TNFα对人脂肪细胞STEAP4基因表达的调控

目的：人STEAP4基因是一个参与胰岛素敏感性调节的肥胖相关差异表达基因,本研究旨在探讨胰岛素抵抗相关脂源性细胞因子TNFα对人成熟脂肪细胞中STEAP4基因的调节作用。方法：体外培养人前体脂肪细胞,在诱导人前体脂肪细胞分化成熟的基础上,应用不同浓度（0、5、10、25、50 ng/mL）人重组TNFα干预成熟脂肪细胞24 h,采用实时荧光定量RT-PCR技术、Western blot技术检测干预后人成熟脂肪细胞STEAP4基因在核酸和蛋白表达水平的变化。结果：不同浓度TNFα（5、10、25、50 ng/mL）干预24 h能显著上调人成熟脂肪细胞中STEAP4基因的mRNA表达,与未干预对照组差异有显著性（P<0.05）;50 ng/mL TNFα干预时STEAP4基因在人成熟脂肪细胞中的mRNA表达水平最高。与基因表达结果相一致,不同浓度TNFα（5、10、25、50 ng/mL）干预24 h能显著上调人成熟脂肪细胞中STEAP4蛋白的表达,与未干预对照组差异有显著性（P<0.05）;干预浓度提高到25 ng/mL 时干预效果最为明显。结论：TNFα能显著上调人成熟脂肪细胞中STEAP4基因核酸和蛋白的表达。［中国当代儿科杂志,2009,11（12）：1008-1011］     

STEAP4基因蛋白铁氧化还原酶活性分析

目的 分析肥胖相关基因STEAP4的铁氧化还原酶活性.方法 体外温箱培养昆虫细胞株(Sf9),分别将 pAcSec1-STEAP4 转移载体和pAcSec1-vector转移载体与 SapphireTM杆状病毒基因组混合后共转染 Sf9 昆虫细胞,通过G418药物筛选稳定表达STEAP4蛋白的细胞株,并抽提细胞总蛋白进一步应用Western blot 技术验证其转染情况.应用分光光度计法检测铁氧化还原酶活性.应用SPSS 11.5软件进行统计学分析.结果 Western blot 技术证实STEAP4过表达细胞株构建成功;分光光度计法检测STEAP4铁氧化还原酶活性,STEAP4过表达组A值为5.182 5±0.230 4,空载组A值为1.615 0±0.822 6,STEAP4过表达组铁氧化还原酶活性明显高于空载组,差异有统计学意义(Pa<0.001).结论 STEAP4基因蛋白具有铁氧化还原酶活性.     

油酸诱导SW872前脂肪细胞分化的作用

目的探讨油酸对SW872前脂肪细胞的诱导分化作用,为体外研究脂肪细胞功能及其相关疾病建立细胞模型。方法体外培养,0.6 mmol/L油酸诱导SW872前脂肪细胞分化,光学显微镜观察SW872前脂肪细胞形态的变化,油红O染色观察胞浆中脂滴的聚集,化学比色法测定细胞中三酰甘油(TG)总量,RT-PCR方法检测不同分化时间点转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体-γ2(PPAR-γ2)与CAAT/增强子结合蛋白-α(C/EBP-α)mRNA的时序性表达。结果1.油酸诱导分化24 h时SW872前脂肪细胞胞体由小变大,形态由梭形变为圆形,胞浆中出现细小脂滴;诱导48 h时细胞体积进一步变大,几乎所有细胞形态变圆,胞浆中脂滴明显增多;诱导分化72 h时细胞呈戒环状,胞浆脂滴含量更多,油红O染色胞浆中可见丰富的脂肪染色。2.油酸诱导分化24 h时,细胞中TG总量增多;诱导分化48 h时TG总量是分化前8.5倍;诱导分化72 h时TG总量是分化前14倍(P<0.01)。3.油酸诱导分化24 h时PPAR-γ2与C/EBP-αmRNA表达轻度升高;诱导分化48 h时PPAR-γ2与C/EBP-αmRNA表达明显升高,分别是诱导分化前的10.23倍和12.91倍;诱导分化72 h时PPAR-γ2与C/EBP-αmRNA表达进一步升高,分别是诱导分化前的14.15倍和14.82倍(P均<0.01)。结论油酸刺激72 h能促进SW872前脂肪细胞中TG的合成与积聚,可诱导SW872前脂肪细胞中转录因子PPAR-γ2与C/EBP-αmRNA时序性表达,成功诱导SW872前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞。     

