Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应标准品的制备及应用研究

目的:制备用于Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)的标准品。方法:提取胚胎上颌突组织总RNA,行逆转录反应获得第一链的cDNA,再通过PCR回收获得预期Satb2基因片段;通过T-A克隆将该片段插入pGMT质粒载体;大量提取质粒,定量后进行标准曲线的制作和实时荧光定量PCR。结果:重组质粒经PCR扩增及序列测定表明,pGMT/Satb2基因已成功克隆。结论:所构建的pGMT/Satb2基因实时荧光定量PCR检测标准品应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏度和特异性高,准确可靠,此法可作为实时荧光定量PCR检测Satb2基因的标准方法。     

人前列腺特异性抗原mRNA实时荧光PCR定量标准品的构建

目的构建实时荧光定量PCR(FQPCR)的标准品以定量检测人前列腺特异性抗原(PSA)mRNA的表达。方法以Trizol裂解抽提法提取LNCaP细胞的总RNA。以RTPCR法制备PSAcDNA目的片段并进行扩增;以AT载体克隆法制备重组质粒,并转化E.coliDH5α菌提取重组质粒,联合用氨苄青霉素筛选法和α筛选法、EcoRⅠ限制性酶切和序列分析法鉴定特异性重组质粒。用聚乙二醇沉淀法提纯质粒并检测λ260nm吸光度,确定原液的重组质粒的拷贝浓度并以此制备FQPCR梯度标准品。结果PSAcDNA目的片段成功制备并获得稳定的重组质粒,保持了目的片段的特异性和序列的完整性。结论成功构建了实时荧光定量PCR标准品。     

人前列腺特异性抗原mRNA实时荧光POR定量标准品的构建

目的 构建实时荧光定量PCR（FQ-PCR）的标准品以定量检测人前列腺特异性抗原（PSA）mRNA的表达。方法 以Trizol裂解抽提法提取LNcaP细胞的总RNA。以RT-PCR法制备PSAcDNA目的片段并进行扩增；以A-T载体克隆法制备重组质粒，并转化EcoliDH5。菌提取重组质粒，联合用氨苄青霉素筛选法和筛选法、EcoRI限制性酶切和序列分析法鉴定特异性重组质粒。用聚乙二醇沉淀法提纯质粒并检测）．260nm吸光度，确定原液的重组质粒的拷贝浓度并以此制备FQPCR梯度标准品。结果 PSAcDNA目的片段成功制备并获得稳定的重组质粒。保持了目的片段的特异性和序列的完整性。结论 成功构建了实时荧光定量PCR标准品。     

HCV-RNA荧光定量标准品制备的探讨

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)RNA定量标准品的制备方法。方法用HCV-RNA阳性扩增目的片段,产物与pGEM-T载体连接并转化感受态大肠杆菌DH5α,经筛选和测序鉴定,阳性质粒体外转录合成cRNA,准确定量后作为标准品。结果 HCV-RNA标准品具有较大的线性范围(109copies/ml-101copies/ml),批内和批间重复性较好,cv分别为2.23%～6.85%和6.10%～10.01%。结论本法制备的HCV-RNA标准品具有较好的检测灵敏度和特异性,适合临床推广应用。     

人肝细胞生长因子mRNA实时荧光PCR定量标准的构建

目的:构建实时荧光定量PCR(FQ-PCR)标准以定量检测人肝细胞生长因子mRNA的表达.方法:采用RT-PCR法利用肝组织提取的总RNA制备肝细胞生长因子cDNA目的片段.与pGEM-TEasy Vector连接成重组质粒并转化E.coli DH5α.联合用直接PCR、α互补和氨苄青霉素筛选法、EcoRI限制性酶切和序列分析法鉴定其特异性.测定纯化的重组质粒A260,确定浓度并以此制备FQ-PCR梯度浓度参考标准.结果:HGF cDNA目的片段成功制备并获得稳定的重组质粒,保持了目的片段的特异性和序列完整性.结论:成功构建了实时FQ-PCR定量参考标准.     

