含肠道病毒71型VP1基因片段RNA病毒样颗粒的构建

[目的]构建含肠道病毒71型(EV71)VP1基因片段的抗核糖核酸酶的病毒样颗粒。[方法]利用PCR技术扩增大肠杆菌MS2噬菌体的外壳蛋白和成熟酶蛋白基因,将其克隆到pET32a中构建中间载体pET32a-MS2。将EV71VP1基因片段连接到中间载体噬菌体基因的下游,构建原核表达载体pET32a-MS2-EV71。将重组质粒pET32a-MS2-EV71转化宿主菌,经IPTG诱导表达获得病毒样颗粒,对病毒样颗粒进行透射电镜观察、RT-PCR检测和稳定性试验。[结果]重组质粒pET32a-MS2-EV71经PCR、双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功;透射电镜观察到直径大约23nm的圆形病毒样颗粒;RT-PCR和稳定性试验结果表明,诱导产生的病毒样颗粒含EV71VP1基因片段,并且稳定性良好。[结论]成功构建了含EV71VP1基因片段的病毒样颗粒,稳定性良好,可作为病毒检测时标准品和质控品使用。     

潍坊市9例重症与轻症手足口病患者肠道病毒71型5′非编码区、VP1基因特征分析

目的 探讨重症手足口病肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)5′非编码区(untranslated region, UTR)、VP1区是否存在潜在的毒力位点。 方法 分离培养不同临床症状手足口病患者粪便标本中EV71,提取病毒总RNA,逆转录PCR扩增5′-UTR、VP1区后测定基因序列,对两个区域核苷酸序列及VP1区编码氨基酸序列进行比对和同源性分析,构建VP1区及不同临床症状EV71病毒5′- UTR基因进化树。 结果 本实验共获得9株EV71毒株(5株来源于重症病例,4株来源于轻症),5′-UTR、VP1区核苷酸同源性均为94.5%~ 99.7%,VP1区氨基酸同源性为97.3%~99.9%。9株EV71毒株5′-UTR共有67个核苷酸突变位点,与4株轻症EV71毒株相比,5株重症EV71毒株VP1区编码氨基酸有2处发生替换(S283T、A289T),5′-UTR共有37个核苷酸位点发生突变。VP1区基因进化树显示9个EV71毒株均属于C4a基因亚型,并且两组不同临床症状毒株处于同一较小分支中。5′-UTR核苷酸序列的系统进化树显示临床表现不同的EV71株呈交错分布,相同临床表现不单独聚类。 结论 9株EV71毒株均属于C4a基因亚型,5′-UTR核苷酸突变和VP1区氨基酸替换可能影响病毒毒力,对EV71病毒的全基因组序列特征分析及与宿主之间的相互作用机制进行研究非常必要。     

肠道病毒71型重组VP1蛋白的原核表达及初步鉴定

目的利用大肠杆菌原核表达系统表达并纯化肠道病毒71型(EV71)VP1蛋白,并对重组蛋白功能进行初步鉴定。方法 PCR扩增EV71VP1全长基因,在测序正确的基础上,将其插入表达载体pET28a(+),构建表达质粒pET28a(+)/VP1,转化表达菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,利用Ni 2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经ELISA和Western Blot,验证EV71VP1的抗原性。结果成功构建pET28a(+)/VP1重组质粒,经大肠杆菌表达、纯化获得分子量约为43kDa的融合蛋白,经ELISA和Western Blot,结果显示该蛋白有良好的抗原性。结论实现了肠道病毒7l型VP1蛋白的原核高效表达,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的研究奠定基础。     

