IL2、IL15对NK细胞KIR3DL1、NKG2D表达的影响

目的研究细胞因子IL-2、IL-15对人外周血来源的自然杀伤细胞（Nature Killer,NK）细胞表面功能相关分子杀伤细胞免疫球蛋白样受体（Killer Cell Immnoglobulin-like Receptor,KIR3DL1）、NKG2D表达的影响。方法采用miniMACS免疫磁珠从外周血单个核细胞（PBMNC）分选得到纯化的NK细胞,在IL2、IL15作用下培养15d,检测培养前后在不同效靶比下对靶细胞（K562）的杀伤作用变化,之后流式细胞仪检测培养前后NK细胞KIR3DL1、NKG2D表达变化;结果经IL2、IL15培养15d后的NK细胞对K562细胞的杀伤率在不同效靶比下均较培养前增强（P〈0.01）;同时NK细胞KIR3DL1表达下降约10%（P〈0.05）,NKG2D在培养前后均高表达（99%）;结论经IL2和IL15长期体外培养后,KIR3DL1表达轻微下调,是NK细胞杀伤功能增强的原因之一。     

KIR基因家族的研究进展

自然杀伤细胞（natural killer cell．NK cell）能够识别“自己”和“非己”的特性。主要通过其表面的杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer-cell immunoglobulin-like receptor，KIR）激活性受体和抑制性受体来执行。KIR是表达在NK细胞和部分T细胞表面的一类受体。正常情况下。机体组织细胞表面可表达自身正常主要组织相容性复合体（major histocompability complex。MHC）Ⅰ类分子．这时KIR抑制性受体占主导地位．表现为NK细胞失活．自身组织细胞不被破坏。病毒感染细胞和肿瘤细胞表面MHCI类分子表达减少、缺失或由于MH0I类分子结构发生异常．影响NK细胞抑制性受体对相应配体的识别．此时NK细胞激活性受体的作用占主导地位．表现为NK细胞活化并显示杀伤活性。从而导致病毒感染细胞和肿增细胞坏死或凋亡。     

异基因造血干细胞移植中同种异体NK细胞的临床应用及研究进展

杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)识别并与靶细胞表面人类白细胞抗原(HLA)Ⅰ类分子结合后转导活化性或抑制性信号,从而调节自然杀伤(NK)细胞活性。在异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)中,当KIR识别的HLA配体缺失时,NK细胞的同种异体反应性被激活,并特异性杀伤靶细胞。NK细胞KIR分子与靶细胞HLA分子特异性识别机制参与移植物抗白血病(GvL)效应和移植物抗宿主病(GvHD)。同种异体NK细胞介导的GvL效应和降低的GvHD发生率使其适合移植。现就allo-HSCT中同种异体NK细胞的临床应用及研究进展予以综述。     

KIR基因多态性与肾移植研究进展

近年发现自然杀伤(NK)细胞及杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)能识别HLA-I类分子,传导激活或抑制信号,从而调节NK细胞和T细胞的活性,在血液干细胞移植与移植物抗宿主病等中发挥重要的作用。现综述NK细胞和KIR的作用、KIR基因多态性及有关肾移植的研究进展。     

人鼻咽癌细胞株CNE2对NK细胞KIR/NKG2D受体的免疫编辑作用及其对NK细胞杀伤功能的影响

目的 探讨NK细胞与表达NKG2D配体的人鼻咽癌细胞株CNE2混合培养后4、24、48h时KIR、NKG2D的变化及其对NK细胞杀伤CNE2细胞活性的影响.方法 PCR-SSP法检测CNE2细胞HLA-A、B、Cw表型、NK细胞KIR表型(选择3例健康者为试验对象),流式细胞仪检测对照组(新鲜分离的NK细胞)KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、NKG2D的表达情况.IL2组(IL2培养的NK细胞)、CNE2组(CNE2、IL2、NK细胞混合培养)培养后4、24、48 h时KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、NKG2D的表达情况,LDH释放法测定IL2组及CNE2组培养24 h后的NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性.结果 CNE2细胞表面HLA-A、B、Cw表型为A2,24;B18,35;Cw4,7.3例健康者均表达KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1.CNE2组4、24、48 h时KIR2DL1、KIR2DL3表达较对照组、IL2组明显升高(P＜0.01),NKG2D表达较对照组、IL2组明显降低(P＜0.01),KIR3DL1表达与对照组、IL2组相比无明显变化(P＞0.05).IL2组4、24、48 h时KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1及NKG2D表达与对照组相比无明显变化(P＞0.05).IL2组、CNE2组培养24 h后的NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性在效靶比10∶1时分别为(26.%±1.47)%和(2.74±1.64)%,两者相比差异有统计学意义(P＜0.01);效靶比20∶1时分别为(35.74±3.59)%和(4.57±2.41)%,两者相比差异有统计学意义(P＜0.01).结论 NK细胞与NKG2D配体阳性的肿瘤细胞持续性接触,下凋NK细胞表面NKG2D表达,上调NK细胞表面与HLAⅠ类分子相结合的KIR表达,导致NK细胞对靶细胞杀伤活性减低.本研究阐明了编辑后的NK细胞杀伤活性减低的分子基础,同时提示阻断HLAⅠ类分子与KIR的结合或者增强NK细胞表面NKG2D的表达将有利于提高NK细胞杀伤肿瘤细胞的活性.     