肿瘤坏死因子-α对人脂肪细胞STEAP4蛋白膜转位的影响及其机制

目的 探讨肿瘤坏死因子-α (TNF-α)对人脂肪细胞STEAP4蛋白膜转位的影响,并分析其可能的机制.方法 应用1-甲基3-异丁基黄嘌呤(MIX)、地塞米松、胰岛素、罗格列酮方案诱导人前体脂肪细胞分化,以人重组TNF-α或加用细胞外信号调节蛋白激酶( ERK)抑制剂PD-98059干预人成熟脂肪细胞24 h,采用Western blot技术检测细胞膜蛋白与总蛋白中STEAP4蛋白的表达.结果TNF-α干预能显著促进人成熟脂肪细胞中STEAP4蛋白向细胞膜转位;ERK抑制剂PD-98059联合TNF-α与单独应用TNF-α诱导人成熟脂肪细胞的细胞膜蛋白和总蛋白中STEAP4蛋白的表达水平比较均无显著差异.结论 TNF-α干预显著促进人成熟脂肪细胞中STEAP4蛋白的膜转位,初步排除丝裂原活化蛋白激酶信号途径参与这一调控机制.     

解偶联蛋白4基因在3T3-L1脂肪细胞诱导分化中的表达水平

目的　观察 3T3 L1脂肪前体细胞诱导分化过程中解偶联蛋白 4 (UCP4 )基因表达水平变化 ,探讨UCP4基因与肥胖发生之间的关系。方法　体外培养 3T3 L1细胞 ,诱导细胞分化 ,采用RT PCR技术在细胞分化成熟的不同时段检测脂肪细胞中UCP4基因mRNA表达水平。结果　UCP4基因高表达于 3T3 L1脂肪前体细胞中 ,随细胞分化成熟该基因表达水平渐下调。UCP4基因表达水平在诱导分化前 (d - 1)至d0、d0～ 3、d4～6、d7～ 8、d9～ 10内无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ,余各时段表达水平均有显著差异 (P均 <0 .0 1)。结论　UCP4基因与肥胖发生相关 ,其在 3T3 L1细胞分化过程中表达逐渐下调可能有利于脂肪细胞的脂质积聚     

鞘氨醇激酶基因在3T3-L1脂肪细胞诱导分化中的表达水平

目的 探讨鞘氨醇激酶基因(SPHK）在3T3-L1脂肪细胞诱导分化中表达水平的变化。方法采用细胞培养和RT-PCR技术检测细胞分化不同阶段脂肪细胞中SPHK基因表达水平。结果1．SPHK基因在3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化初期表达呈明显上调趋势；2．随着脂肪前体细胞分化成熟，该基因表达水平明显低于诱导分化初期的基因表达水平。结论 SPHK基因可能参与脂肪细胞分化的调控过程，与肥胖发生有一定联系。     

NYGGF4基因过表达对成熟脂肪细胞线粒体形态及动力学的影响

目的 探讨NYGGF4基因过表达对成熟3T3-L1脂肪细胞线粒体形态及动力学的影响.方法 以3T3-L1前体脂肪细胞为载体,建立NYGGF4基因稳定过表达细胞株,以空载质粒转染的细胞为对照,将前体脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞.采用透射电镜观察成熟脂肪细胞的线粒体形态,采用荧光定量PCR技术检测成熟脂肪细胞中线粒体融合基因(Mfn)1 mRNA、Mfn2 mRNA、线粒体动态相关基因(Drp)1 mRNA的表达水平.采用Western blot方法检测Mfn1蛋白、Mfn2蛋白、Drp1蛋白的表达水平.结果 1.电镜观察发现NYGGF4基因过表达的成熟脂肪细胞线粒体体积变小、数量明显减少,线粒体嵴断裂、减少、消失,部分线粒体肿胀,甚至呈空泡状;对照组成熟脂肪细胞的线粒体形态基本正常,线粒体嵴清晰可见,线粒体无明显肿胀、皱缩.2.NYGGF4基因过表达成熟脂肪细胞Mfn1 mRNA及Mfn1蛋白表达水平均显著高于对照组.3.NYGGF4基因过表达成熟脂肪细胞的Mfn2 mRNA、Drp1 mRNA及相应蛋白表达水平与对照组比较差异均无统计学意义.结论 在3T3-L1成熟脂肪细胞中,NYGGF4基因过表达可导致线粒体形态发生变化、数量减少,同时上调Mfn1 mRNA和Mfn1蛋白表达水平,提示NYGGF4基因在成熟脂肪细胞中过表达能影响细胞线粒体形态及动力学.     