EV71亚单位VP1的原核表达、纯化及免疫原性分析

目的原核表达并纯化人肠道病毒71型(EV71)亚单位VP1蛋白,分析其免疫原性。方法采用PCR技术扩增EV71 VP1(AB204852.1)基因序列,构建重组质粒p ET32a(+)-VP1并转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达6×His-VP1融合蛋白,将表达的蛋白用Ni2+-NTA树脂纯化、TGE液复性后免疫新西兰大白兔,制备抗VP1的抗血清,用间接ELISA法检测抗血清效价。结果重组工程菌p ET32a(+)-VP1/BL21(DE3)高效表达了相对分子质量约为42 k D的VP1融合蛋白,蛋白经纯化复性后免疫新西兰大白兔所得抗血清效价大于1︰625 000。结论原核表达系统p ET32a(+)/BL21(DE3)能高效表达EV71亚单位VP1融合蛋白,蛋白经纯化复性后具有良好的免疫原性,为进一步研制以双歧杆菌为抗原载体的新型疫苗奠定了基础。     

深圳市龙岗区2017年手足口病病原柯萨奇病毒A16型及肠道病毒71型VP1区基因特征分析

目的 了解2017年深圳市龙岗区柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus A16,CVA16)及肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)的分子特征,为制定本区手足口病的防控策略提供科学依据。方法 对2017年辖区哨点医院收集的CVA16及EV71核酸阳性样本的病毒VP1区基因进行扩增,产物回收并测序,用DNASTAR软件分析不同序列的核苷酸及氨基酸同源性,应用MEGA 6.0软件,以最大似然法(maximum likelihood method)构建系统进化树,进行分子特征分析。结果 2017年深圳市龙岗区共报告手足口病13 443例,发病率为304.83/10万。测序获得26份EV71及27份CVA16的VP1基因序列,基因特征分析显示龙岗区EV71序列均属C4a亚型,可分为3个进化分支。龙岗区CVA16可分为本地流行主分支B1b基因亚型和东南亚流行次分支B1a基因亚型。结论 2017年间,龙岗区CVA16与EV71病原存在多个进化分支,需及时对病原的基因型数据进行更新。     

肠道病毒71型强神经毒分离株VP1蛋白的表达鉴定

目的利用大肠杆菌原核表达系统表达肠道病毒71型强神经毒分离株VP1蛋白,为抗体制备和病毒诊断试剂盒的开发奠定基础。方法利用一步法RT-PCR扩增出病毒VP1基因,构建重组原核表达质粒,IPTG诱导后经SDS-PAGE和Western blot验证蛋白表达的特异性。结果重组质粒在1 mmol/L的IPTG 37℃诱导6 h后可诱导表达得到约33 KD的蛋白,且表达的蛋白主要以不溶性的包涵体形式存在。VP1蛋白特异性单抗和His蛋白单抗验证了蛋白表达的特异性。结论获得特异性的EV71病毒河南分离株VP1蛋白,可用于开发病毒诊断试剂盒。     

大肠杆菌肠毒素基因突变体在乳酸菌中的表达与免疫学鉴定

目的构建表达大肠杆菌肠毒素基因突变体mlt63的乳酸菌工程菌株,为黏膜免疫佐剂研究建立重要基础。方法从前期构建的质粒p BV-mlt63中经PCR扩增mlt63基因,经双酶切将mlt63与质粒载体p NZ8110连接。用连接产物转化大肠杆菌MC1061菌株,从重组菌株中提取p NZ8110-mlt63,用于电转化Lactococcus lactis NZ3900菌株;经质粒双酶切和测序,鉴定重组菌株L.lactis NZ3900/p NZ8110-mlt63。采用nisin诱导重组乳酸菌表达m LT63,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果 mlt63 PCR扩增产物长度与预期相符;重组菌株鉴定结果显示L.lactis NZ3900/p NZ8110-mlt63构建正确;Western blot分析在重组菌株中检出2条mlt63表达的蛋白带,分子量分别为10 k D和40 k D。结论本研究首次将mlt63基因克隆至乳酸乳球菌中,并表达出具有抗原活性的蛋白,鉴于目前亟需安全有效的黏膜免疫佐剂,本研究发现将对该领域研究产生重要影响,对胃肠感染性疾病口服疫苗研究具有促进作用。     

