一种适合膜片钳记录的成年大鼠背根神经节细胞培养方法

目的建立一种适合膜片钳研究的成年大鼠背根神经节（D0rsal root ganglion,DRG）细胞培养方法。方法分离并培养成年大鼠DRG神经元,显微镜下观察培养神经元的形态,膜片钳技术记录培养神经元的基本膜电生理特性及ATP激活电流。结果培养的DRG神经元形态结构完整;其静息膜电位在正常范围内,可记录到诱发动作电位及钠电流;在膜片钳全细胞记录模式下,能稳定地记录到ATP诱发电流。结论培养的成年大鼠DRG神经元适合膜片钳试验。     

用于膜片钳研究的大鼠背根神经节细胞急性分离技术的改良

目的通过技术改良,进一步摸索适于膜片钳实验的成年大鼠背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)细胞的急性分离方法。方法应用显微外科技术获取成年大鼠DRG,采用改良的双酶顺序消化(先胶原酶,后胰蛋白酶)及双血清(胎牛血清+马血清)共同培养法,急性分离培养DRG。倒置显微镜下观察神经元的形态,选取已贴壁的细胞,用全细胞膜片钳技术记录其基本膜电生理特性。加入河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)后再次记录DRG神经元的钠离子电流变化。结果本实验可获得形态良好、结构完整的单个DRG神经元,表面光亮,胞膜完整清晰,呈圆形或椭圆形。其静息膜电位为(55.22±4.39)mV,加入TTX后可记录到缓慢失活的河豚毒素不敏感(tetrodotoxin-resistant,TTX-r)的钠离子电流。其中,中等直径DRG神经元高阻封接成功率为73.2%,高于小直径和大直径DRG神经元的封接成功率(P<0.05)。结论经改良的DRG急性分离方法分离效率高、可操作性强。分离得到的中等直径DRG神经元状态良好,更适合膜片钳实验。     

一种适合膜片钳研究的成年大鼠DRG神经元急性分离方法

目的 建立一种适合膜片钳研究的成年大鼠DRG神经元急性分离方法.方法 采用结合酶消化及机械分离的方法,急性分离成年大鼠DRG神经元,用于膜片钳研究.结果 本方法可分离2～3个月的成年大鼠,不损伤神经元的基本结构和电生理学特性,形态上易于区分.结论 本方法步骤单一,操作简单,分离效率高,适合膜片钳研究.     

糖尿病神经痛中大鼠背根神经节细胞电生理特性的改变

目的通过观察背根神经节细胞的动作电位特征在糖尿病大鼠周围神经病变中的变化,以探讨糖尿病大鼠周围神经病变引起痛觉过敏的发生机制。方法运用全细胞电流钳技术对糖尿病周围神经痛觉过敏大鼠背根神经节细胞进行电生理记录,与正常大鼠比较静息电位水平、动作电位峰值、动作电时程变化、基强度、动作电位爆发阈值。结果与正常组比较,糖尿病神经痛大鼠背根神经节细胞静息电位水平和动作电位峰值无显著差异;大、中、小直径神经元动作电位与正常大鼠比较爆发阈值下降,动作电时程变宽,基强度显著降低。结论糖尿病大鼠周围神经病变引起初级感觉神经元背根神经节细胞的兴奋性增强,这可能是引起糖尿病大鼠周围神经痛觉过敏原因之一。     