小鼠脑脊髓炎病毒非编码蛋白片段实时荧光定量PCR标准品的构建

目的 构建小鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)非编码蛋白(UTR)片段标准品,用于实时荧光定量 PCR检测小鼠脑脊髓炎病毒.方法 RT-PCR 扩增TMEV UTR片段上80~1094 nt之间长度为1 014 bp的片段,将目的 片段连接至pMD18-T载体,转化至DH5a感受态细胞.分别经 PCR鉴定和序列测定验证重组质粒.分光光度计测量重组质粒的吸光值,换算成拷贝数浓度后作10倍梯度稀释制得质粒标准品.然后进行实时荧光定量PCR分析,绘制标准曲线.结果 TMEV UTR片段成功克隆至pMD18-T载体中,测序结果 表明重组质粒中插入的UTR序列正确,实时荧光定量PCR分析10倍梯度系列稀释的质粒标准品所得到的标准曲线良好,统计学分析显示Ct值与标准品浓度的对数存在良好线性关系,回归系数在0.99以上.结论 成功构建了TMEV UTR 片段实时荧光定量PCR标准品,为今后TMEV实时荧光定量PCR检测打下了基础.     

ERAP1基因标准品质粒的构建

目的构建人ERAP1基因的重组质粒。方法以成人皮肤组织中总RNA为模板、Random6mers为引物反转录合成cDNA,用该cDNA为模板PCR扩增人ERAP1基因,并克隆到PUC18载体,转化人大肠杆菌DH5α,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。计算重组质粒原液复制数浓度并制备梯度浓度标准品,real-timePCR构建标准曲线。结果ERAPl目的片段制备成功,获得稳定的重组质粒,保证了目的片段的特异性和序列完整性,标准曲线参数良好,标准品阈值循环数（α）与其相应梯度稀释浓度呈良好线性关系,扩增效率高。结论成功地构建了人ERAPl基因的荧光定量PCR标准品质粒。     

实时荧光定量聚合酶链反应检测人锌指蛋白23方法的构建

目的建立检测人锌指蛋白23(human zinc finger 23,ZNF23)的实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术。方法采用Primer Express Versions 3.0设计引物及TaqMan探针,检测ZNF23基因。将扩增的ZNF23基因片段纯化后与pMD19-T载体连接,克隆构建含ZNF23基因片段的重组质粒,作为定量检测ZNF23基因表达的标准品。结果 PCR扩增产物经测序分析证实为ZNF23特异性片段。本法灵敏度为650 copies/μL,线性范围为(6.50×102)-(6.50×107)copies/μL,相关系数R2为0.999,扩增效率E为97.28%,批间变异系数为0.78%～7.53%。结论成功建立了检测人ZNF23的实时荧光定量PCR方法,且该方法特异性好、灵敏度高、通量高。     

HCV-RNA荧光定量标准品制备的研究

目的 介绍一种简便快速的丙型肝炎病毒(HCV)RNA定量标准品的制备方法.方法 RT-PCR扩增目的片段,产物与pGEM-T裁体连接并转化感受态大肠杆菌DH5α经筛选和测序鉴定,阳性质粒体外转录合成cRNA,准确定量后作为标准品.结果 RNA标准品具有较大的线性范围(109 copies/ml-101copies/ml).批内和批间重复性也较好,cv分别为3.68%和8.40%.结论 本法制备的RNA标准品具有较好的检测灵敏度和特异性,适合临床推广应用.     

实时荧光定量PCR方法检测急性髓系白血病FLT3基因mRNA的表达

[摘　要]　目的 构建检测急性髓细胞白血病FLT3基因mRNA表达的标准品重组质粒和荧光定量PCR方法,为进一步研究FLT3基因表达与急性髓细胞白血病的关系奠定基础。方法 利用引物设计软件设计出扩增FLT3基因的引物和特异性荧光探针。提取K562细胞株总RNA,经RT-PCR 扩增,产物纯化后与pUCm-T Vector连接,转化到大肠杆菌DH5α,筛选得到标准品的质粒FLT3P。 建立荧光定量PCR 检测 FLT3基因技术方法,建立标准曲线并检测15例初治AML患者。结果 重组质粒进行荧光定量PCR 扩增出现强烈的荧光值增长,表明FLT3 cDNA已成功克隆。以109～105copies/μl不同稀释水平的标准品进行荧光定量PCR 扩增, 所获得的Ct 值与标准品浓度的对数存在良好线性关系, 标准曲线回归系数为0.9998 。AML病例 FLT3表达水平显著高于正常对照组（p=0.017）, 且不同病例的表达水平存在较大差异。结论 成功构建用于定量检测FLT3 mRNA表达得荧光定量PCR的标准品和技术方法; AML病例 FLT3表达水平显著增高。     