幽门螺杆菌HspA乳酸菌疫苗构建及免疫反应性鉴定

目的 探讨幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A (HspA)在食品级乳酸乳球菌NZ3900菌株中的克隆表达及免疫反应性.方法 利用基因重组技术构建乳酸乳球菌重组子NZ3900/pNZ8110-hspA;绘制生长曲线,观察hspA插入对乳酸乳球菌重组子生长影响及乳酸链球菌素(Nisin)对重组子生长影响；采用钠十二烷基硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)检测HspA在乳酸乳球菌中的表达；应用western-blot鉴定重组子表达HspA的免疫反应性.结果 成功扩增出幽门螺杆菌河南分离株(MEL-Hp27)的hspA基因,构建了hspA基因的乳酸乳球菌原核表达系统(NICE)；细菌生长曲线显示hspA的插入未对乳酸乳球菌重组子的生长产生影响,除10 ng/mL Nisin 对重组子生长影响较小外,20～100 ng/mL nisin对重组子的生长均有明显抑制；SDS-PAGE和Tricine SDS-PAGE 检测均未观察到HspA条带；western-blot鉴定结果显示乳酸乳球菌表达的HspA抗原蛋白具有良好免疫反应性.结论 HspA在乳酸乳球菌中的少量表达影响重组菌生长.     

基于EV71交叉保护抗原P1的病毒样颗粒的构建

目的构建基于EV71交叉保护抗原P1(CP1)的病毒样颗粒。方法利用昆虫杆状病毒表达系统构建CP1和3CD的重组杆状病毒,两者共同感染Sf9细胞,组装形成CP1的EV71病毒样颗粒,并通过Western blot和电镜进行鉴定。结果 CP1、3CD重组杆状病毒共感染表达产物的Western blot结果显示,CP1蛋白经3CD蛋白酶酶切形成了大小约为39 k Da、34 k Da、26 k Da的VP1、VP0、VP3蛋白条带,电镜下可观察到形态规则的大小约为30 nm的CP1病毒样颗粒结构。结论 CP1病毒样颗粒构建成功,为下一步探讨CP1病毒样颗粒是否对多种亚型的EV71病毒具有交叉保护作用奠定基础。     

幽门螺杆菌尿素酶B在乳酸乳球菌中表达与优化

目的 探讨幽门螺杆菌尿素酶B(UreB)在食品级乳酸乳球菌NZ3900菌株中的优化表达条件.方法 利用基因重组技术构建乳酸乳球菌NZ3900( pNZ81 10/ureB);采用L25(56)正交表设计,选定诱导剂浓度、诱导时机、诱导时间3个因素各5个水平;采用乳酸链球菌素诱导表达后,检测不同组合的UreB在乳酸乳球菌中的表达,凝胶扫描后用Genetools分析软件进行目的蛋白占细菌总蛋白比例分析;应用极差分析法比较影响蛋白表达的因素主次关系及目的蛋白优化表达条件;应用正交试验方差分析法进行方差分析.结果 乳酸乳球菌重组子NZ3900( pNZ8110/ureB)表达的可溶性UreB蛋白最高可达27.26 μg/mL,占上清总蛋白比例最高可达20.19%;3个因素对UreB蛋白表达量的影响大小依次为诱导时间、诱导时机和诱导剂浓度,方差分析结果显示,诱导时间对UreB蛋白表达的影响具有统计学意义(P＜0.05).结论 应用正交试验法获得UreB蛋白在乳酸乳球菌中的优化表达条件,为进一步评价免疫预防抗幽门螺杆菌感染的效果奠定基础.     

