冷冻异体神经移植中宿主局部应用转化生长因子β1质粒的研究

背景:异体神经移植修复神经缺损,降低免疫排斥反应是关键问题之一,目前主要手段是降低移植神经段的抗原性和全身使用免疫抑制剂。目的:观察经反复冻融处理的冷藏异体神经移植,局部使用转化生长因子β1质粒处理的效果。设计:随机对照动物实验。单位:华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科。材料:实验于2003-01/2004-12在华中科技大学同济医学院完成,选择健康成年不同窝的Wistar大鼠40只,随机分为实验组和对照组,每组各20只。方法:制备转化生长因子β1质粒及冷冻的异体坐骨神经。实验组和对照组大鼠将坐骨神经在梨状肌孔下0.5cm处,切除2.0cm,神经缺损用预制冷冻的异体神经2.0cm移植修复,实验组局部肌肉及神经两断端注射转化生长因子β1质粒,对照组注射等量的生理盐水。分别于6,12周各组10只大鼠取材、切片、染色并进行轴索计数和统计学分析。结果:在实验过程中无动物死亡,均进入结果分析。6周时对照组神经移植段轴索间有轻度水肿,实验组轴索间基本无水肿,再生神经数量接近正常;12周时,实验组整个神经移植段基本被再生轴突充满,有髓纤维排列整齐,轴突和髓鞘发育良好,实验组再生轴突数显著高于对照组,差别具有极显著性[(98.6±4.8),(75.8±5.1)个/μm2,t=2.962,P<0.01]。结论:反复冻融冷藏保存可降低异体神经的抗原性,具有修复神经缺损的可能性。局部使用转化生长因子β1质粒,可在局部发挥免疫抑制作用,降低宿主的免疫排斥反应。     

转化生长因子β1对新鲜同种异体神经移植后神经再生的影响

背景：周围神经缺损多采用自体神经移植。但存在一些问题，许多学者尝试异体神经移植，但存在许多问题，免疫排斥反应就是其中之一。 目的：观察局部应用转化生长因子β1对新鲜同种异体神经移植后神经再生的影响。 设计：随机对照的实验。 单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科。材料：实验于2001-08／2002-10在华中科技大学同济医学院附属协和医院完成。选择健康成年不同窝的Wistar大鼠60只，随机分为实验组、空白组、对照组3组，每组20只。 方法：制备转化生长因子β1质粒待用。制备动物模型，将两组大鼠的坐骨神经在梨状肌孔下0．5cm处，用消毒的剃须刀片整齐切断并切除2．0cm，切除的神经段互换移植修复神经缺损，实验组局部肌肉及神经两断端注射转化生长因子β1质粒，空白组、对照组注射等量的生理盐水，实验组、空白组不使用任何药物，对照组给予环孢霉素A（15mg／kg）喂养。分别于6周和12周各取10只取材、切片、染色染色：①Gleesluxot fast blue法染色。②髓鞘坚牢蓝染色法。轴索计数：术后12周的移植体中段染色标本，随机取视野，在光镜400倍下计算1．0mm^2内轴索数。组间比较采用t检验。 主要观察指标：各组移植区形态学观察和轴突计数。 结果：实验动物数量分析：60只动物在实验过程中无死亡，全部进入结果分析。①空白组可见移植物的不同地方出现广泛的单核细胞浸润，髓鞘脱水，可见大量的空泡变性，以6周时最为明显，整个移植物均被单核细胞浸润，排异反应严重，在移植段中，有极少量的轴突再生。12周时，移植体变细，大量瘢痕组织增生，水肿明显，可见极少量的许旺氏细胞和再生轴突，绝大多数再生的轴突未通过整个移至段。实验组、对照组有少量的单核细胞浸润，水肿较明显，但可见新生的血管在移植神经中形成，再生的轴突通过移植体。6周时，可见较多的许旺氏细胞增生。12周时，再生轴突已通过移植体，有一定量的髓鞘形成，许旺氏细胞增生明显，轴索间水肿减轻。各组移植段中外周的神经再生的轴突数量和髓鞘再生的数量较中心的多，且实验组中外周的轴索间水肿较中心的明显减轻。②术后12周，每组各取5只大鼠，在神经移植体中段随机取视野，400倍显微镜下观察计算1．0mm^2内轴突数，实验组、对照组轴突数显著高于空白组，组间差异有极显著性[（78．3&;#177;4．6），（76．1&;#177;4．2），（15．0&;#177;3．5），t=3．056，t=2．948，P〈0．01]。实验组和对照组接近，差异无显著性[（78．3&;#177;4．6），（76．1&;#177;4．2），t=1．982P〉0．05]。 结论：局部使用转化生长因子β1质粒，可在局部发挥免疫抑制作用，降低宿主的免疫排斥反应。并使移植体轴突数增多，促进神经生长。     