急性分离的脊髓腹角神经元膜片钳记录技术

目的:建立急性分离的脊髓腹角神经元膜片钳记录技术以深入研究脊髓腹角神经元上受体的作用。方法:选用6~11 d的新生SD大鼠,麻醉后分离出含腰骶膨大的脊髓,制备切片,给予酶消化,切除背角,将腹角吹打分离出单细胞,进行膜片钳记录。结果:(1)分离的腹角神经元形态良好,胞体呈纺锤形、三角形和多边形伴多条细长突起;(2)7个神经元记录到自发动作电位,其细胞电生理特性为:静息电位(-61.88±16.70)mV;阈电位(-47.39±8.02)mV;锋电位幅值(55.79±17.17)mV;超射(8.39±7.70)mV;放电频率(13.54±9.97)Hz;(3)7个神经元给予1 mmol/L谷氨酸诱发电流幅值(324.56±90.54)pA,翻转电位(19.43±12.10)mV;8个神经元给予2 mmol/L尼古丁诱发电流幅值(296.91±77.44)pA,翻转电位(29.06±14.88)mV。结论:急性分离脊髓腹角神经元膜片钳记录技术切实可行,可用于脊髓腹角神经元相关调质或药物的作用机理研究。     

芍药苷对大鼠背根神经元细胞内Ca2+的影响

摘要：目的：建立一种评价中药活性成分对大鼠背根神经节(DRG)神经元细胞内游离Ca2 浓度影响的方法。方法：显微解剖获取大鼠背根神经节，通过胰蛋白酶消化，过筛，用DF-12和抗有丝分裂培养液交替培养纯化，获得原代大鼠DRG神经元细胞，并采用细胞免疫荧光技术测定DRG神经元细胞纯度；采用激光共聚焦显微成像技术（LSCM），观察细胞内Ca2 荧光强度的变化，并对Ca2 荧光强度变化率进行分析，探讨芍药苷对DRG细胞内游离钙离子浓度及辣椒素受体的影响。结果：采用上述方法分离得到的DRG细胞纯度可高达95%以上，辣椒平可通过阻断辣椒素激活的瞬时受体电位通道（TRPV1）的作用而抑制细胞内Ca2 的增加。芍药苷表现出与CAP类似的作用，可以阻断细胞外Ca2 内流。结论：芍药苷可能是通过作用于TRPV1通道，而抑制DRG细胞内Ca2 大量增加，本方法可以用于评价药物对大鼠DRG细胞内Ca2 浓度的影响。     

华蟾素对骨癌痛大鼠背根神经节细胞瞬时外向钾通道电流的影响

目的观察华蟾素对骨癌痛（CIBP）大鼠背根神经节细胞瞬时外向钾电流（IA）的影响,探讨华蟾素可能的镇痛机制。方法 急性分离SD大鼠背根神经节（DRG）细胞,应用全细胞膜片钳技术记录华蟾素对骨癌痛大鼠DRG细胞IA的影响。结果骨癌痛 大鼠背根神经节细胞IA电流密度减小,激活曲线向右移动,失活曲线向左移动;华蟾素能调节骨癌痛大鼠背根神经节细胞IA电 流密度,并且逆转骨癌痛IA电流激活和失活曲线的改变。结论在大鼠胫骨内注入肿瘤细胞后,DRG神经元IA电流减小;华蟾素 可能通过调节大鼠背根神经节细胞IA电流激活和失活特性,该作用可能与它的镇痛机制有关。     

康泰胶囊对肠易激综合征内脏高敏感性大鼠背根神经元兴奋性的影响

【目的】观察康泰胶囊对肠易激综合征(IBS)内脏高敏感性大鼠结肠背根神经元(DRG)兴奋性的作用,探讨康泰胶囊治疗IBS的作用机制。【方法】选用SD大鼠,随机分为正常组、模型组、康泰胶囊组(剂量为6.06 g/kg)、匹维溴铵组(剂量为50 mg/kg),除正常组外,其他组大鼠均采用慢性不可预计条件应激法复制内脏高敏感性IBS模型,根据腹部回缩反射(AWR)结果评估模型内脏敏感程度,分离模型大鼠背根神经元,应用膜片钳全细胞记录技术测定背根神经元的基电流强度和2倍基电流刺激下神经元反应,观察康泰胶囊对内脏高敏感IBS大鼠结肠背根神经元电生理特性的影响。【结果】康泰胶囊可以显著降低模型大鼠AWR评分(P<0.05或P<0.01),显著升高结肠DRG的基强度(P<0.01),显著减少2倍基强度刺激产生的动作电位数(P<0.01)。【结论】抑制应激引起的内脏高敏感IBS大鼠结肠背根神经元兴奋性增高可能是康泰胶囊治疗IBS的作用机制之一。     