结核分枝杆菌Lsr2蛋白原核重组表达及其多克隆抗体制备

目的 利用原核系统获得重组结核分枝杆菌Lsr2蛋白,制备抗Lsr2多克隆抗体。 方法 以临床标准株 H37Rv DNA为模板,合成引物PCR扩增Lsr2核酸序列,插入原核表达载体pET28a,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达,柱上复性纯化后,重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备并纯化抗Lsr2多克隆抗体,采用间接ELISA和Western-blotting实验对抗体进行验证。 结果 成功构建pET28a-Lsr2表达质粒,重组蛋白Lsr2经SDS-PAGE电泳鉴定分子量为14 kD。亲和层析及柱上复性后,纯化的重组蛋白纯度在95%左右。制备的抗Lsr2多克隆抗体效价在1:5.5×10⁶以上,并能特异性识别纯化的重组蛋白和结核分枝杆菌菌体蛋白。 结论 成功在原核系统内表达并纯化了重组结核分枝杆菌Lsr2蛋白,制备了高效价的抗Lsr2多克隆抗体,为进一步研究Lsr2蛋白的功能,筛选其下游相互作用蛋白以及相关分子机制研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白在乳酸菌中的表达及免疫活性

目的构建表达幽门螺杆菌(H.pylori)中性粒细胞激活蛋白A(NapA)的重组乳酸乳球菌菌株,为研究NapA作为疫苗抗原和免疫调节剂的应用效果奠定基础。方法用PCR方法从H.pylori基因组DNA中扩增napA基因,将napA经Nae I和SphⅠ双酶切与表达载体pNZ8110连接,用电穿孔法转入乳酸乳球菌菌株NZ3900中,并通过SDS-PAGE和Western blots分析鉴定napA表达产物。结果扩增的nap A基因长度为435 bp,构建的重组乳酸乳球菌经nisin诱导可表达分子量约为19 kD的重组蛋白,表达量约占菌体总蛋白量的12.4%,该重组蛋白可被小鼠抗H.pylori血清识别。结论成功构建了表达NapA的重组乳酸乳球菌菌株,该菌株在H.pylori口服疫苗和黏膜免疫调节研究中具有应用潜力。     

幽门螺杆菌ureI和lpp20乳酸乳球菌表达载体的构建及鉴定

目的 以幽门螺杆菌尿素通道蛋白ureI和外膜脂蛋白lpp20为目的 基因.分别构建乳酸乳球菌表达重组载体pNZS112/ureI和pNZ8112/lpp20,为H.pylori乳酸乳球菌活菌口服疫苗的研制奠定实验基础. 方法 根据幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI和脂蛋白Lpp20的全基因序列,利用PRIMER5.0各设计一对引物,进行PCR扩增,获得ureI和lpp20目的 基因片段,将其与分泌表达载体pNZ8112进行连接,通过电击转化进入宿主菌乳酸乳球菌NZ9000细胞内,通过酶切分析,PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体,并进行重组疫苗菌稳定性检测. 结果以H.pylori标准株基因组DNA为模板分别扩增出特异的ureI和lpp20基因片段,大小分别为588 bp和528 bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori乳酸乳球菌表达重组载体pNZ8112/ureI和pNZ8112/lpp20. 结论 PCR扩增得到了大小约为588 bp和528 bp的H.pylori ureI和lpp20目的 基因片段;并成功构建了幽门螺杆菌ureI及lpp20基因乳酸乳球菌表达重组载体.     

肠道病毒71型感染乳鼠脑组织白介素1β与白介素6水平的研究

目的 检测肠道病毒71型(EV71)感染乳鼠脑组织白介素1β(IL-1β)与白介素6(IL-6)水平变化,探讨EV71致中枢损害可能的发病机制。方法 1日龄120只ICR乳鼠随机分为感染组及对照组。腹腔注射法建立EV71感染乳鼠模型。荧光定量RT-PCR法检测脑组织中EV71载量。光镜观察脑组织病理变化。酶联免疫吸附法(ELISA)检测脑组织匀浆液中IL-6与IL-1β含量。结果 感染组3 d、5 d与7 d乳鼠脑组织匀浆IL-1β浓度较对照组明显升高(P<0.01),感染组3 d、5 d、7 d与10 d乳鼠脑组织匀浆IL-6浓度较对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.01),感染组1 d与14 d乳鼠脑组织匀浆IL-1β及IL-6浓度与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论 EV71感染乳鼠早期脑组织中IL-1β及IL-6含量明显升高,其介导的免疫反应可能是EV71致中枢损害可能的机制之一。     