局部注射转化生长因子β1质粒与坐骨神经移植后免疫排斥反应的量效关系

背景：研究表明，转化生长因子β1被应用于周围神经移植来抑制或减弱移植排斥反应，但在某些情况下，转化生长因子又表现出正向免疫调节作用。所以有必要进行量效关系研究获取可靠的数据佐证。 目的：从剂量学上观察局部注射转化生长因子β1质粒与免疫排斥反应的量效关系。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2007—06／2008-04在哈尔滨医科大学动物实验中心完成。 材料：选用雄性Wistar大鼠20只为供体。清洁级雄性SD大鼠50只为受体，随机分为5组，每组10只：自体神经移植组、空质粒异体神经移植组、低、中、高剂量转化生长因子β1质粒异体神经移植组。pAdTrack—CMV—TGF-β1质粒，pAdEasy—1—Bj51833细胞由华中科技大学同济医学院附属协和医院传染病实验室曾令兰教授惠赠。 方法：于手术显微镜下，从犁状肌下孔0．5cm处整齐剪下长约1cm的坐骨神经，将供体神经桥接于神经缺损处，异体神经移植组转化生长因子β1质粒注射剂量为10，20，40μg／只，空质粒异体神经移植组注射空质粒。 主要观察指标：术后6周进行运动神经传导速度、病理学、混合淋巴细胞培养和轴突计数检查。 结果：高剂量转化生长因子β1质粒异体神经移植组运动神经传导速度、轴突计数与自体神经移植组接近（P〉0．05），并优于低剂量转化生长因子β1质粒异体神经移植组（P〈0．05）。病理学及透射电镜显示，高剂量转化生长因子β1质粒异体神经移植组移植神经段效果接近于新鲜自体神经移植组（P〉0．05），并优于低剂量转化生长因子β1质粒异体神经移植组。高剂量转化生长因子β1质粒异体神经移植组混合淋巴细胞培养、迟发性超敏反应优于低剂量转化生长因子β1质粒异体神经移植组（P〈0．05）。 结论：局部注射转化生长因子β1质粒减轻大鼠同种异体坐骨神经移植后免疫排斥反应的作用，在10～40μg范围内，随剂量的增加而增强。     

