发病率为60%,病程有复发-缓解的特点,神经功能高峰期评分(2.20±1.96)分;雄性Wistar大鼠的平均发病时间(12.18±1.55)天,发病率为85%,呈一过性发病,神经功能高峰期评分(3.46±1.61)分。结论:雄性Wistar大鼠的EAE模型较雌性Wistar大鼠具有发病率高、单相急性病程等特点,为研究多发性硬化发病机制及其发病的性别差异奠定了一定的基础。