湖北省2016年手足口病流行病学及病原学特征分析

目的 了解湖北省手足口病例流行病学特征,为下一步制定防控措施提供科学依据。 方法 收集2016年湖北省手足口病的监测数据、实验室手足口监测数据、各级医疗机构报告的手足口病病例对2016年湖北省手足口病例进行流行病学和病原学分析。 结果 2016年湖北省手足口发病高峰分布在5月、6月、10月。从病例数来看,男女性别比为1.46:1;以0~5岁构成比最高,占发病总人数的95.64%;主要发病人群是托幼儿童和散居儿童。2016年实验室共确诊了手足口阳性普通病例10 200例,重症病例137例。普通病例流行主要以其他肠道病毒为主,重症以肠道病毒71型(enterovirus 71, EV 71)为流行株。对2016年重症病例进行了病毒分离,分离到毒株36株,均为EV71型,对毒株进行VP1区核苷酸序列测定和同源性比较及遗传进化分析,其VP1基因型测序结果与我国阜阳、江苏、深圳、北京等地的EV71毒株同源性较高,在96.8%~99.4%之间。 结论 2016年湖北省手足口病流行有明显的季节性、人群性,引起手足口病流行的主要病原体为其他型别肠道病毒,应特别重视对0~5岁年龄组人群手足口病防控工作, 同时加强手足口病监测工作。     

柯萨奇病毒A6外壳蛋白VP1基因重组表达及活性鉴定

目的表达柯萨奇病毒A6(CVA6)外壳蛋白VP1,鉴定重组蛋白免疫活性,为CVA6血清学检测试剂和疫苗研究提供依据。方法利用PCR技术从HN421/HN/CHN/2011河南分离株基因组扩增VP1基因,经酶切连接到表达载体p ET30a中,转化大肠杆菌(BL21DE3);用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的基因表达,并对重组蛋白进行纯化,SDSPAGE和Western blot方法对重组蛋白分析鉴定其免疫活性。结果 PCR方法扩增的VP1基因长度为980 bp;经PCR扩增和测序鉴定插入到表达载体的基因片段与预期目的片段相一致;SDS-PAGE结果显示表达产物分子量为34 k Da;经大肠杆菌高效表达和纯化获得了重组蛋白CVA6-VP1,通过Western blot分析,该重组蛋白与手足口病患者血清反应产生特异杂交带。结论本研究成功克隆并构建了CVA6 VP1基因高效原核表达系统,初步结果显示重组蛋白具有较好的抗原性,为EV71诊断试剂的研究奠定了基础。     

2016—2020年广东省EV71型灭活疫苗疑似预防接种异常反应监测分析

目的 分析广东省肠道病毒71型灭活疫苗（EV71疫苗）上市后疑似预防接种异常反应（AEFI）的发生特征,为该疫苗的推广接种提供参考依据。方法 通过中国AEFI信息管理系统收集2016―2020年EV71疫苗AEFI个案数据,采用描述性流行病学方法进行分析。结果 2016―2020年广东省共接种EV71疫苗8 699 542剂次,报告AEFI 1 607例,报告发生率为18.47/10万剂,其中一般反应、异常反应和偶合症的报告发生率分别为10.89/10万剂、4.60/10万剂和2.89/10万剂。报告的AEFI以一般反应为主（58.93%）,主要症状为发热（93.45%）;81.66%不良反应在接种后<1 d发生。EV71疫苗（Vero细胞）的不良反应发生率（16.48/10万剂）高于EV71疫苗（人二倍体细胞）（14.61/10万剂）,差异有统计学意义（P<0.05）。EV71疫苗第1剂次接种后不良反应发生率（23.39/10万剂）高于第2剂次（12.56/10万剂）（P<0.01）。首剂在6~23月龄接种不良反应发生率最高（21.64/10万剂）,48~59月龄最低（12.87/10万剂）。结论 广东省EV71疫苗AEFI报告发生率和不良反应发生率均较低,具有良好的安全性。     