离体背根神经节细胞膜电学特性的测量及其应用

本文介绍了蟾蜍及新生大鼠离体背根神经节神经细胞膜电位及诱发动作电位的细胞内记录方法以及膜电导,翻转电位等电学特性的测量。应用上述方法测得蟾蜍DRG细胞膜输入电阻为30～40MΩ,新生大鼠的输入膜电阻为45～70MΩ;α_1肾上腺素能受体激活引起DRG细胞膜去极化反应时,膜电导减小.而α_2-肾上腺素能受体激活引起细胞膜电位超极化反应时,膜电导增加。去甲肾上腺素引起DRG细胞膜去极化反应的平均翻转电位值为-88.5mV。这些方法为神经细胞的某些电学特性、神经递质及受体等方面的研究提供了基本的实验手段。     

利鲁唑对大鼠背根节神经元诱发簇放电的抑制作用及电流机制

目的 探讨利鲁唑（riluzole）对慢性背根节压迫（chronic compression of dorsal root ganglion,CCD）模型大鼠背根节（dorsal root ganglion,DRG）神经元诱发簇放电（evoked-bursting,EB）的抑制作用及电流机制.方法 33只健康SD大鼠,随机分为正常对照组（n=13）及CCD模型组（n=20）,进行离体膜片钳全细胞记录.结果 CCD术后DRG神经元EB发生率增高,达53%（44/83）,与正常对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）;DRG局部给予利鲁唑（1、10、100 μmol/L）浓度依赖性抑制持续性钠电流（persistent sodium current,INaP）,100 μmol/L利鲁唑可抑制阈下膜电位振荡幅度及EB放电.结论 利鲁唑通过阻断INaP抑制EB放电而发挥外周镇痛作用.     

糖尿病大鼠背根神经节神经元TTX-R钠离子通道电流变化及意义

目的:通过研究大鼠糖尿病神经病理性疼痛(DNP)中背根神经节(DRG)神经元TTX-R钠离子通道特征的变化,以探讨此疾病引起痛觉过敏可能的发生机制。方法:8只SD大鼠腹腔注射链尿佐菌素诱导制作糖尿病神经病理性疼痛模型(DNP组),取L5⁶DRG,贴壁消化法行神经元培养,电生理全细胞膜片钳记录离子通道电流;8只同月龄大鼠为正常对照。结果:大鼠糖尿病神经病理性疼痛小直径DRG神经元TTX-R INa电流密度较对照组增高。与对照组比较激活曲线向超极化移动3.9 mV(P<0.05),DNP组具有重复放电的神经元的比率增加。结论:大鼠糖尿病神经病理性疼痛小直径DRG神经元TTX-R钠通道电流的变化是痛觉过敏形成的原因之一。     

miR-340对背根神经节神经元兴奋性和钠通道电流的作用

目的：观察miR-340对小鼠背根神经节神经元兴奋性和电压依赖性钠通道电流的作用。方法：采用全细胞膜片钳技术记录神经元放电和钠通道电流。结果：在给予miR-340-3p前DRG神经元的膜静息电位为-49.50±4.76 mV,灌流miR-340-3p后膜的静息电位为-52.13±5.32 mV,差异无统计学意义（P＞0.05）,提示miR-340未影响神经元静息膜电位。在给予miR-340-3p前诱发动作电位数为1.8±0.75个,灌流miR-340-3p后诱发动作电位数为5.6±0.51个,差异具有统计学意义（P＜0.05）,提示miR-340可增高神经元诱发放电频率。电流-电压曲线表明在激活电压从-30 mV至0 mV时,miR-340-3p明显增加钠通道电流密度,差异具有统计学意义（P＜0.05）。激活曲线也表明,miR-340-3p使钠通道激活曲线左移,半激活电压从-22.6 mV增加至-27.4 mV。结论：miR-340对背根神经节神经元的兴奋作用可能是介导坐骨神经损伤神经病理性疼痛的机制之一。     