KIR/HLA受配体模式及抑制性KIR的表达对单倍体造血干细胞移植的影响

目的探讨杀伤细胞免疫球蛋白样受体/人类白细胞抗原（KIR/HLA）受配体模式及移植后抑制性杀伤免疫球蛋白类受体（iKIR）的表达对单倍体造血干细胞移植预后的影响。方法采用序列特异性引物聚合酶链反应（SSP-PCR）方法,对14对HLA半相合供/受者移植前进行KIR与HLA分型,同时分析KIR/HLA的受配体模式,用四色流式细胞技术对其中8例患者在移植后检测CD158a（KIR2DL1）、CD158b（KIR2DL2）、CD158e（KIR3DL1）的表达。结果 3例受者表达供者所有iKIR相应配体HLA-C2、C1、Bw4,此3对供受者即为KIR配体相合组;另外11对存在KIR配体缺失的供受者则为KIR配体迷失组。KIR配体迷失组患者移植后中性粒细胞及血小板重建时间较KIR配体相合组均较晚,但差异无统计学意义（P〉0.05）。KIR配体迷失组患者移植后2年持续缓解率和2年总生存率高于KIR配体相合组,但差异无统计学意义（P〉0.05）。移植后监测iKIR发现受者均表达供者型iKIR,4例患者复发时监测NK细胞及iKIR表达明显降低。结论在HLA半相合造血干细胞移植中,移植后动态监测iKIR的表达可预示复发,KIR/HLA受配体错配可能有助于提高移植后缓解率和总生存率。     

NKG2D配体在耐药鼻咽癌细胞的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响

目的 探讨NKG2D的主要活化性配体在鼻咽癌亲本细胞CNE2和多药耐药细胞CNE2/DDP的表达及其对自然杀伤(NK)细胞杀伤活性的影响.方法 流式细胞仪检测NKG2D的主要活化性配体MHC-Ⅰ类链相关蛋白A和B(MICA、MICB)、UL16结合蛋白1-3(ULBP1、ULBP2、ULBP3)在CNE2、CNE2/DDP细胞的表达情况;PCR-SSP法检测CNE2、CNE2/DDP细胞HLA-A、B、Cw分型和NK细胞KIR分型;LDH释放法测定5例健康者的NK细胞在不同效靶比时对CNE2、CNE2/DDP细胞的杀伤活性;效靶比20∶1时观察不同单抗对NK细胞杀伤CNE2、CNE2/DDP细胞活性的阻断作用.结果 CNE2、CNE2/DDP细胞HLA分型为A2,24,B18,35,Cw4,7;5例健康者的NK细胞表达KIR2DL1,KIR2DL3,KIR3DL1,KIR3DL2与CNE2、CNE2/DDP细胞表面的HLA-I类分子之间存在错配.CNE2、CNE2/DDP细胞均表达NKG2D的配体MICA、MICB、ULBP2,均不表达ULBP1、ULBP3;CNE2细胞MICA、MICB的表达率与CNE2/DDP细胞相比差异有统计学意义(P＜0.01).效靶比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1时NK细胞对CNE2、CNE2/DDP细胞的杀伤活性分别是(10.50±2.17)%、(4.98±0.95)%;(27.68±1.47)%、(15.48±2.10)%;(36.99±3.13)%、(28.46±4.30)%;(55.00±2.20)%、(40.95±2.21)%.在各效靶比时NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性与CNE2/DDP细胞相比差异有统计学意义(P＜0.01);效靶比20∶1时anti-MICA、anti-MICB、anti-ULBP2单抗可明显抑制NK细胞对CNE2、CNE2/DDP细胞的杀伤活性,与阻断前相比差异有统计学意义(P＜0.05);anti-ULBP1、anti-ULBP3单抗不能阻断NK细胞对CNE2、CNE2/DDP细胞的杀伤活性.结论 NKG2D的主要活化性配体MICA、MICB在CNE2、CNE2/DDP细胞的表达差异与NK细胞的杀伤活性有关,肿瘤细胞在发生多药耐药的同时获得了免疫逃避能力.     

