基于固体培养基的金黄色葡萄球菌计数方法的相关性研究

目的 基于固体培养条件下对金黄色葡萄球菌传统计数方法 的比较研究,并探讨A600值和金黄色葡萄球菌活菌数二者之间的关系.方法金黄色葡萄球菌在固体条件下培养至对数生长期,无菌生理盐水制成菌悬液,采用平板计数法、麦氏比浊法、显微计数法检测菌悬液,同时记录3种方法计数结果 ;在相同培养条件下初步稀释后检测菌液的吸光度(A600)值,取A600值在0.2～1间的菌液进一步稀释并检测A600,同时对各个稀释度的菌液进行平板菌落计数.结果在固体培养条件下,传统细菌计数方法计数结果:显微计数法>平板计数法>比浊法;同时A600值和金黄色葡萄球菌活菌数二者之间呈线性相关,线性回归方程为Y=28.98601X-0.17331,A600值(X),菌液浓度(Y×107cfu/mL).结论 基于固体培养条件下,3种传统计数方法之间存在各自的特点.同时,金葡菌菌液的吸光度与金黄色葡萄球菌活菌数之间呈良好的相关性,适用于金黄色葡萄球菌浓度的测定.     

臭氧化山茶油对金黄色葡萄球菌的体外杀伤效果

目的：探寻油剂体外杀菌效果的检测方法，同时检测臭氧化山茶油对金黄色葡萄球菌的体外杀伤效果。 方法：制备金黄色葡萄球菌悬液，采用三区划线法将金黄色葡萄球菌悬液接种于LB平板，培养过夜后选取21个直径 相同的细菌单克隆，平均分为3组：对照组、基础油(山茶油)组、臭氧油(臭氧化山茶油)组。用无菌环隔离细菌单 克隆，并给予臭氧油等处理，将平板正置培养过夜，次日挑取隔离培养的整个细菌单克隆于5 mL液体LB培基中培养 12 h，然后采取平板计数法和比浊法检测菌液浓度，从而判断臭氧油的杀菌效果。结果：平板计数法和浊度法均显 示，经臭氧油处理后的单克隆重悬培养后，菌液的细菌浓度显著低于对照组和基础油组(P<0.001)。结论：臭氧化山 茶油对金黄色葡萄球菌有显著杀伤作用，单克隆菌落培养法检测油剂体外杀菌作用方法学可靠。     

基于时间、OD600值及平板计数法测定嗜酸乳杆菌数量的方法

目的:通过将平板计数法与紫外分光光度计测定的OD₆₀₀值结合,寻找一种简易的测定嗜酸乳杆菌菌液浓度的方法。方法:①利用紫外分光光度计测定不同时间的嗜酸乳杆菌菌液的OD₆₀₀值;②以10为梯度对原始菌液进行稀释,将稀释菌液取0.1mL培养于固体培养板上,采用平板菌落计数法计算菌落数,根据其稀释倍数和取样接种量可计算出样品中的含菌量。结果:采用紫外分光光度计(OD₆₀₀)与平板计数结合的方法进行菌液浓度的测定,在培养22h,OD₆₀₀值达到1.0时,稀释10⁷倍后菌落计数为3,可计算出原菌液浓度为3×10⁸CFU/mL,再将菌液与培养基取等体积稀释后浓度为1.5×10⁸CFU/mL,即相当于0.5号麦氏浊度标准管的细菌浓度,该浓度是进行纸片法、MIC的适宜细菌浓度。结论:该法简便、高效,准确性较单纯比浊法好,不需特殊仪器,为基础实验可提供帮助。     

淋病奈瑟菌感染小鼠脾脏单个核细胞对NLRP3、IL-1β表达的影响

目的研究淋病奈瑟菌(Ng)感染小鼠脾脏单个核细胞对NLRP3、IL-1β表达的影响。方法通过测定不同稀释度Ng菌液OD₄₅₀值,结合平板菌落计数法,建立淋病奈瑟菌OD₄₅₀值(x)-活菌数(y)回归方程。不同浓度Ng悬液感染小鼠脾脏单个核细胞,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western blot检测NLRP3、IL-1β水平。结果成功建立了淋病奈瑟菌OD₄₅₀值(x)-活菌数(y)回归方程：y=287.65x-30.583。qRT-PCR、Western blot结果显示,以OD₄₅₀值=0.2 Ng悬液感染单个核细胞1 h,NLRP3、IL-1β表达量最高。结论利用OD值计数Ng简便、快捷;NLRP3、IL-1β在Ng感染中起关键作用。     