结直肠癌细胞株增殖诱导配体基因的克隆、表达及生物学活性分析

目的克隆结直肠癌细胞株增殖诱导配体(APRIL)基因,并测定APRIL胞外可溶性片段(sAPRIL)重组蛋白的生物学活性。方法采用RT-PCR技术,从肿瘤细胞株总RNA扩增APRIL全长及其胞外可溶性片段(sAPRIL)编码基因,PCR产物直接克隆于pGEM-T载体。将sAPRIL亚克隆到原核表达载体pET101/D-TOPOR○中,阳性克隆经IPTG诱导,SDS-PAGE分析sAPRIL的表达,对表达的蛋白初步纯化后进行生物学活性检测。结果 RT-PCR扩增出一个753bpDNA片段,酶切和测序证实该片段为编码人sAPRIL的全长cDNA,将sAPRIL克隆到表达载体经诱导后发现在20kDa处多显示出一条条带,纯化蛋白进行初步活性测定显示其可以剂量依赖方式促进细胞的生长。结论成功克隆了APRIL基因,并将其可溶性胞外区片段在大肠杆菌进行了表达。纯化的重组蛋白可促进细胞生长,为进一步进行April基因的功能研究及其开发和临床应用奠定了基础。     

线粒体转录复合物各因子质粒标准品的构建

目的:构建大鼠线粒体转录因子TFAM(A)、线粒体转录因子TFB1M(B1)、线粒体转录TFB2M(B2)及线粒体RNA聚合酶(POLRMT)的质粒标准品,为检测内耳细胞线粒体TFAM、TFB1M、TFB2M、POLRMT的mRNA表达水平做基础。方法:设计特异性引物和探针,提取大鼠内耳组织总mRNA逆转录成c DNA,PCR扩增、纯化目的片段,将纯化产物与p Zero Back/blunt载体重组,提取重组质粒,经测序鉴定后,用实时荧光绝对定量PCR建立标准曲线。结果:测序结果与各目的序列一致,获得良好的标准曲线(R2>0.99)。结论:成功构建了各目的基因的质粒标准品。     

杀菌/通透性增强蛋白N端cDNA的克隆和表达

目的　克隆杀菌 /通透性增强蛋白 (BPI) N端 c DNA,构建原核和真核表达载体 ,分别在大肠杆菌和 CHO细胞中表达 BPI蛋白 .方法　提取正常人外周血多形核粒细胞 (PMN)总 RNA,经套式 RT- PCR法扩增出 BPI N端 c DNA片段 ,将其克隆入 p GEM- T easy载体中并进行酶切鉴定和序列测定 .然后亚克隆入 p GEX- 4T- 1质粒 ,转化大肠杆菌 ,进行诱导表达 ,表达产物用 Western blot法鉴定 .同时将该基因片断克隆入 pc DNA3质粒 ,通过脂质体转染 CHO细胞 ,免疫荧光法鉴定 BPI的表达 .结果　获得 BPI N端长度为 72 6 bp的基因片断 .序列分析证实该片断中有 4个点突变 ,但均不在活性中心 .在大肠杆菌中的表达产物为相对分子质量 5 1× 10 3的GST- BPI融合蛋白 ,Western blot反应中在 5 1× 10 3处有显色区带 .G418筛选出的阳性 CHO细胞在免疫荧光反应中产生荧光反应 .结论　我们成功的在大肠杆菌和 CHO细胞中表达了 BPI2 5蛋白 ,为进一步研究 BPI生物学功能奠定了基础     

