46株分泌单抗杂交瘤细胞株支原体污染的检测

４６株分泌单抗杂交瘤细胞株支原体污染的检测李秀华，郭玮，高光，范学祥，吕秀华，袁曾麟，尹红章，李德富（中国药品生物制品检定所，北京１０００５０）细胞培养物感染支原体是一个十分严重的问题，尤其是对有重要应用价值的杂交瘤细胞，往往造成细胞生长缓慢、胞浆颗...     

培养细胞污染支原体的PCR检测方法的建立及应用

在生物制剂的生产和研发领域,细胞培养扮演着极其重要的角色：用原代细胞或传代细胞制造疫苗;杂交瘤细胞制造单克隆抗体;基因工程或细胞生物学的研究等。然而支原体污染常常成为细胞培养的不速之客,严重影响着细胞及生物制剂的质量。污染细胞最常见的支原体包括：     

几种防治组织培养中支原体污染方法的探索

本文报告了对几种防治组织培养中的支原体污染的方法的研究结果。试用各种滤器过滤血清和56℃灭活方法,以去除小牛血清中污染的支原体。采用半固体培基方法鉴定支原体结果证明,0.22u微孔滤膜和EKS蔡氏滤板可以去除小牛血清中污染的支原体。但G6玻璃滤器和0.3μ微孔滤膜过滤不能清除血清中的支原体,56℃加热30分钟,重复三次不能使血清中的支原体灭活。对于已经污染有支原体的传代细胞株,使用各种抗生素或在培养物中加入小鼠腹腔饲养细胞都不能去除支原体。但是将污染细胞接种于小鼠腹腔,经过一定时间再取腹水或实体瘤细胞培养,鉴定结果表明,通过小鼠腹腔内培养的NS-1细胞,不仅清除了污染的支原体,用于融合也获得满意效果。     

细胞培养中支原体污染的去除

在运用细胞培养手段的生物学研究和生物工程产品中，支原体污染仍是一个颇为棘手的问题。１１株人的细胞ＳＰＣ－Ａ１、Ｋ５６２、ＨＵＴ－１０２、ＢＴ－３２５、６Ｔ－ＣＥＭ、ＮＫＭ－４５、ＣＮＥ、ＨＬ－６０、ＱＧＹ－７７０１、ＱＺＧ、人羊膜细胞；３株小鼠细胞Ｐ３８８－１、ＹＡＣ－１、Ｐ８１５；１株绒猴细胞Ｂ９５－８；和一株杂交瘤ＱＫＴ３等，已污染了支原体的细胞经ＭＣ－２１０ １μｇ／ｍｌ处理７天，支原体污染     

介绍一种有效的拯救小鼠杂交瘤的方法:脾内接种法

在小鼠杂交瘤的制备、传代过程中,常遇到一些棘手问题;小到影响实验进展,大到细胞丢失:其中常见的是 1.污染,包括支原体、细菌及真菌污染。在杂交瘤未冻存前:这些污染会造成很大的损失。2.有些杂交瘤复苏后不易存活。3.个别情况下杂交瘤增殖不良,不易向24孔板内扩增。腹腔接种在一定程度上可以解决这一问题,但常规方法要求细胞数量较     

清除杂交瘤细胞支原体污染几种方法的比较

实验室细胞培养中，支原体污染是一个普遍存在的问题，据文献报道污染率高达90％’‘’。由于受污染的支原体可干扰细胞的DNA，RNA和蛋白质的合成，消耗培养液中的氨基酸，从而影响细胞的正常生长，严重者可导致细胞死亡，因此，清除污染的支原体，具有重要的意义。检测支原体的方法有多种，但基于本实验室条件，我们采用了培养法和DNA荧光染色法检测杂交瘤细胞株污染的支原体。由于要彻底清除污染的支原体相当困难，实际工作中应预防为主，一旦发现有支原体污染就应废弃。而对某些建株困难的重要细胞株，则须设法清除污染的支原体。目…     

介绍一种有效的拯救小鼠杂交瘤的方法：脾内接种法

在小鼠杂交瘤的制备、传代过程中，常遇到一些棘手问题；小到影响实验进展，大到细胞丢失：其中常见的是1．污染，包括支原体、细菌及真菌污染。在杂交瘤未冻存前，这些污染会造成很大的损失。2．有些杂交瘤复苏后不易存活。3．个别情况下杂交瘤增殖不良，不易向24孔板内扩增。腹腔接种在一定程度上可以解决这一问题，     