铜绿假单胞菌及其代谢产物对霍乱弧菌拮抗性作用的实验研究

目的研究铜绿假单胞菌在霍乱弧菌分离、培养过程中对霍乱弧菌的生长是否存在拮抗作用。方法挑取典型的霍乱弧菌和铜绿假单胞菌共同增菌、分离培养,观察分离、培养的结果,并分别用MH琼脂和碱性琼脂进行药敏试验。结果 10株霍乱弧菌和10株铜绿假单胞菌对应等量混合接种于碱性蛋白胨水,37℃培养6h后划线接种碱性琼脂平板,只检出1例霍乱弧菌(O139),碱性蛋白水37℃培养18h后划线接种碱性琼脂平板则未检出霍乱弧菌;将10株霍乱弧菌接种于不同稀释度灭菌前和灭菌后铜绿假单胞菌菌液中,37℃培养6h后划线接种碱性琼脂平板,只有当灭菌前菌液稀释度(1∶12、灭菌后菌液稀释度(1∶4时才能检出霍乱弧菌;强力霉毒和四环素在M-H琼脂和碱性琼脂上对霍乱弧菌抑菌圈的直径分别为16.5mm、11.5mm和7.0mm、6.5mm。结论铜绿假单胞菌及其代谢产物对霍乱弧菌的生长存在拮抗作用;在碱性环境中,强力霉素和四环素对霍乱弧菌的抑制作用明显不如在中性环境中的抑制作用。     

影响人γ—型干扰素基因在工程菌中表达效率的因素研究

本工作研究了影响人γ—型干扰素基因在工程菌中表达效率的3种因素；结果表明：采用M9＋LB发酵培养基，控制工程菌培养时间和温度，即种子菌在LB（Amp）液中30℃生长10h，转入发酵培养基中30℃扩增3h，42℃诱导培养3h，并按种子菌液与发酵培养液2％的比例扩增工程菌，可使发酵菌液中工程菌密度达OD（600）1．6，IFN－γ表达水平占菌体总蛋白的65％～70％，使IFN－γ活性达1．68×107IU／ml。     

结核分枝杆菌休眠菌的复苏培养与初始菌量的关系

目的 探讨复苏因子对结核分枝杆菌休眠菌复苏作用与初始菌量的关系.方法 取培养100 d的陈旧结核分枝杆菌(休眠菌),用7H9稀释成麦氏比浊1 mg/ml,之后倍比稀释成0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 mg/ml.取12支无菌培养管,加入5 ml 7H9培养基并分为2组,每组依次加入上述各浓度结核分枝杆菌,第1组加入复苏因子蛋白质,第2组作为对照加入等体积7H9,37℃培养,分别在15、25、30、35 d检测光密度值,并取1μl培养液涂7H11平板培养,进行菌落计数.重复上述实验.结果 0、15、25、30、35 d分光光度计检测光密度(OD)值结果显示:各浓度组间细菌增殖呈直线正相关性(P<0.05,P<0.01),即复苏因子对不同稀释浓度的复苏作用相同.7H11培养结果和OD值检测结果显示:各组两种方法检测结果呈直线相关性(P<0.05,P<0.01),即两种方法检测结果有一致性.结论 复苏因子对结核分枝杆菌休眠菌的复苏作用与初始菌量无关.     

大鼠化脓性病灶的病原微生物分离与鉴定

两年多来,我们的大鼠一直有皮下化脓性病灶,经微生物分离鉴定证明主要由金黄色葡萄球菌所致。从一例中分离出金葡菌和未知的杆菌。一、病料采集将有化脓灶的大鼠用乙醚麻醉直接取脓针。二、病原微生物的分离与鉴定将采集的病料在无菌条件下用铂金耳取脓汁直接接种在血平板上(兔血+普通琼脂),经37℃24小时培养,挑取平板上可疑菌落后斜面培养基上作纯培养,再做涂片、染色、镜检及生化反应。 1.培养结果:采样5例均系革氏阳性球菌。血平板上金黄色菌落全部溶血、灰白色菌落不溶血。     