KIR2DL3/HLA-C1基因组合与HCV感染相关性研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)感染是一个全球性的健康难题,丙型肝炎引起的肝硬化相关性死亡已经成为肝病中重要的病因之一。研究表明,人类白细胞抗原(HLA)以及其特异配体杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)与HCV感染具有相关性,其中KIR2DL3和HLA-C1与HCV感染的相关性已经得到证实。KIR2DL3和HLA-C1结合的亲和力低,减少了自然杀伤细胞的抑制作用,间接影响机体对HCV感染的免疫能力。该文将从KIR2DL3和HLA-C1在人群中的发生率、HCV感染过程中抗病毒免疫以及对肝移植后HCV再感染的影响等几个方面进行综述。     

KIR基因多态性与肝移植研究进展

杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer immunoglobulin-like receptor,KIR）为免疫球蛋白超家族成员,KIR基因具多态性,在自然杀伤（natural killer,NK）细胞表面通过不同的表达组合,与HLA-I类分子结合,传导激活或抑制信号,调节NK细胞的活性,在造血干细胞移植、实体器官移植的过程中发挥重要的作用。本文综述近年来有关NK细胞受体KIR与其配体的相互作用在临床肝移植中的研究进展。     

KIR3DS1与HLA-BBw4在广东汉族人群中的分布

目的:研究KIR3DS1与HLA-BBw4正常广东汉族人群中的分布状态.方法:对92例广东汉族干细胞移植供者以序列特异性引物扩增技术(PCR-Sequence Specific Primer)分析KIR3DS1和HLA-B表型;根据BW特异性分类,对HLA-BBw4第80位氨基酸残基为异亮氨酸者指定为HLA-BBw480ILE;依靠计算机软件进行KIR3DS1和HLA-BBw480ILE统计.结果:实验发现,在广东汉族人群中KIR3DS1、HLA-BBw4、HLA-BBw480ILE的表现频率依次为0.228,0.652,0.543;其中12.0%的个体为HLA-BBw4纯合子,14.1%的个体同时表现HLA-BBW480ILE和KIR3DS1,另外有8.70%单独表现KIR3DS1而不表现HLA-BBw480ILE.结论:在广东汉族人群中,只有14.1%的个体同时表达HLA-BBw480ILE和KIR3DS1,而单独表达2KIR3DS为18.70%.     

HBV整合引起HepG2细胞microRNA表达谱变化分析

目的 分析HBV整合后引起的肝细胞microRNA表达谱的变化情况.方法 利用microRNA芯片,以稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞为HBV感染模型,以HepG2细胞为对照,分析二者microRNA表达谱的异同,得到因HBV感染而产生变化的microRNA;并用定量PCR技术来验证结果的可靠性.结果 通过microRNA芯片分析和定量PCR验证,HBV感染后可使hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-24、hsa-let-7a、hsa-let-7c、hsa-let-7f和hsa-miR-23b 6种microRNA下调,使hsa-miR-194、hsa-miR-200a和hsa-miR-345 3种microRNA上调.结论 HBV整合后,可引起肝脏细胞microRNA表达谱变化.     

坐骨神经缺损1周背根神经节组织中microRNA的表达变化

目的：研究大鼠坐骨神经缺损后背根神经节中microRNA（miRNA）的表达变化。方法：采用miRNA芯片检测神经缺损0 d（对照组）和7 d（实验组）背根神经节组织中miRNA的表达情况,应用Real time Taqman PCR对芯片结果进行验证。结果：实验组与对照组比较发生上调1.4倍和下调〉1%以上的miRNA分别有13个和5个,Real time TaqmanPCR检测的4个miRNA的表达变化与芯片一致（上调：miR-21,miR-221;下调：miR-500,miR-551b）。结论：大鼠坐骨神经缺损1周后背根神经节组织中miRNA的表达谱发生改变。     