A型肉毒毒素对大鼠受损背根节神经元放电和交感-感觉耦联的影响

目的 研究A型肉毒毒素(BTXA)对慢性压迫背根节(DRG)神经元(慢性神经痛模型)的自发放电和交感-感觉耦联的影响.方法 采用单纤维记录神经元自发放电的方法,在受损DRG上加BTXA,观察BTXA对DRG神经元自发放电的影响.电刺激腰交感神经干,观察交感刺激对受损DRG神经元放电的调节作用,静脉注射BTXA后,再观察交感刺激对受损DRG神经元放电的影响.结果 慢性压迫DRG神经元有丰富的自发放电,47个受损DRG神经元放电对无钙人工脑脊液有显著的兴奋反应,但BTXA对这些神经元的自发放电无影响.64%的受损DRG神经元对腰交感神经干电刺激有反应,交感刺激对受损DRG的这种作用可被静脉注射BTXA所阻断.结论 BTXA对慢性压迫DRG神经元的自发放电无影响.在慢性压迫DRG神经元上存在交感-感觉耦联现象,BTXA可以阻断这种交感-感觉耦联现象.     

大鼠脊髓背根神经节内神经前体细胞的观察

目的:探讨大鼠脊髓背根神经节(DRG)内是否存在神经前体细胞.方法:取成年和胚胎大鼠DRG冰冻切片,进行Brdu,Nestin,P75免疫荧光组织化学检测,分别取成年和胚胎大鼠DRG进行原代细胞培养,观察其增殖与分化情况,并行Nestin免疫组织化学和Brdu,P75,NF,GFAP免疫荧光组织化学鉴定.结果:在成年和胚胎大鼠DRG冰冻切片上均见有Brdu/Nestin和Nestin/P75免疫荧光双标细胞.细胞培养观察到取自DRG的细胞有分裂增殖,呈Nestin免疫组织化学阳性反应和Brdu,P75免疫荧光组织化学阳性反应;培养第三代细胞加入胎牛血清后出现分化,分化细胞呈NF和GFAP免疫荧光组织化学阳性反应.结论:大鼠DRG内存在有分裂增殖的神经前体细胞,这些细胞可以分化为神经元和神经胶质细胞.     

NAD延缓背根神经节轴突变性的实验研究

目的探讨烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)对神经轴突变性的保护作用。方法用长春新碱处理原代培养的背根神经节细胞,建立轴突变性细胞模型,然后加入不同浓度的NAD,观察神经轴突生长状况,MTT检测背根神经节细胞的生长活性,行神经丝蛋白（NF）免疫组化染色观察神经轴突的变化。结果损伤组加入长春新碱8?h后,轴突远端发生典型的轴突变性,12?h后轴突肿胀,断裂,24?h后见不到完整的轴突结构。保护组加入NAD后可明显延缓轴突变性,在12?h后仍能保持比较完整轴突结构,24?h后远端发生轻微变性。MTT结果显示：NAD保护组可提高细胞存活率（P<0.01）。轴突计数显示：NAD保护组在加入长春新碱后12?h,只有35%左右的轴突发生变性,而损伤组却高达60%的轴突发生了变性（Ｐ<0.01）。结论NAD对轴突变性具有明显的保护作用,可延缓轴突变性。     

Biocompatibility evaluation of electrospun aligned poly(propylene carbonate) nanofibrous scaffolds with peripheral nerve tissues and cells in vitro

Background  Peripheral nerve regeneration across large gaps is clinically challenging. Scaffold design plays a pivotal role in nerve tissue engineering. Recently, nanofibrous scaffolds have proven a suitable environment for cell attachment and proliferation due to similarities of their physical properties to natural extracellular matrix. Poly(propylene carbonate) (PPC) nanofibrous scaffolds have been investigated for vascular tissue engineering. However, no reports exist of PPC nanofibrous scaffolds for nerve tissue engineering. This study aimed to evaluate the potential role of aligned and random PPC nanofibrous scaffolds as substrates for peripheral nerve tissue and cells in nerve tissue engineering.