检测支原体污染的一种敏感的微量定量试验IL-2依赖性细胞系增殖的抑制试验

本文报告检测细胞培养中支原体的一种简易、快速及敏感的微量分析法。该法是基于污染细胞的培养上清液能抑制[~3H]胸腺嘧啶核苷结合一种白细胞介素—2(IL—2)依赖性小鼠细胞毒性T细胞系(CTLL)。     

应用活体内生长的骨髓瘤细胞促进细胞融合成功率

本文报告了用小鼠骨髓瘤细胞系NSI融合不易成功时,可先将其接种到Balb/c小鼠体内产生实体瘤,然后分离出单个细胞悬液,进行细胞融合的16次实验结果,成功率达100％。所用免疫原有胸腺细胞,CLLC、人和大白鼠肾细胞等细胞性抗原;也有Aldolase和POD等可溶性抗原。16次融合共获得315个单抗,其中131个单抗具有较好的特异性。从融合成功率单抗特异性及60株杂交瘤所分泌免疫球蛋白类与亚类的分析证明此法是可靠的。特别适用于细胞培养条件较差或因支原体污染造成鼬合失败的实验室。文中对此法的机制也进行了讨论。     

杂交瘤细胞中细菌污染的清除试验

本实验通过杂交瘤细胞和污染细菌对不同抗菌药物的耐受性和敏感性及对瘤细胞特异性抗体的检测等试验，筛选出氟哌酸和头孢唑淋钠两种对细胞毒性小、抗菌谱广、不影响杂交瘤细胞分泌特异性抗体、且可以根除对常规双抗有耐受性的细胞污染细菌，从而模索出消除细胞培养中细菌污染的可行方法。     

四种抗支原体单克隆抗体的制备和初步应用

为了适应生物工程技术发展和病毒疫苗广泛应用的需要,细胞培养中支原体的检测方法应力求特异,快速。为此,本实验室于1987年首先建立了口腔支原体(M·orale)杂交瘤细胞株。为使诊断试剂配套以提高阳性率,又相继建立了猪鼻支原体(M·hyor-hinis)、精氨酸支原体(M·arginini)和莱氏无胆甾原体(A·laidlawii)杂交瘤细胞株。其方法如下:将纯培养的各支原体标准菌株以高速离心法浓缩提纯,用此作为抗原免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0-Ag-Ag14小鼠骨髓瘤细胞融合。采用IFA法和碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶标技术     

检测支原体污染的一种敏感的微量定量试验:IL-2依赖性细胞株的增殖抑制试验

检测细胞培养中支原体污染的方法很多,但多数方法复杂,价格昂贵或不可靠,不适作细胞培养室的常规筛选方法.因此,作者建立了一种简便、快速而敏感的IL-2依赖性细胞株的增殖抑制试验.其原理:IL-2依赖性小鼠细胞毒性T淋巴细胞株(CTLL)在IL-2饱和浓度下,对外源性胸腺嘧啶核苷利用率非常高,掺入的~3H Tdr高达100,000～200,000cpm,因此增殖迅速.然而在被支原体污染的上清液中,由于支原体在消耗丝氨酸时产生了特异性核苷磷酸化酶,它能把外源性胸腺嘧啶核苷裂解成胸腺嘧啶,从而使培养的细胞在合     

猪鼻支原体单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定

作者用提纯的猪鼻支原体抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞,在PEG1000作用下,与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag14融合,共获得5株稳定分泌抗猪鼻支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株。制备了小鼠腹水抗体,并对杂交瘤细胞株行进了鉴定。上述细胞株经3～6个月稳定传代,冻存于液氮中,复苏后其分泌抗体的水平未见下降。     

猪鼻支原体单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定

作者用提纯的猪鼻支原体抗原免疫BALB／c小鼠，取其脾细胞，在PEG1000作用下，与小鼠骨髓瘤细胞Sp2／0-Ag 14融合，共获得5株稳定分泌抗猪鼻支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株。制备了小鼠腹水抗体，并对杂交瘤细胞株行进了鉴定。上述细胞株经3～6个片稳定传代，冻存于液氮中．复苏后其分泌抗体的水平末见下降。     

