兰州羔羊轮状病毒株VP4基因稳定性及基因结构分析

目的了解兰州羔羊轮状病毒（LLR）株VP4基因遗传变异特点及与人源性轮状病毒基因结构上的相关性,为疫苗的质量控制和对人体的免疫原性提供理论依据。方法严格按疫苗生产过程将LLR疫苗株毒种LLR38代在新生牛肾原代细胞传至第49代,取LLR38、LLR43、LLR44、LLR49代进行研究。通过逆转录-聚合酶链式反应获得了LLR株传代病毒VP4全基因的cDNA片段,构建成重组质粒,经酶切筛选,对克隆的VP4基因进行序列测定。结果LLR株VP4基因全长2362bp,编码776个氨基酸。各代次病毒的核苷酸和氨基酸遗传稳定,核苷酸同源性在99．7％-100．0％,氨基酸同源性在99．0％-100．0％。不同P基因型来源轮状病毒在亲缘关系上没有明显的区分。氨基酸序列比对分析显示,LLR株与13株人源病毒在基因结构上密切相关。结论LLR疫苗株vP4基因具有很好的遗传稳定性,LLR株毒种及生产的疫苗是安全有效的,能够预防轮状病毒感染。     

海南省2019—2020年H3N2亚型流感病毒血凝素基因特性

目的 了解海南省2019—2020年H3N2亚型流感病毒血凝素基因遗传进化规律与氨基酸变异情况。方法 选取2019—2020监测年度海南省5家流感监测网络实验室分离的16株H3N2亚型流感毒株进行一代全基因组测序,利用MEGA 10.1.8构建血凝素基因系统进化树,并分析氨基酸位点替换情况,应用DNA Star 7.0.1软件进行血凝素基因同源性分析。结果 系统进化树显示,相比于疫苗株A/Kansas/14/2017 (2019—2020）,16株H3N2亚型流感病毒分离株血凝素基因在进化树上与疫苗株A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016（2018—2019）亲缘关系更近,属于3C.2a1分支,核苷酸与氨基酸同源性范围分别为98.5%~98.9%、97.9%~98.4%。16株分离株在抗原性位点发生8处氨基酸位点替换,涉及5个抗原决定簇;15株分离株在糖基化位点发生2处缺失。结论 2019—2020年监测年度海南省H3N2亚型流感病毒与2018—2019年疫苗株亲缘关系较近,血凝素蛋白抗原性位点在5个决定簇均有变异,易造成较大流行,WHO 推荐的2019—2020年疫苗株保护效果可能不理想。应密切关注H3N2亚型流感病毒的流行与基因变异情况,为流感病毒疫苗株推荐及防控提供科学依据。     

A组人轮状病毒DQ-1株VP7基因序列和蛋白质结构分析

目的研究DQ-1株VP7基因的基因分型,对DQ-1株VP7基因序列和糖蛋白VP7的蛋白质结构进行分析。方法通过RT—PCR技术扩增人A组轮状病毒DQ-1株VP7全长基因,并将RT—PCR产物连接到pMD18-T载体,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上筛选出两个PCR阳性菌落,并提取质粒,双酶切鉴定,最后利用通用引物进行测序。结果DQ-1株VP7基因与同型的我国已测序G1型地方株T73、R96—197株基因序列同源性均为97．6％,与G1型标准株Wa株核苷酸序列同源性为92．9％,与G2血清型代表株Ds—1株基因序列同源性为73．8％,与G3血清型代表株SA11株核甘酸序列同源性为75．6％;其VP7基因mRNA可折叠多达20个发卡结构。DQ-1株氨基酸序列与T73、R96—197株同源性都达97．5％,与Wa株达94．6％,而与其他型Ds-1株、SA11株和J-4621株分别仅为74．4％,79．4％和75．2％。结论DQ-1株属于G1血清型。DQ-1株VP7基因序列与已测序我国G1型地方株VP7基因序列几乎没有差别,而与G1型标准株VP7基因序列存在细微差异。     