转化生长因子β1对新鲜同种异体神经移植后神经再生的影响

背景周围神经缺损多采用自体神经移植,但存在一些问题,许多学者尝试异体神经移植,但存在许多问题,免疫排斥反应就是其中之一.目的观察局部应用转化生长因子β1对新鲜同种异体神经移植后神经再生的影响.设计随机对照的实验.单位华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科.材料实验于2001-08/2002-10在华中科技大学同济医学院附属协和医院完成.选择健康成年不同窝的Wistar大鼠60只,随机分为实验组、空白组、对照组3组,每组20只.方法制备转化生长因子β1质粒待用.制备动物模型,将两组大鼠的坐骨神经在梨状肌孔下0.5 cm处,用消毒的剃须刀片整齐切断并切除2.0 cm,切除的神经段互换移植修复神经缺损,实验组局部肌肉及神经两断端注射转化生长因子β1质粒,空白组、对照组注射等量的生理盐水,实验组、空白组不使用任何药物,对照组给予环孢霉素A(15 mg/kg)喂养.分别于6周和12周各取10只取材、切片、染色染色①Gleesluxotfast blue法染色.②髓鞘坚牢蓝染色法.轴索计数术后12周的移植体中段染色标本,随机取视野,在光镜400倍下计算1.0mm2内轴索数.组间比较采用t检验.主要观察指标各组移植区形态学观察和轴突计数.结果实验动物数量分析60只动物在实验过程中无死亡,全部进入结果分析.①空白组可见移植物的不同地方出现广泛的单核细胞浸润,髓鞘脱水,可见大量的空泡变性,以6周时最为明显,整个移植物均被单核细胞浸润,排异反应严重,在移植段中,有极少量的轴突再生.12周时,移植体变细,大量瘢痕组织增生,水肿明显,可见极少量的许旺氏细胞和再生轴突,绝大多数再生的轴突未通过整个移至段.实验组、对照组有少量的单核细胞浸润,水肿较明显,但可见新生的血管在移植神经中形成,再生的轴突通过移植体.6周时,可见较多的许旺氏细胞增生.12周时,再生轴突已通过移植体,有一定量的髓鞘形成,许旺氏细胞增生明显,轴索间水肿减轻.各组移植段中外周的神经再生的轴突数量和髓鞘再生的数量较中心的多,且实验组中外周的轴索间水肿较中心的明显减轻.②术后12周,每组各取5只大鼠,在神经移植体中段随机取视野,400倍显微镜下观察计算1.0 mm2内轴突数,实验组、对照组轴突数显著高于空白组,组间差异有极显著性[(78.3±4.6),(76.1±4.2),(15.0±3.5),t=3.056,t=2.948,P＜0.01].实验组和对照组接近,差异无显著性[(78.3±4.6),(76.1±4.2),t=1.982 P＞0.05].结论局部使用转化生长因子β1质粒,可在局部发挥免疫抑制作用,降低宿主的免疫排斥反应.并使移植体轴突数增多,促进神经生长.     

转化生长因子β_1对坐骨神经移植后免疫耐受的影响

背景:转化生长因子β_1是一种强效细胞生长增殖调节蛋白,在移植免疫的抗排斥反应、移植物血管病发展中扮演重要角色.目的:观察经冷冻处理异体神经移植后,局部注射转化生长因子β_1对移植免疫排斥反应的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-06/2008-06在哈尔滨医科大学动物实验中心完成.材料:受体为清洁级SD大鼠60只,分为3组:自体神经移植组、异体神经移植组、转化生长因子β_1质粒+异体神经移植组,每组20只.供体为40只Wistar雄性大鼠.pAdTrack-CMV-TGF-β_1质粒、pAdEasy-1-Bj51833细胞由哈尔滨医科大学附属四院骨科实验室惠赠.方法:取供体大鼠40只作双侧股后外侧纵切口,分离显露坐骨神经,切取双侧整段坐骨神经,置于无菌冷冻管中保存1周,备用.手术显微镜下将受体鼠自骨二头肌与半腱肌和半膜肌间隙剪开结缔组织,显露坐骨神经,从犁状肌孔下0.5 cm处整齐剪下长约1 cm的坐骨神经.自体神经移植组、异体神经移植组选择粗细相等、已预制冷冻的自体及异体神经移植;转化生长因子β_1质粒+异体神经移植组异体神经移植后于大鼠局部肌肉及神经两断端内注射pAdTrack-CMV-TGF-β_1质粒40 μg/只.主要观察指标:术后3,6,9周各组大鼠运动神经传导速度、病理学和轴突计数检查.结果:转化生长因子β_1质粒+异体神经移植组运动神经传导速度高于新鲜异体神经移植组(P < 0.01),与自体神经移植组比较差异无显著性意义.自体神经移植组、转化生长因子β_1质粒+异体神经移植组术后9周轴突计数较新鲜异体神经移植组高(P < 0.01).转化生长因子β_1质粒+异体神经移植组光镜及电镜可见神经纤维走行正常,排列完好,神经纤维可见血管增生,髓鞘结构较好,神经纤维内见有大量再生髓鞘,许旺细胞明显增多,胞质较发达,大量粗面内质网,线粒体结构清晰,再生的轴突内微丝密集排列,与自体神经移植组接近.异体神经移植组光镜及电镜可见神经纤维数量少、排列紊乱,髓鞘轴突变性明显,大部分神经纤维脱髓鞘崩解,轴突消失,未见再生的神经纤维.结论:局部注射转化生长因子β_1质粒联合冷冻处理的冷藏异体神经移植可以协同减轻移植后产生的免疫排斥反应.     