不同浓度硒对变形链球菌生长和代谢影响的实验研究

目的:通过观察不同浓度硒制剂对连续厌氧培养的变形链球菌(S.mutans)生长及产酸情况的影响,观察硒对变形链球菌的作用。方法:将复苏的变形链球菌标准株(Ingbritt C),分别等量接种于含不同浓度硒的TS液体培养基中。采用厌氧菌连续培养技术,通过分光光度计检测菌液OD值,绘制生长曲线,并通过pH仪检测菌液pH值;培养24h终止后,接种于平皿进行菌落(CFU)计数。结果:实验组变形链球菌的生长曲线在生长对数期较对照组低(培养第2~8h),硒浓度0.8ppm组菌液OD值低于其他组(P<0.05);各实验组与阴性对照组菌液pH值无明显差别(P>0.05);硒浓度为0.8ppm组菌落计数低于其他实验组与阴性对照组(P<0.05)。结论:一定浓度的硒(0.8ppm)可使变链菌生长受到抑制。值得注意的是,在该组变链菌数目明显减少的情况下,细菌培养液的pH值与其他组无显著性差异,其原因尚待进一步研究。     

两种培养基方法对医院空气检测结果的比较分析

目的：为了探索简便实用的医院空气采样与检测方法。方法：用普通营养琼脂平板和兔血营养琼脂平板对医院环境空气进行沉降采样检测，并对结果进行比较分析。结果：用普通营养琼脂平板进行采样和检验、细菌总数超标率为17．57％，未检出金黄色葡萄球菌，溶血性链球菌；用兔血营养琼脂平板进行采样和检测，细菌总数超标率为18．41％，检出金黄色葡萄球菌5株，溶血性链球菌2株。细菌总数超标率两种平板间差异无显著性（χ^2=0．11，P〉0.05），两种平板上生长的平均菌落数各区间分布的样品比例数差异无显著（r值依次为0．14、0．01、0．31、0．17、0、12、0．10、P值均〉0．05），致病菌的检测两者间差异有显著性（χ^2=7．05，P〈0．05）。结论：兔血营养琼脂平板优于普通营养琼脂平板，可用兔血营养琼脂平板取代普通营养琼脂平板，对医院环境空气进行监测。     

产B型肠毒素金黄色葡萄球菌及其L型某些致病物质的比较

目的：比较产B型肠毒素金黄色葡萄球菌（金葡菌）及其L型的某些致病物质。方法：检测金葡菌L型产生血浆凝固酶、耐热核酸酶及肠毒素B的情况，并与原菌进行比较。结果：金葡菌L型使血浆延迟至24h发生凝固，耐热核酸酶的透明环减小，肠毒素B的光密度（OD）值未见明显减少。结论：金葡菌L型仍能产生致病物质，其致病力减弱。     

金黄色葡萄球菌对人脐静脉内皮细胞、人羊膜细胞细胞骨架重排及其诱导凋亡的作用

目的 探讨金黄色葡萄球菌(S.aureus)入侵人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、人羊膜细胞(WISH)细胞骨架微丝、微管变化及其诱导细胞凋亡作用.方法 常规方法 制备S.aureus悬液,分别感染人脐静脉内皮细胞和人羊膜细胞10、30、60、120 min.采用光学显微镜和荧光显微镜观察S.aureus感染和细胞骨架微丝、微管重排情况;采用DAPI荧光染色和DNA琼脂糖凝胶电泳分析S.aureus对HUVEC细胞诱导凋亡的影响.结果 S.aureus与HUVEC和WISH细胞共育10 min,即有细菌侵入,60 min后,HUVEC和WISH细胞的感染率分别达(54.9±2.4)%和(56.1±2.4)%;入侵HUVEC细胞和WISH细胞10、30、60、120 min时,触发微丝肌动蛋白(F-actin)重排百分率分别为(54.7±2.8)%、(63.0±2.9)%、(71.0±2.6)%、(39.5±2.7)%和(63.3±2.6)%、(65.0±2.9)%、(77.0±2.4)%、(44.0±1.8)%.10、30、60 min的F-actin重排百分率明显高于120 min(P＜0.05),此时微管变化不大;S.aureus感染HUVEC细胞60 min时,DAPI荧光染色和DNA琼脂糖凝胶电泳均可出现细胞凋亡现象.结论 S.aureus在入侵HUVEC和WISH细胞时,可能通过F-actin细胞骨架重排来完成侵袭过程,且细菌侵入60 min后可诱导HUVEC细胞出现凋亡.     