海南省2019—2020监测年度A (H1N1) pdm09流感病毒基质蛋白基因特性分析

目的 分析2019—2020监测年度（2019年4月1日—2020年3月29日）海南省A (H1N1) pdm09亚型流感病毒基质蛋白基因（Matrix, M）进化规律和M2蛋白氨基酸位点变异情况。方法 选取14株2019—2020年海南省分离的A (H1N1) pdm09亚型流感病毒进行基因序列测定,采用Neighbor-Joining方法进行种系进化分析,通过系统进化树比较海南流行株与疫苗株的差异。测序结果用MEGA 10.1.8和DNASTAR7.0.1软件进行基因特性分析及基因同源性分析。结果 2019—2020监测年度,海南省A (H1N1) pdm09亚型流感病毒分离株占分离株的4.9%。序列分析显示,海南省A (H1N1) pdm09亚型流感病毒与国际疫苗株A/Brisbane/02/2018的M基因在核苷酸系统进化树6B.1分支上,核苷酸与氨基酸同源性范围为98.7%~100.0%、98.8%~100.0%。12株分离株胞外区编码区S23N氨基酸发生变异;跨膜区14株分离株均发生S31N位点突变,突变率为100.0%;1株I39V位点氨基酸变异;9株分离株在胞浆区E70D位氨基酸位点发生变异。结论 2019—2020监测年度海南省A (H1N1) pdm09亚型流感病毒活动水平较低,与疫苗株相匹配,对金刚烷胺类药物耐药,应特别关注M2蛋白氨基酸变异情况,为临床抗流感病毒药物的使用提供科学依据。     

人轮状病毒非结构蛋白NSP4基因特征的初步分析

目的：初步了解重症腹泻轮状病毒株NSP4基因特征及变异情况，方法：在2002年100例秋冬季腹泻患儿轮状病毒分子流行特征的研究中，确诊为轮状病毒腹泻的10例患儿的粪便标本。用PCR方法对其NSP4基因进行测定，并挑选出一株重症腹泻轮状病毒毒株(简称02′K1)。采用一步法RT-PCR对其NSP4基因进行扩增获得NSP4 cDNA，利用银染测序方法对所扩增获得NSP4 cDNA进行测定，采用Winegene231核酸分析软件对02′K1株NSP4核苷酸序列进行翻译，同时利用Omiga生物软件对02′K1株、ST3株(人轮状病毒G4血清型)及代表NSP4四个主要基因型的之一的Wa株(简称Wa-1株)、Wa-a株、Wa-v株的核苷酸和氨基酸序列进行比较，分析其同源性及02′K1株的NSP4氨基酸变异位点，结果：(1)经一步法RT-PCR扩增获得的NSP4 cDNA约725bp，NSP4基因全长686个核苷酸，含有一个开放读码框架，编码一个由175个氨基酸组成的蛋白；(2)02′K1株与ST3株、Wa-1株、Wa-a株、Wa-v株的核苷酸和氨基酸同源性均达90％以上；(3)与ST3比较，02′K1株的NSP4氨基酸序列有14个位点发生了变异。即aa16、aa26、aa60、aa72、aa76、aa124、aa135、aa140、aa141、aa145、aa146、aa161、aa162、aa169，结论：(1)02′K1株的NSP4基因型属于Wa组；(2)02′K1株的NSP4氨基酸序列有14个位点发生了变异。     

海南省2019—2020年H3N2亚型流感病毒神经氨酸酶基因特性

目的 分析海南省2019—2020年H3N2亚型流感病毒神经氨酸酶基因遗传进化特征与关键氨基酸位点变异情况。 方法 从海南省流感监测网络实验室分离的流感毒株中按照不同时间选取16株H3N2亚型分离株进行一代全基因序列测定,应用DNA Star 7.0.1软件进行神经氨酸酶基因同源性分析,应用MEGA 10.8.1软件构建神经氨酸酶基因系统进化树,并分析耐药性位点与抗原决定位点氨基酸替换情况。 结果 神经氨酸酶基因同源性分析与系统进化分析显示,16株分离株与疫苗株A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016（2018—2019）核苷酸与氨基酸相似性分别为98.5%~99.1%、98.3%~98.7%,进化上属于3c.2a1分支。14株分离株发生神经氨酸酶抗原性位点N329S变异,11株分离株发生E344K变异,未发生耐药性位点氨基酸替换。 结论 2019—2020年海南省流行的H3N2亚型流感病毒属于3c.2a1分支,与2018—2019年疫苗株亲缘关系较近;大部分分离株在神经氨酸酶抗原决定位点发生了一定的改变,但变异程度不大,未发生耐药位点变异。今后应持续加强流感病毒病原学监测,密切关注H3N2亚型流感病毒耐药性基因变异,及时跟踪关键氨基酸位点替换情况,为科学防控提供理论依据。     