深圳市某区EV71疫苗接种情况与手足口病发病率分析

目的 分析深圳市某区EV71疫苗接种和手足口病(Hand, foot and mouth disease,HFMD)发病的情况,为该区EV71疫苗接种及更好地防控手足口病提供参考依据。 方法 对该区2014—2017年手足口病发病特征及2016年9月—2018年8月EV71疫苗接种情况进行描述性分析。 结果 该区2014—2017年手足口病累计报告发病数61 619例,报告发病数呈逐年下降趋势;布吉和龙岗街道手足口病累计发病28 857例,占全区病例数的46.83%;2016年9月—2018年8月该区累积报告接种EV71疫苗211 865人次,接种第1剂次121 795人次,接种第2剂次90 056人次。 结论 深圳市某区手足口病发病有明显的季节、区域和人群特点,应加强在易感季节对易感人群的宣教和防护工作;加强对EV71疫苗的宣传,提高其接种率。     

2015—2017年南昌市手足口病疫情病原学分析

目的 分析2015年至2017年南昌市手足口病原学构成,为手足口病疫情的防控提供科学依据。方法 利用商品化试剂对肠道病毒的PE、EV71、CoxA16等基因片段进行检测,对检测结果进行分析。结果 临床诊断为手足口病的实验室确诊病例3年分别为52.2%、59.9%、55.7%;EV71、CoxA16是手足口病的主要病原体,但PE阳性比重较大,3年分别达到45.9%、35.9%、58.5%;发病以3岁以下为主,发病年龄最小的10 d、最大40岁。结论 手足口病发病年龄以3岁以下为主,EV71、CoxA16是主要病原体。     

2011—2018年上海市金山区手足口病病原学监测结果及柯萨奇病毒A6型分离株VP1基因特征分析

目的 了解2011—2018年上海市金山区手足口病病原学特征,分析柯萨奇病毒A6型(coxsackievirus A6, CoxA6)VP1基因特征,为手足口病防控提供理论依据。 方法 对2011—2018年金山区手足口病监测病原学检测情况进行统计分析。CoxA6病毒分离株进行VP1基因核苷酸序列测序,分析其同源性并构建系统进化树。 结果 2011—2018年金山区共采集手足口病例标本1 207例,病原学检测阳性703例,阳性率为58.24%(703/1 207);病原学构成为CoxA6 254例(36.13%)、CoxA16 217例(30.87%)、EV71 162例(23.04%)、CoxA10 18例(2.56%)和其他肠道病毒52例(7.40%)。2011—2013年,EV71、CoxA16、其他肠道病毒为优势病原;2014年起,CoxA6逐渐成为优势病原,2018年占病原学构成达85.43%。EV71发病呈单峰分布,高峰出现在5月;CoxA16呈双峰分布,主高峰出现在6月,次高峰出现在11月;CoxA6呈双峰分布,主高峰出现在11月,次高峰出现在7月。监测点监测2013年出现CoxA6型,疫情监测2014年出现CoxA6型。监测点监测,EV71,CoxA16和CoxA6病原年龄分布主要集中在1~5岁,其中CoxA6还主要集中在7~12岁。疫情监测,EV71、CoxA16、CoxA6病原分布主要集中在小班和中班,其中CoxA6病原分布还集中在小学。基因分析表明,2017—2018年金山区流行的CoxA6型病原基因特征为E2亚型。 结论 2011—2018年金山区手足口病的优势病原已由EV71、CoxA16转变为CoxA6 E2亚型为主。应进一步加强病原监测,尤其加强对7~12岁组病原的监测,及时发现新病原,为落实综合性防控手足口病预防措施提供依据。