嗜酸乳杆菌部分生理特性的研究

目的：对嗜酸乳杆菌生长曲线等生理特性进行研究,初步掌握该菌的生长、繁殖和代谢规律。方法：按国标GB/T4789.35-2003的方法测定菌落总数。以培养时间为横坐标,pH值、滴定酸度和菌落总数对数为纵坐标,绘制菌株（种）生长曲线。通过测定pH值及OD值,确定菌株（种）的最佳培养条件。通过测定活菌数,确定菌株（种）的接种方法及生长促进因子。结果：综合分析生长曲线,确定嗜酸乳杆菌在5%接种量,37℃下最佳收获期为12h～16h;最佳培养条件：初始pH值5.8,37℃培养;选择4种天然廉价物料（添加剂）作为菌株（种）的促生因子,发现对其生长均有促进作用,影响大小依次为：西红柿汁5%〉香菇汁3%〉胡萝卜汁5%〉啤酒5%〉对照。结论：得到嗜酸乳杆菌的最佳生长条件,为菌液培养、冻干粉制备及活菌制剂打下基础。     

尿路感染分离金黄色葡萄球菌生物膜形成能力及相关基因的分析

目的：探讨尿路感染分离金黄色葡萄球菌的生物膜形成能力及相关基因分布,为预防和治疗临床感染提供理论基础。方法采用标准琼脂平板倍比稀释法检测最小抑菌浓度,菌落计数法检测细菌黏附能力,96孔板结晶紫染色法检测细菌生物膜形成能力,生物膜相关基因检测采用PCR扩增法。结果11株金黄色葡萄球菌临床株对青霉素和红霉素耐药率较高,而对万古霉素和呋喃妥因全部敏感。所有菌株都有较强的黏附能力,而生物膜形成能力一般。其中10株菌株扩增出icaAD和icaBC基因。结论尿路感染金黄色葡萄球菌的黏附能力和生物膜形成能力具有菌株差异性,ica是金黄色葡萄球菌生物膜形成的重要基因。     

参附注射液对缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响

目的:探讨参附注射液对大鼠缺血再灌注心肌细胞Bax、Bcl2及Fas蛋白表达的影响及它们与心肌细胞凋亡的内在联系。方法:健康SD大鼠36只随机分为3组,空白对照组(S组)、缺血再灌注+生理盐水组(I/R组)、缺血再灌注+参附注射液组(SF组),每组12只。采用钳闭左冠状动脉前降支制备心肌缺血再灌注模型。免疫组化检测Bax、Bcl2及Fas蛋白的表达,每组选24个视野分别测量光密度值(OD值)。TUNEL法检测凋亡心肌细胞并计算凋亡指数。结果:I/R组BaxOD值明显高于S组(P<0.01),SF组BaxOD值明显低于I/R组(P<0.01),且低于S组(P<0.05)。I/R组Bcl2OD值高于S组(P<0.05),且SF组Bcl2OD值高于S组(P<0.01),但I/R组与SF组比较差异无显著性。I/R组FasOD值明显高于S组(P<0.01),且明显高于SF组(P<0.01)。I/R组细胞凋亡指数明显高于S组和SF组(P<0.01),而SF组高于S组(P<0.05)。结论:参附注射液增加心肌Bcl2蛋白的表达,降低Bax及Fas蛋白的表达,抑制心肌细胞凋亡,保护缺血再灌注心肌。     

金黄色葡萄球菌诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的观察

目的观察人脐静脉内皮细胞株ECV．304对金黄色葡萄球菌（S．aureus）感染的反应。方法常规方法制备金黄色葡萄球菌悬液,以1：1、1：10和1：100的感染复数感染ECV．304细胞1、3、6、12h和24h后,估算细胞吞噬细菌数,采用Hoechst33258染色,DNAladder及细胞凋亡相关因子RT．PCR检测细菌感染后细胞凋亡情况。结果金黄色葡萄球菌感染复数越高,细胞内吞噬的活细菌数越多。金黄色葡萄球菌感染导致ECV-304细胞发生凋亡,凋亡具有时间依赖性,随着感染时间的延长,凋亡小体增多,DNA片段也随之增多。抗凋亡细胞因子Bcl2mRNA表达量随着感染时间的延长下降,而促凋亡细胞因子Bax和Caspase．3表达量增多。结论金黄色葡萄球菌感染ECV-304细胞后,通过下调抗凋亡细胞因子Bcl2、上调促凋亡细胞因子Bax和Caspase-3诱导细胞凋亡。金黄色葡萄球菌感染内皮细胞的可能致病机制为临床治疗提供了实验依据。     

Preliminary molecular epidemiology of the Staphylococcus aureus in lower respiratory tract infections: a multicenter study in China

Background  Staphylococcus aureus (S. aureus) remains as an important microbial pathogen resulting in community and nosocomial acquired infections with significant morbidity and mortality. Few reports for S. aureus in lower respiratory tract infections (LRTIs) have been documented. The aim of this study was to explore the molecular epidemiology of S. aureus in LRTIs in China.