一起由两种罕见血清型副溶血性弧菌引起食物中毒事件分析

目的 分析一起由两种罕见血清型混合感染引起的副溶血性弧菌食物中毒病原学的检测结果,为食物中毒病原学检查途径提供依据。方法 对一起在龙门县人民医院就诊食物中毒事件的9例患者采集其肛拭子样本,参照《食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》( GB 4789.7—2013) 等标准进行病原学分析鉴定。结果 本次事件出现临床症状者9例,其中≤20岁2例,20~<40岁1例,40~<60岁4例,≥60岁2例;9份肛拭子样本检出8株副溶血性弧菌,血清分型O2:K28构成比占25.00%(2/8);O8:K21构成比占75.00%(6/8);经PFGE分子分型,2株O2∶K28血清型(VP18171、VP18175)相似度为66.7%;3株O8∶K21血清型(VP18172、VP18173、VP18176)相似度为100.0%,与另外3株O8∶K21血清型(VP18177、VP18174、VP18170)相似度为88.4%~95.2%;药敏试验结果显示,除有1株菌株对氨苄西林、头孢唑林二重耐药、1株菌株对氨苄西林耐药、3株菌株对头孢唑林耐药外,其它菌株对所有测试药物均敏感,无多重耐药现象。结论 此次食物中毒是由O2:K28和O8:K21这两种罕见血清型的副溶血性弧菌混合感染引起的。     

婴幼儿腹泻A组轮状病毒VP7基因型别的研究

目的：研究武汉地区A组轮状病毒基因VP7基因分型情况。方法：利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法将检测出的A组轮状病毒阳性样本用一步多重RT-PCR技术对其进行VP7基因分型研究。结果：武汉地区793份腹泻患儿粪便样本经检测轮状病毒阳性257份，阳性率为32．4％。其中G1型5例(1．9％)，G2型6例(2．3％)，G3型202例(78．6％)，G1与G3混合感染10例(3．9％)，G2与G3混合感染1例(0．4％)，G3与(迅混合感染1例(0．4％)，22例(8．6％)未能分出型别，另外发现非正常G3型10例(3．9％)。结论：武汉地区A组轮状病毒以G3型为主要流行基因型，轮状病毒阳性患儿年龄以7～12个月为主，这对轮状病毒疫苗的研制具有很大的指导意义。     

漳州市肠道病毒71型分离株的VP1区基因特征分析

目的了解漳州市肠道病毒71型分离株的VP1区基因特征。方法对2010年漳州市的5株肠道病毒71型分离株进行VP1区基因全长序列测定,测序结果利用DNASTAR软件进行核苷酸、氨基酸序列分析和同源性比较,并用Mega4．0软件构建系统发生树。结果5株肠道病毒71型分离株的VP1区核苷酸序列全长均为891bp,且与2008年安徽阜阳流行株Fuyang．Anhui．P．R．C-17．08-2的VP1区核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性最高,分别为98．2％-98．8％和99．7％-100．0％。5株肠道病毒71型分离株间的核苷酸序列同源性为97．2％-99．8％．氨基酸序列同源性为99．3％～100．0％。氨基酸在98位和218位这两个位点发生了特异性变异。VP1区基因遗传进化分析表明,漳州市所有分离株均属于C4基因亚型的C4a进化分支。结论5株肠道病毒71型分离株均属于C4基因亚型的C4a进化分支．与2004年以来的中国大陆EV71病毒流行的基因型完全-致。     

河南省柯萨奇病毒A组16型VP4基因特征分析

目的分析河南省手足口病标本分离柯萨奇病毒A组16型(coxsachievirus A 16,CVA16)VP4的基因特征,并比较VP4与VP1遗传进化分析的差异。方法对分离自河南省手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)患儿的8株CVA16,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行VP4区域扩增并对扩增产物进行测序,用分子生物学软件ATGC进行序列拼接,Bioedit比对剪齐,用MEGA 4.0软件进行同源性分析,并与已报道的CVA16标准株序列构建基因进化树。结果河南省8株毒株VP4核苷酸同源性为91.3%~98.1%、氨基酸同源性为100.0%,与国际原型株CA16/G10/RSA/1951(A型)比对,VP4核苷酸同源性为79.7%~82.6%,氨基酸同源性为100.0%;与B1a、B1b和B2型代表株核苷酸同源性分别为92.3%~95.7%、92.8%~98.6%、88.9%~91.8%,氨基酸同源性均为100.0%。河南省分离的CVA16毒株均属于B1亚型,有B1a和B1b两个进化支共同存在和循环,但VP4与VP1的进化树分型不完全一致。结论 VP4基因不能作为CVA16病毒基因亚型分型的依据。     