TSG-6基因在3T3-L1脂肪细胞诱导分化中表达水平的变化及TNF-α对其调节作用的研究

目的观察3T3-L1脂肪细胞诱导分化过程中TSG-6基因mRNA表达水平的变化,探讨TNF-α对成熟脂肪细胞中TSG-6基因表达水平的调节作用.方法体外培养3T3-L1脂肪细胞,在诱导3T3-L1脂肪细胞分化成熟的基础上,应用重组TNF-α干预分化成熟的脂肪细胞,采用RT-PCR技术检测诱导分化不同时段及TNF-α干预后不同时间脂肪细胞中TSG-6基因的表达水平.结果 (1)随脂肪细胞逐渐分化成熟,TSG-6 基因mRNA表达水平逐渐升高.TSG-6 基因表达水平除在细胞分化第0～2天、第3～5天、第4～6天和第7～10天各时段内差异无显著意义(P>0.05)外,其余各时段之间表达水平,差异均有显著意义(P＜0.05);(2)不同浓度重组TNF-α(0.1～10.0 ng/ml)均能显著抑制成熟脂肪细胞中TSG-6基因mRNA的表达,除外TNF-α浓度1.0 ng/ml时6～24 h时段,其抑制作用呈现随TNF-α浓度增加和刺激时间延长而明显增强的总体趋势.TNF-α浓度为0.1 ng/ml时,TSG-6基因表达水平6 h内下降33.73%,12 h内下降97.39%;TNF-α浓度为1.0 ng/ml时,TSG-6基因表达水平6 h内下降78.68%,并持续至24 h;TNF-α浓度达10.0 ng/ml时,TSG-6基因表达水平2 h内即下降96.27%,TSG-6基因的表达几乎被完全抑制.结论 (1)TSG-6基因可能参与脂肪细胞分化及脂质形成过程;(2)TNF-α对脂肪细胞中TSG-6基因表达具有抑制作用,其抑制效应总体趋势上呈现剂量反应性特征.     

生长激素促分泌素受体-1a基因在3T3-L1脂肪细胞诱导分化过程中的表达

目的 观察生长激素促分泌素受体-1a(GHSR-1a)基因在3T3一K1肪细胞诱导分化过程中不同时段表达水平的变化,探讨GHSR-1a基因在脂肪细胞分化中的作用.方法 体外培养3T3-L1前脂肪细胞,在诱导其向成熟脂肪细胞分化的不同时段(第0-8天).通过形态学观察、油红0染色测定脂肪细胞分化程度及脂滴积聚情况,化学比色法测定脂肪细胞三酰甘油(TG)总量,半定量反转录一聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测脂肪细胞中GHSR-1a基因mRNA的表达水平.采用SPSS 12.0软件进行组间t检验.结果 3T3-L1前脂肪细胞在诱导分化前呈梭形的成纤维细胞形态,胞浆内无脂滴;诱导分化后细胞逐渐由梭形变为圆形,胞体变大变圆,胞浆内出现明显的脂滴.3T3-L1前脂肪细胞诱导分化第4天细胞内TG水平已明显升高,第8天TG水平升高更加明显,与前脂肪细胞相比均有显著统计学意义(Pa<0.01).同时GHSR-1a基因mRNA低表达于3T3-L1前脂肪细胞和分化第1天的脂肪细胞,随着3T3-L1脂肪细胞逐渐分化成熟,分化第4天和第8天GHSR-1a基因mRNA的表达逐渐增加,GHSR-1a基因的表达水平除在诱导分化第0-1天和第1-4天内差异无统计学意义(P＞0.05)外,其余各时间点表达水平比较均有统计学意义(Pa<0.05).结论 3T3-L1脂肪细胞分化过程中GHSR-1a基因表达逐渐上调,其表达变化与脂肪细胞分化、脂质积聚过程一致,可能参与了脂肪细胞分化过程.     