从妊娠人胎盘绒毛组织克隆HLA-G1 cDNA

为系统研究HLA-G1分子的生物学功能,采用RT-PCR技术,从人流的胎盘绒毛组织中提取总RNA,经过逆转录合成HLA-G1的全长cDNA,插入到真核表达载体pcDNA3中,构建重组表达质粒pcDNA3-HLA-G1;转化大肠杆菌DH5α,筛选其阳性克隆株,经酶切、PCR及测序鉴定,证实HLA-G1分子的重组真核表达载体已构建成功。     

人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达水平检测方法的建立

目的：建立实时荧光定量PCR检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达水平的检测方法,并构建相应质粒标准品,为进一步研究基因功能奠定基础。方法：提取人肠系膜动脉组织总RNA,采用RT-PCR方法获取sGCα、sGCβ、GAPDH基因片段,与pMD-18T vector连接,并转化到大肠杆菌DH5α细胞,通过PCR和测序鉴定重组质粒。提取含目的基因的质粒作为标准品,采用SYBR GreenⅠ法检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达和构建标准曲线。结果：人肠系膜动脉平滑肌存在sGCα和sGCβ基因表达,质粒标准品经过PCR鉴定并测序,与数据库公布的序列完全一致,标准曲线线性关系好,相关系数R2〉0.99。结论：建立了稳定的定量检测方法,并成功用于检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达,构建质粒标准品能用于后续实验。     

破骨细胞分化因子哺乳类荧光蛋白融合表达载体的构建与序列鉴定

目的：为了用基因工程表达重组人破骨细胞分化因子(ODF)可溶性功能片段，构建哺乳动物细胞表达载体。方法：PCR扩增人ODF基因cDNA功能活性片段，利用拓扑酶连接人哺乳动物细胞表达载体pcDNA3．1／CT-GFP-TOPO，转化E．coli TOPl0感受态细胞，氨苄青霉素筛选阳性克隆，提取质粒进行酶切分析和测序分析。结果：成功克隆了人ODF基因cDNA功能片段。结论：载体构建成功，为基因工程制备ODF并进一步研究奠定了基础。     

p27kip1复制缺陷腺病毒重组体的构建与鉴定

目的 :构建含人细胞周期依赖激酶抑制剂p2 7kip1基因的重组腺病毒载体 ,为采用p2 7kip1cDNA防治肿瘤的研究奠定基础。方法 :将人p2 7kip1cDNA插入到穿梭质粒pACCMVPLPA的CMV启动子之下 ,即pAd p2 7kip1。后者与pJM17通过脂质体共转染 2 93细胞 ,经同源重组获得含人p2 7kip1cDNA的重组腺病毒Ad p2 7kip1。结果 :p2 7kip1cDNA成功地插入了pACCMVPLPA载体 ,以重组病毒基因组DNA为模板 ,同时扩增出了 2 75bp的p2 7kip1基因片段和 86 0bp的腺病毒骨架基因片段 ,证实了Ad p2 7kip1的正确性。病毒滴度为 1.2 4× 10 1 2 pfu ml。结论 :成功构建了携带人p2 7kip1基因的腺病毒Ad p2 7kip1,为采用p2 7kip1cDNA途径防治消化道肿瘤的在体、离体实验奠定了基础     

hPSF蛋白的原核表达质粒的构建及分析鉴定

目的:构建hPSF蛋白原核表达质粒,在体外观察其与GAGE6调控区结合现象。方法:从人成纤维细胞中提取总RNA,利用hPSF特异性引物通过RT-PCR方法扩增hPSF cDNA编码序列,克隆入pET-28a载体中,构建重组载体pET-28-hPSF。将重组质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中进行表达,通过SDS-PAGE和免疫印迹法对表达产物进行鉴定。结果:酶切及测序结果显示,重组质粒构建成功;SDS-PAGE分析在相对分子质量约100kD处出现了1条蛋白条带,免疫印迹结果显示,所构建的重组载体可在大肠杆菌中高效表达hPSF蛋白。结论:成功构建了hPSF原核表达载体,并能够在大肠埃希菌中有效表达hPSF,为进一步研究hPSF的生物学作用奠定了基础。