用DIG标记的寡核苷酸基因探针杂交技术进行人轮状病毒VP7G血清型鉴定

目的：建立用地高辛（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ，ＤＩＧ）标记的寡核苷酸基因探针鉴定Ａ群轮状病毒ＶＰ７Ｇ血清型的分子杂交技术，并应用该技术研究河南Ａ群轮状病毒的Ｇ血清型分布。方法：根据轮状病毒编码糖蛋白ＶＰ７的基因核苷酸序列，选择该基因高保守区序列中与ＶＰ７Ｇ血清型高度相关的核苷酸片段，人工合成，并用ＤＩＧ标记。在优选的杂交条件下进行杂交：结果：①Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３和Ｇ４四种Ｇ血清型特异性寡核苷酸探针只与同血清型的轮状病毒参考毒株杂交，无交叉杂交现象。灵敏度和特异性达到放射性同位素３２Ｐ标记的水平。②１８８份经ＰＡＧＥ确定的轮状病毒阳性标本中，７９份（４２．０％）、３５份（１８．６％）、１５份（７．９％）分别与Ｇ１、Ｇ２或Ｇ３型探针杂交；未检出Ｇ４型；５６份（２９．８％）未能分型；３份分型特殊。结论：该Ｇ血清型分型技术具有高度特异性和灵敏度     

乌鲁木齐腹泻婴幼儿轮状病毒感染的分子特征

目的 分析乌鲁木齐腹泻婴幼儿轮状病毒(Rotavirus,RV)感染流行情况及其基因型特征。 方法 将2007年1~12月收集于乌鲁木齐市第一人民医院(儿童医院)的3 662例5岁以下门诊和住院腹泻患儿粪便标本,采用胶体金法和ELISA法检测RV,并随机选取部分RV阳性样本进行G/P基因分型。 结果 3 662例样本中检出RV阳性1 470例,检出率为40.1%。对其中142例阳性样本(约10%)进行RV PCR基因分型,其中121例婴幼儿阳性分型结果显示:G1型比例最高占36.4%,其次为G3型(20.7%)、G2型(15.7%)和G9型(13.2%),G型混合感染占6.6%,G未能分型9例(7.4%)。P型分型以P[8]为主,占60.3%,其次为P[4](18.2%)和P[6](5.8%),P混合感染占15.7%。最主要的G/P组合为G1P[8](28.1%,34/121),其次是G3P[8](19.8%,24/121)、G2P[4](14.9%,18/121)和G9P[8](8.3%,10/121),并检测到不常见组合基因型如G1P[6]、G1P[4]、G9P[4]和G9P[6]等。21例新生儿(≤28 d)阳性样本的分型结果为:G型以G9为主,占42.9%(9例),其次是G1(4例),G3(3例),G2(1例),G混合感染3例,未能分型1例。P型以P[6]为主,占47.6%(10例),其次是P[8]及Pmixed各5例,P[4]1例。G/P基因型组合以G9P[6]为主(6例),其次G1P[8]、G3P[8]和G1P[6]各2例,G2P[4]和G9P[8]各1例。 结论 本年度轮状病毒流行基因型复杂多样。婴幼儿RV感染以G1P[8]为主,新生儿RV感染则以G9P[6]为主。需警惕婴幼儿RV株与新生儿RV株的交叉混合感染而致新流行株的产生。      

2010年天津市流行的肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型VPl区域序列分析

【目的】研究2010年天津市手足口病患者中肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型的VPl基因特征。【方法】采集60例天津地区2010年手足口病流行期间患儿的粪便标本,分别用EV71和CoxAl6的VPl区域引物对粪样中病毒RNA进行PCR检测。同时选取11株EV71扩增阳性和4株CoxAl6扩增阳性的样本,对其扩增产物的VPl区进行核苷酸序列测定,比照EV71和CoxAl6各基因型进行同源性分析,并构建系统发生树。【结果】从60例手足口病患儿粪便标本共检测出27例EV71阳性和4例CoxAl6阳性。经VPl区测序,11例EV71阳性与EV71C4基因型同源性94．4％～94．8％;4例CoxAl6阳性与CoxAl6C基因型同源性93．4％-94．7％。在系统发生树上,这11株EV71均属于EV71C基因型,与c4亚型属于同一分支;4株CoxAl6均属于CoxAl6的C基因型。【结论】2010年天津市手足口病患者粪便样本中检测出的EV71毒株属于EV71C4亚型,CoxAl6毒株属于CoxAl6C基因型。     