通过小鼠腔腹消除杂交瘤培养物中的支原体、细菌、真菌的污染

支原体、细菌及真菌经常会污涂细胞培养物,它们对细胞可产生诸如形态学改变、代谢、生长、生活力的变化。在杂文瘤技术中,这些病理学效应是由于细胞感染造成良好收获和杂交瘤细胞系保存的一种限制因子。 当前,所用消除支原体、细菌、真菌污涂的方法,例如使用抗生素和抗真菌药物,     

妊娠相关血浆蛋白-A单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的制备娠相关血浆蛋白-A（PAPP-A）单克隆抗体（McAb）。方法利用PAPP-A抗原免疫Balb／c小鼠，应用杂交瘤技术将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2／0）融合，间接ELISA方法对细胞培养上清检测、筛选，建立分泌PAPP—A单克隆抗体的杂交瘤细胞株，扩人培养后，Balb／c小鼠腹腔注射杂交瘤细胞株，产生腹水后，对腹水进行收集、纯化、签定．结果筛选出稳定分泌PAPP—AMcAb的杂交瘤细胞株，Western—blot分析证实McAb与PAPP—A有较高的特异性及敏感性。结论本实验成功制备了抗PAPP—A特异性的McAb，可用于PAPP—A免疫检测方法的建立。     

应用单克隆抗体检查淋巴母细胞系的支原体污染

免疫学研究中应用的淋巴母细胞系存在着严重的支原体污染问题.这些支原体耗竭HAT选择培养基中的胸腺嘧啶核苷.对杂交细胞产生毒性,从而严重阻碍了细胞融合的成功.本文作者在用人B淋巴母细胞(Swei)作免疫原制备抗人Ia抗原的单克隆抗体时,意外地获得了两株针对支原体的杂交瘤细胞     

不同杂交瘤饲养细胞上清和条件培养液中IL-2和IL-6水平的比较

本文应用细胞因子依赖细胞株CTLL和7TD1及。~3H-TDR掺入方法,分别对6种常用培养杂交瘤的饲养细胞培养上清和条件培养液中IL-2和IL-6的生物学活性水平进行了定量检测和比较。结果发现,除大鼠混合胸腺细胞培养上清中含有约1u/ml IL-2外,其它均未测出IL-2的生物学活性。但6种上清中都含有IL-6,其中人成纤维细胞CRL_(1506)和人内皮细胞中含有很高水平的IL-6,分别为10000u/ml和2512u/ml;大鼠混合胸腺细胞和小鼠腹腔巨噬细胞培养上清分别为158u/ml和126u/ml;小鼠脾脏细胞和胸腺细胞培养上清中IL-6相对较低,分别为79u/ml和16u/ml。此外,本文还对常用饲养细胞及条件培养液在杂交瘤细胞生长中可能起的主要作用进行了讨论。     

用滚环扩增技术检测污染细胞的5种支原体

目的 建立滚环扩增技术检测5种常见的细胞污染支原体(猪鼻支原体、发酵支原体、口腔支原体、精氨酸支原体、莱氏无胆甾原体)的方法.方法 使用细胞污染支原体16S-23SrRNA间隔区公共引物(SPS1,SPA2)扩增间隔区靶基因.设计每一种支原体特异性锁式探针,锁式探针与扩增的靶基因杂交结合形成环化单链分子,加入特异性引物在Corbett RotorGeneTM 6000扩增仪滚动扩增环化单链分子,观察结果.结果 滚环扩增技术能敏感和特异的检测上述5种支原体标准株,并能敏感的检测10个拷贝的靶基因.在62个细胞培养物样本的检测中,37个样本检测出一种支原体,14个样本检测出两种支原体,11个样本为支原体阴性.滚环扩增方法检测结果与支原体种特异性PCR检测结果一致.结论 滚环扩增作为一种新的扩增技术能敏感和特异的检测细胞污染支原体.     

抗口腔支原体、精氨酸支原体单克隆抗体的制备及其应用方法的初步研究

用口腔支原体、精氨酸支原体抗原免疫ＢＡＬＧ／ｃ小鼠，取其脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞（Ｓｐ２／０）融合，获得了７株稳定分泌抗口腔支原体单克隆抗体（ＭｃＡｂ），２株分泌抗精氨酸支原体ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞株。间接ＥＬＩＳＡ测定其抗体效价可达１：１０３～１：１０７；９株ＭｃＡｂ中１株为ＩｇＧ２ａ，其余均为ＩｇＧ１。初步建立了ＥＬＩＳＡ检测支原体的方法。