Methods  A multicenter study of the molecular epidemiology of S. aureus in LRTIs was conducted in 21 hospitals in Beijing, Shanghai and twelve other provinces from November 2007 to February 2009. All the collected S. aureus strains were classified as minimum inhibitory concentration (MIC), mecA gene, virulence genes Panton-Valentine Leukocidin (PVL) and γ-hemolysin (hlg), staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) type, agr type, and Multilocus Sequence Typing (MLST).

Results  Totally, nine methicillin-sensitive S. aureus (MSSA) and 29 methicillin-resistant S. aureus (MRSA) strains were isolated after culture from a total of 2829 sputums or bronchoalveolar lavages. The majority of MRSA strains (22/29) had a MIC value of ≥512 µg/ml for cefoxitin. The mecA gene acting as the conservative gene was carried by all MRSA strains. PVL genes were detected in only one S. aureus strain (2.63%, 1/38). The hlg gene was detected in almost the all S. aureus (100% in MSSA and 96.56% in MRSA strains). About 75.86% of MRSA strains carried SCCmec III. Agr type 1 was predominant (78.95%) among the identified three agr types (agr types 1, 2, and 3). Totally, ten sequence type (ST) of S. aureus strains were detected. A new sequence type (ST1445) was found besides confirming ST239 as the major sequence type (60.53%). A dendrogram generated from our own MLST database showed all the bootstrap values ≤50%.

Conclusion  Our preliminary epidemiology data show SCCmec III, ST239 and agr type 1 of S. aureus as the predominant strains in LRTIs in Mainland of China.

     

藏药六味丁香丸对金黄色葡萄球菌的抑菌作用及机制探讨

目的 研究藏药六味丁香丸对金黄色葡萄球菌的抑菌作用并阐明相关抑菌机制,为其临床应用提供理论依据。方法 采用平板打孔法检测六味丁香丸对金黄色葡萄球菌的抑菌活性,通过倍比稀释法测定最小抑菌浓度范围。绘制药物作用36h的细菌生长曲线。利用扫描电镜观察细胞形态变化和细胞壁通透性实验阐述其抑菌机理。结果 六味丁香丸800mg/mL对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径达到(21.8±2.36)mm,最小抑菌浓度介于12.5～25mg/mL;药物可以显著抑制细菌生长增殖,能够使细胞形态发生改变和细胞通透性增加。结论 六味丁香丸对耐药性金黄色葡萄球菌具有显著抑菌作用,具有潜在的临床应用价值。      

450例重症社区获得性肺炎患儿痰液病原体分布及细菌耐药特点

目的探讨重症社区获得性肺炎（CAP）患儿病原体分布及细菌耐药情况。方法选取2017-2018年收治的重症CAP患儿450例作为研究对象。将1~ < 3岁120例纳入幼儿组,3~ < 6岁151例纳入学龄前组,≥6岁179例纳入学龄组。使用一次性吸痰管吸取口腔内痰液,器械通气的患儿经气管插入导管装置吸取痰液。利用分子生物学检查法来进行检测,以核酸阳性作为病毒标准;使用荧光定量PCR技术检测痰液标本中肺炎支原体;并给予静脉注射头孢呋辛钠、口服阿奇霉素干混悬、机械通气治疗。结果450例患儿痰液中有389例检出病原体阳性,阳性率为86.44%,共检出632种病原体,其中细菌、病毒比例达到56.01%与35.60%。病毒、细菌、肺炎支原体（MP）、沙眼衣原体（CT）、真菌感染在幼儿组、学龄前组、学龄组分布率的差异比较有统计学意义（P < 0.01）,春季、夏季、秋季、冬季的病毒、细菌、MP、CT、真菌感染分布差异比较有统计学意义（P < 0.01）,各季节混合感染差异无统计学意义（P>0.05）;流感嗜血杆菌对氧氟沙星耐药低。大肠埃希菌对亚胺培南、头孢克洛低耐药。肺炎链球菌对万古霉素、利奈唑胺、青霉素不耐药,对阿莫西林低耐药。金黄色葡萄球菌对万古霉素、利奈唑胺不耐药。结论细菌是重症社区获得性肺炎患儿痰液中的主要病原体,幼儿病毒、细菌、MP、CT检出率较高,且细菌耐药情况严峻,推荐在病原检测及细菌耐药实验后根据相关数据使用针对性抗生素。