新疆某医院2012-2013年婴幼儿轮状病毒感染基因型哨点监测

目的哨点监测2012-2013年新疆维吾尔自治区人民医院婴幼儿轮状病毒感染基因型情况,为轮状病毒（RV）疫苗的研制和使用提供依据。方法从新疆维吾尔自治区人民医院收集2012年8月至2013年10月5岁以下感染儿科和新生儿科住院腹泻和非腹泻患儿粪便样本203份,用ELISA方法检测轮状病毒,对阳性样本提取RV核酸,应用多重RT-PCR进行G型（VP7）和P型（VP4）基因分型。结果监测期间轮状病毒的检出率为33.5%（68/203）,95.6%的RV阳性患儿≤24月龄,是RV感染的主要对象。对68份RV阳性样本进行基因分型,结果显示：感染儿科婴幼儿在2012年G型以G9（38.1%）为主要流行株,其次是G3（19.0%）、G2（14.3%）和G1（9.5%）,混合感染达19.0%,1例未能分型;P型以P[8]（71.4%）为主,其次是P[4]（14.3%）,混合感染占9.5%,1例未能分型;在2013年G型以G3（34.4%）为主,其次是G9（21.9%）,G1和G2各占3.1%,混合感染型达31.3%,未能分型2例;P型同样以P[8]（78.1%）为主,P[4]和P[6]各占3.1%,混合感染占15.6%。新生儿科新生儿以G9为主导（83.3%,10/12）,1例为混合感染,1例未能分型;婴儿3例,2例G9,1例为G9＋G3混合感染。新生儿P型以P[6]型为主（9/12）,另有P[8]型2例,1例混合感染P[6＋8];3例婴儿均为P[6＋8]型混合感染。G/P组合基因型,感染儿科婴幼儿2012年主要以G9P[8]为主,其次为G3P[8],而2013年变为以G3P[8]为主,其次为G9P[8];新生儿科新生儿主要流行G9P[6],婴儿以混合感染为主。结论 RV仍然是本地婴幼儿腹泻的主要病原。2012-2013年婴幼儿RV G9P[8]型和G3P[8]型交替占主导流行。新生儿RV感染则以G9P[6]型为主要优势株。婴儿与新生儿间RV毒株的混合感染应引起高度关注。     

轮状病毒新型VP6基因的拼接合成和序列测定

目的：设计获得轮状病毒（RV）新型VP6基因．方法：本研究在前期工作的基础上,对RV VP6基因的优化合成方法进行了探索研究．我们应用改良的嵌套式PCR策略,通过逐步拼接法对RV VP6基因进行了优化改造．结果：成功地合成了优化的RV VP6基因cDNA序列,该序列长约1220bp,（G＋C）含量达55％．结论：与野生型RV VP6基因相比,优化合成的RV VP6基因（G＋C）含量提高了约20％,这一工作为新型高效口服RV基因工程疫苗的深入研究奠定了基础．     

重组杆状病毒表达轮状病毒SA11毒株VP4蛋白

从培养的SA11病毒中提取病毒dsRNA作为模板，经逆转录、多聚酶链反应（RT-PCR）获得编码VP4蛋白的全基因，全长2362bp.完整的VP4基因克隆到杆状病毒转移载体pVL-1393中，转染Sf9细胞进行同源重组，用声、杂交法筛选出表达VP4蛋白的重组杆状病毒。表达的VP4蛋白能被抗轮状病毒抗体所识别，表达产量约占总蛋白的10％。用表达的VP4蛋白免疫动物后可产生高水平抗亲本SA11毒株中和抗体。抗体能阻断SA11病毒在MA104细胞上引起的细胞病变（CPE），免疫荧光和Westernblot也证实抗体可特异性识别轮状病毒抗原。结果表明，重组杆状病毒表达的VP4蛋白具有良好的抗原性和免疫原性，可望用VP4基因研制轮状病毒重组疫苗和亚单位疫苗。     

1株表达人轮状病毒VP7的重组腺病毒的生物学特性鉴定

目的对表达轮状病毒VP7基因的1株重组腺病毒rvAdG1VP7(G)的生物学特性进行鉴定,为进一步免疫学研究打下基础.方法用rvAdG1VP7(G)感染293细胞,并分别应用电子显微镜技术以及Southern blot、PCR、RT-PCR和Western blot等分子生物学方法了解rvAdG1VP7(G)的形态、VP7基因整合、遗传稳定性、VP7基因在细胞内转录及表达等有关生物学特性.结果电子显微镜观察表明:rvAdG1VP7(G)具有典型的腺病毒形态;Southern blot、PCR、RT-PCR和Western blot等分子生物学方法分析显示:rvAdG1VP7(G)中确有特异性的VP7基因稳定整合,有较好的遗传稳定性,感染293细胞后能有效转录,可表达轮状病毒主要结构蛋白VP7.结论 rvAdG1VP7(G)具有良好的生物学性质,为进行体内实验研究提供了必要条件.