microRNA-1271靶向调控白血病细胞CYLD蛋白的表达

目的探讨人白血病细胞中微小RNA(microRNA)-1271对CYLD蛋白表达的调控作用。方法 qRT-PCR检测microRNA-1271在不同的人白血病细胞系、临床初诊未治的几种类型原代白血病细胞、正常人外周血单个核细胞中的表达差异,利用 Targetscan 信息学预测软件预测 microRNA-1271靶向CYLD基因,构建携带靶基因野生型及突变型3’非翻译区(3’UTR)(缺失了整段预测的microRNA-1271结合序列)的双荧光素酶报告基因质粒,采用脂质体 Lipo-fectamine 3000包裹双荧光素酶重组质粒及 microRNA-1271模拟物(mimic)或阴性对照,共转染HEK293A细胞,应用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定荧光素酶活性。 FAM标记的microRNA-1271抑制物和阴性对照分别核转染至人白血病细胞系K562细胞,Western blot法检测CYLD蛋白水平的表达变化。结果 microRNA-1271在不同人白血病细胞系以及临床初诊未治的原代白血病细胞中的表达均明显高于正常人外周血单个核细胞,双荧光素酶报告基因实验验证CYLD是 microRNA-1271的潜在靶基因;K562细胞中转染microRNA-1271抑制物下调 microRNA-1271后, Western blot法检测结果显示CYLD蛋白水平明显上调。结论人白血病细胞中microRNA-1271的表达上调,下调microRNA-1271后可以促进靶基因CYLD蛋白的表达, microRNA-1271有可能成为白血病治疗的新靶点。     

食管癌中microRNA表达的研究进展

microRNA是一类小的非编码蛋白质的RNA,17～25个核苷酸长度,在物种进化中相当保守,其功能通过与靶基因mRNA的3′-UTR配对起负调控基因表达作用,从而调节细胞的代谢、增殖、分化和凋亡等过程.目前认为microRNA在食管癌的发生、发展过程中,起到与癌基因或抗癌基因相似的作用.本文对microRNA功能、microRNA表达与食管癌的关系,以及研究microRNA表达的研究方法等进行综述.     

糖尿病小鼠心肌组织microRNA表达谱分析

目的 观察中晚期糖尿病模型小鼠心肌组织microRNA（miRNA）表达,对差异miRNA调控的靶基因进行初步预测。方法 15只C57小鼠经腹腔一次性注射链脲佐菌素（STZ）建立糖尿病小鼠模型（模型组,n=15）,以10只未建模小鼠作为对照组。建模后8周末,超声心动图检测小鼠心脏功能指标,包括左室射血分数（EF）、左室短轴缩短率（FS）和左心室质量指数（LVWI）。动物处死后留取并制备心肌组织标本,HE染色光学显微镜观察心肌细胞形态,并结合相关软件定量分析心肌细胞面积改变;采用微距阵基因芯片技术筛选糖尿病模型小鼠心肌组织差异表达的miRNA,Real-Time PCR验证结果,并对差异miRNA调控的靶基因进行生物信息学分析。结果 建模8周末,超声心动图检测显示,模型组小鼠EF和FS明显小于对照组,LVWI显著大于对照组;差异均有统计学意义（P<0.05）。组织学观察发现,模型组小鼠心肌细胞肥大明显。基因芯片检测并经Real-Time PCR验证发现,模型组小鼠心肌组织中有16个差异表达的miRNA,其中miR-195、miR-199a-3p、miR-700、miR-142-3p、miR-24、miR-21、miR-221、miR-499-3p、miR-208a、miR-705表达上调,miR-29a、miR-1、miR-373、miR-143、miR-20a、miR-220b表达下调。生物信息学分析发现,差异miRNA调控的靶基因与细胞增殖、凋亡、糖代谢及血管生成等生物学功能相关。结论 STZ诱导的中晚期糖尿病模型小鼠心肌组织miRNA表达谱发生明显改变,提示miRNA可能参与糖尿病心肌损伤过程。     

微小RNA对胚胎细胞BUB1基因的表达抑制

目的:探讨微小RNA对胚胎细胞BUB1基因表达的调控.方法:用定量real-time PCR比较microRNA转染前后的胚胎细胞内源性基因BUB1 mRNA表达水平,同时用western blot比较转染前后Bub1蛋白的表达水平.结果:对照组的BUB1基因mRNA拷贝数/GAPAH mRNA拷贝数为0.1960±0.0688,而转染microRNA重组质粒后,实验组的mRNA比值分别为0.1968±0.0689和0.1962±0.0670,经统计分析,两实验组细胞的内源性BUB1基因mRNA水平与对照组无显著性差异;而蛋白水平在转染后均有明显降低.结论:microRNA主要在翻译水平调节哺乳动物细胞内基因的表达,为研究基因表达的调控机制奠定了良好的基础.     