HCK基因在小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中的表达

目的 探讨HCK基因在小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中的表达及HCK基因在维持胚胎干细胞未分化状态中的意义.方法 培养小鼠胚胎干细胞,并诱导其向心肌细胞分化.抽提其胚胎干细胞未分化及分化第2、4、6、8天的总RNA,应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对HCK基因mRNA的表达进行半定量分析;同时抽提胚胎干细胞未分化及分化第2、4、6、8天的总蛋白,应用Western-blot方法对HCK蛋白的表达进行半定量分析.采用SPSS 11.5软件进行统计学分析,P＜0.05为有统计学差异.结果 HCK基因mRNA在未分化的胚胎干细胞(D0)及分化的第2天(D2)均有表达,而在分化的第4天(D4)开始已不能检测到有表达,HCK基因mRNA的表达水平随小鼠胚胎干细胞的分化呈急剧下调趋势;HCK蛋白的表达与mRNA的表达相一致,在小鼠胚胎干细胞的分化进程中逐渐下调,至第4天已基本检测不出.结论 HCK基因随着小鼠胚胎干细胞向心肌分化,表达呈下调的趋势,HCK基因可能在维持胚胎干细胞未分化状态中起重要作用.     

油酸诱导SW872前脂肪细胞分化过程中脂联素受体的表达

目的探讨SW872前脂肪细胞分化过程中脂联素受体基因表达的变化。方法体外培养,0.6 mmol/L油酸诱导SW872前脂肪细胞分化,油红O染色观察细胞内脂肪的聚积;RT-PCR方法检测不同分化时间点脂联素受体(AdipoR)1 mRNA及AdipoR 2 mRNA水平。结果0.6 mmol/L油酸诱导分化72 h,能成功将SW872前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞;SW872前脂肪细胞表达两种脂联素受体,诱导分化刺激48 h,AdipoR 1 mRNA水平是诱导分化前的2.16倍,AdipoR 2 mRNA水平是诱导分化前的2.34倍;诱导分化72 h,AdipoR 1 mRNA水平是诱导分化前的2.54倍,AdipoR 2 mRNA水平是诱导分化前的4.09倍。结论SW872脂肪细胞表达脂联素两种受体增殖,且两种AdipoR的基因表达呈分化相关性。     

丝裂原活化蛋白激酶8基因在3T3-L1细胞诱导分化中表达水平的变化及肿瘤坏死因子-α对其调节的作用

目的观察丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)基因在3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化过程中表达水平的变化,探讨TNF-α,对成熟脂肪细胞中MAPK8基因表达水平的调节作用,分析MAPK8基因与脂肪细胞分化、脂质形成及肥胖间的关系。方法体外培养3T3-L1脂肪前体细胞,在诱导其分化成熟的基础上,采用RT-PCR技术检测诱导分化不同时段(0~10 d)脂肪细胞中MAPK8基因的表达水平;应用重组TNF-α(0.1,1.0,10.0μg/L)干预分化成熟的脂肪细胞,采用RT-PCR技术检测TNF-α干预后不同时间(0.5,2,6,12,24 h)脂肪细胞中MAPK8基因的表达水平。结果1.3T3-L1前体脂肪细胞中,MAPK8基因表达水平较高。应用地塞米松(DEX)、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(MIX)、胰岛素后脂肪细胞逐渐分化成熟,MAPK8基因mRNA表达水平逐渐减低。MAPK8基因表达水平除在诱导分化前至d4、d2~5、d6~10时段内无显著性差异外(P均>0.05),余各时段间表达水平均有显著差异(P均<0.01);2.不同浓度重组TNF-α干预成熟脂肪细胞,均能显著上调MAPK8基因的表达,并呈现随TNF-α浓度增加、刺激时间延长,表达调控作用逐渐增强的总体趋势。TNF-α浓度为0.1μg/L时,MAPK8基因的表达水平于干预12 h时间点开始出现明显上调;浓度增加至1.0μg/L时,MAPK8基因表达水平开始显著上调的时间点提前至干预2 h时,但24 h时间点的表达水平未见继续上调;TNF-α浓度为10.0μg/L时,除2 h时间点MAPK8基因表达开始显著上调外,12~24 h时段的表达也呈上调趋势。结论1.MAPK8基因在3T3-L1细胞分化过程中表达逐渐下调,其机制可能有利于脂肪细胞的分化成熟和脂质积聚,与肥胖发生有关;2.TNF-α能够上调成熟脂肪细胞中MAPK8基因的表达,其效应总体趋势上呈现剂量及时间反应性特征。     