Methods  Aligned and random PPC nanofibrous scaffolds were fabricated by electrospinning and their chemical characterization were carried out using scanning electron microscopy (SEM). Dorsal root ganglia (DRG) from Sprague-Dawley rats were cultured on the nanofibrous substrates for 7 days. Neurite outgrowth and Schwann-cell migration from DRG were observed and quantified using immunocytochemistry and SEM. Schwann cells derived from rat sciatic nerves were cultured in electrospun PPC scaffold-extract fluid for 24, 48, 72 hours and 7 days. The viability of Schwann cells was evaluated by 3-[4,5-dimethyl(thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl] tetrazolium bromide (MTT) assay.

Results  The diameter of aligned and random fibers ranged between 800 nm and 1200 nm, and the thickness of the films was approximately 10–20 μm. Quantification of aligned fiber films revealed approximately 90% alignment of all fibers along the longitudinal axis. However, with random fiber films, the alignment of fibers was random through all angle bins. Rat DRG explants were grown on PPC nanofiber films for up to 1 week. On the aligned fiber films, the majority of neurite outgrowth and Schwann cell migration from the DRG extended unidirectionally, parallel to the aligned fibers. However, on the random fiber films, neurite outgrowth and Schwann cell migration were randomly distributed. A comparison of cumulative neurite lengths from cultured DRGs indicated that neurites grew faster on aligned PPC films ((2537.6±987.3) μm) than randomly-distributed fibers ((493.5±50.6) μm). The average distance of Schwann cell migration on aligned PPC nanofibrous films ((2803.5±943.6) μm) were significantly greater than those on random fibers ((625.3±47.8) μm). The viability of Schwann cells cultured in aligned PPC scaffold extract fluid was not significantly different from that in the plain DMEM/F12 medium at all time points after seeding.

Conclusions  The aligned PPC nanofibrous film, but not the randomly-oriented fibers, significantly enhanced peripheral nerve regeneration in vitro, indicating the substantial role of topographical cues in stimulating endogenous nerve repair mechanisms. Aligned PPC nanofibrous scaffolds may be a promising biomaterial for nerve regeneration.

     

Primary culture and identification of sinoatrial node cells from newborn rat

Objective To establish a reliable approach to primary culture and identification of sinoatrial node (SAN) cells.Methods The SAN cells were cultured from SAN tissue removed from neonatal Wistar rats and purified with differential attachment and 5’-bromodeoxyuridine (BrdU) treatment. The obtained cells were morphologically observed with inverted microscopy and transmission electron microscopy. Its action potential was recorded using electrophysiological methods.Results Three distinctly different cells were observed in the cultured SAN cells: spindle, triangle and irregular. Of these, the spindle cells comprised the greatest proportion, with their shape, structure and electrophysiological characteristics consistent with those of the pacemaker cells of SAN. The triangle cells were similar in features to the similarly shaped myocytes located in the atrial myocardium.Conclusions The culture method of differential attachment combined with BrdU treatment is a reliable approach to growing SAN cells. Of the cells cultured from SAN, the spindle cells appear to function as pacemaker cells.     

成年豚鼠膀胱ICCs细胞起搏电流的鉴定

目的 确定成年豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞(interstitial cells of cajal,ICCs)细胞是否具有起搏电流.方法 采用胶原酶消化法,得到原代培养的成年豚鼠膀胱ICCs细胞.采用膜片钳技术,在全细胞记录模式下,记录其超级化激活的内向电流(hyperrepolarization-activated inward current,Ih).结果 原代培养的ICCs细胞和逼尿肌细胞的静息膜电位、膜电容存在明显差异;ICCs细胞可记录到起搏细胞特征电流Ih,而在逼尿肌细胞则记录不到.结论 记录到成年豚鼠膀胱ICCs细胞具有起搏细胞的特征电流Ih,提示ICCs细胞在膀胱具有起搏作用.