miRNA expression profile during fluid shear stress-induced osteogenic differentiation in MC3T3-E1 cells

Objective: To test the hypothesis that the short-term and appropriate fluid shear stress is expected to promote the terminal differentiation of pre-osteoblasts and detect the expression profile of microRNAs in the fluid shear stress-induced osteogenic differentiation in MC3T3-E1. Materials and Methods: MC3T3-E1 cells were subjected to 1 hour of FSS at 12 dyn/cm2 using a parallel plate flow system. After FSS treatment, cytoskeleton immunohistochemical staining and microRNAs were detected immediately, osteogenic genes expression and immunohistochemical staining for collagen type I were tested at the 24th hour, ALP activity assay was measured at the 24th, 48th and 72th hour, alizarin Red Staining was checked at day 12. Results: 1 hour of FSS at 12 dyn/cm2 induced actin stress fiber formation and rearrangement, up-regulated of osteogenic gene expression, increased ALP activity, promoted synthesis and secretion of collagen type I, enhanced nodule formation and promoted the terminal differentiation in MC3T3-E1 cells. During osteogenic differentiation, expression levels of miR-20a, -21, -19b, -34a, -34c, -140 and -200b in FSS-induced cells were significantly down-regulated. Conclusions: The short-term and appropriate fluid shear stress is sufficient to promote the terminal differentiation of pre-osteoblasts and that a group of miRNAs that may play an important role in the FSS-induced pre-osteoblast differentiation.     

miRNA expression profile during fluid shear stress-induced osteogenic differentiation in MC3T3-E1 cells

Background Mechanical stress plays an important role in the maintenance of bone homeostasis.Current hypotheses suggest that interstitial fluid flow is an important component of the system by which tissue level strains are amplified in bone.This study aimed to test the hypothesis that the short-term and appropriate fluid shear stress (FSS) is expected to promote the terminal differentiation of pre-osteoblasts and detect the expression profile of microRNAs in the FSS-induced osteogenic differentiation in MC3T3-E1 cells.Methods MC3T3-E1 cells were subjected to 1 hour of FSS at 12 dyn/cm2 using a parallel plate flow system.After FSS treatment,cytoskeleton immunohistochemical staining and microRNAs (miRNAs) were detected immediately.Osteogenic gene expression and immunohistochemical staining for collagen type Ⅰ were tested at the 24th hour after treatment,alkaline phosphatase (ALP) activity assay was performed at 24th,48th,and 72th hours after FSS treatment,and Alizarin Red Staining was checked at day 12.Results One hour of FSS at 12 dyn/cm2 induced actin stress fiber formation and rearrangement,up-regulated osteogenic gene expression,increased ALP activity,promoted synthesis and secretion of type Ⅰ collagen,enhanced nodule formation,and promoted terminal differentiation in MC3T3-E1 cells.During osteogenic differentiation,expression levels of miR-20a,-21,-19b,-34a,-34c,-140,and-200b in FSS-induced cells were significantly down-regulated.Conclusion The short-term and appropriate FSS is sufficient to promote terminal differentiation of pre-osteoblasts and a group of miRNAs may be invovled in FSS-induced pre-osteoblast differentiation.     

HSV-2 LAT过表达vero细胞中microRNA的表达谱变化

目的分析过表达疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）潜伏相关转录子LAT后vero细胞microRNA表达谱的表达变化。方法通过化
学合成的方法获得LAT基因的全长序列。构建HSV-2LAT逆转录病毒表达载体pRetroQ- AcGFP1-C1,包装获得HSV-2LAT
基因过表达的逆转录病毒。利用microRNA芯片技术,分析感染逆转录病毒HSV-2LAT后vero细胞microRNA表达谱的变化,
得到因LAT基因过表达而产生变化的microRNA。结果通过microRNA芯片分析,逆转录病毒HSV-2LAT感染vero细胞后,
可引起hsa-miR-23a*、kshv-miR-K12-3、hsa-miR-943、hsa-miR-634、hsa-miR-12705种microRNA2倍以上上调;使hsa-miR-181a-2*、hsa-miR-450b-5p、hsa-miR-31、hsa-miR-24、kshv-miR-K12-12*5种microRNA2倍以上下调。结论LAT基因过表达后
可引起vero细胞microRNA表达谱的变化。