PRNP基因在3T3-L1脂肪前体细胞分化过程中的表达及肿瘤坏死因子-α对其调节作用

目的 探讨3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化过程中PRNP基因表达水平的变化及TNF-α对其调节作用.方法 体外培养3T3-L1前体脂肪细胞,胰岛素加地塞米松加1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(MDI)方案诱导3T3-L1细胞分化成熟,并收集分化前、分化0～10 d各时段细胞,采用RT-PCR技术检测诱导分化不同时段3T3-L1细胞PRNP基因表达水平;同时在成功诱导3T3-L1细胞分化成熟的基础上,应用不同水平TNF-α(0.1、1.0、10.0 μg/L)干预分化后的成熟脂肪细胞(第10天),收集TNF-α刺激前(0 h)及刺激后0.5、2.0、6.0、12.0、24.0 h的脂肪细胞,通过RT-PCR测定TNF-α干预前后不同时间点脂肪细胞中PRNP基因表达水平.采用Excel软件进行统计学分析.结果 1.PRNP基因低表达于3T3-L1脂肪前体细胞中,随细胞分化成熟该基因表达水平逐渐上调,至分化第10天其表达水平最高.PRNP基因表达水平除在诱导分化前(第-1天)至第4天、第2～5天、第6～10天时段内无显著性差异外(Pa＞0.05),其余各时段间表达水平均有显著性差异(Pa＜0.05);2.在分化前的3T3-L1脂肪细胞和成熟脂肪细胞中,不同水平TNF-α(0.1、1.0、10.0 μg/L)均能在短时间内明显抑制PRNP基因mRNA的表达,且呈时间依赖性.结论 PRNP基因可能参与3T3-L1脂肪细胞分化及脂质积聚过程;不同水平重组TNF-α对成熟脂肪细胞的PRNP基因表达具有抑制作用,其抑制效应总体趋势上呈时间依赖性.     

人胎脑神经干细胞体外培养及分化研究

目的研究人胚胎神经干细胞体外长期培养的条件、不同部位脑组织神经干细胞数量及其分化能力和特点。方法分离人胚胎海马、皮质、室周、纹状体脑组织，培养在含碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）、表皮生长因子（EGF）、B27、N2掭加剂的无血清培养基中，形成神经球，用有限稀释法进行克隆、传代。计算神经球数量，用溴脱氧尿苷（BrdU）标记神经球，使用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞自主分化能力。结粜人胚胎海马、皮质、室周、纹状体部位脑组织均能培养出具有自我增殖能力的神经干细胞，其中海马所含神经干细胞最丰富。室周次之。BrdU检测有正在分裂、增殖的细胞。液氮冻存6个月的细胞复苏后仍具增殖分化能力。细胞贴壁分化后可形成Nestin、胶质原性纤维酸性蛋白（GFAP）、微管相关蛋白2（MAP2）表达阳性细胞。结论胚胎脑组织具有丰富的神经干细胞。具有自我更新和增殖能力，可长期培养。含b-FOF、EGF的无血清培养基能促进神经干细胞连续稳定增殖，保持神经干细胞特性。分离培养的神经干细胞可向神经元、胶质细胞分化。