许旺细胞与脱细胞神经移植物共培养在周围神经损伤修复中的作用

目的：观察体外分离、培养、纯化的许旺细胞对脱细胞神经移植物修复神经损伤舯促进作用，为临床应用组织工程化神经修复周围神经缺损提供实验依据。 方法：实验于2004-04／2005-04在中国医科大学组织工程实验室完成。纳入普通级雄性Wistar大鼠24只，体质量180-220g。随机分为实验组、空白对照组、自体移植对照组共3组，每组8只。分笼饲养。另纳入5-8d龄spmgue-Dawley乳鼠40只，取其双侧坐骨神经与臂丛神经。实验组大鼠右后腿用种植许旺细胞的ARSN桥接人为造成的神经缺损。空白对照组大鼠右后腿用单纯ARSN桥接人为造成的神经缺损。酶反复消化法与差速贴壁法分离和培养许旺细胞；许旺细胞与10mm长的脱细胞神经移植物共培养后，应用外科手术移植到大鼠坐骨神经缺损处，自体移植对照组大鼠右后腿用单纯切断的神经上下颠倒原位桥接人为造成的神经缺损。13周取材通过透射电镜和扫描电镜观察神经纤维的再生情况。 结果：Wistar大鼠24只全部进入结果分析，没有脱失。①实验组较空白对照组的再生有髓神经纤维均匀，轴索略粗，髓鞘厚度有差别，部分神经纤维髓鞘还未形成板层结构，许旺细胞包绕神经纤维，轴索内微丝微管结构较清晰，无髓神经纤维直径较小，不均匀分布在有髓神经纤维之间，由一层纤维结缔包裹形成纤维束，实验组较自体移植对照组的髓鞘略薄，自体移植组再生神经纤维均较粗，许旺细胞包裹轴突形成排列规则、电子密度较高的髓鞘，髓鞘厚薄基本相同。②实验组可见大量许旺细胞呈双极梭形，并且首尾相连排列成链状或网状特征性分布。许旺细胞还可在神经纤维上的胶原丝上附着。③实验组有髓神经纤维数、髓鞘厚度、G率（有髓纤维总面积／神经干总面积）接近自体移植对照组，差异无显著性意义[（5344&;#177;592），（5514&;#177;373）；（3．13&;#177;0．16），（3．19&;#177;0．25）μm；（48．43&;#177;3．62）％，（57．11&;#177;2．28）％；P〉0．05]；与空白对照组比较差异有显著性意义[（5344&;#177;592），（3191&;#177;236）；（3．13&;#177;0．16），（1．28&;#177;0．33）μm；（48．43&;#177;3．62）％，（31．05&;#177;4．19）％；P〈0.05]。 结论：与许旺细胞共培养的脱细胞神经移植物可加快宿主轴索再生，促进神经损伤修复，是临床修复神经缺损的可行办法。     

外源性转化生长因子β1抗体对胶原瘢痕及神经再生的修复作用

目的：通过神经吻合口局部应用外源性转化生长因子β1的特异性抗体，阻断其诱导局部炎症反应和细胞外基质沉积的作用，以期达到预防或减少神经瘢痕的产生，提高神经修复。方法：实验于2003—04／2005—04在山西医科大学外科实验室完成。选用SD大鼠48只，随机分为转化生长因子β1抗体组和生理盐水对照组，各24只。两组大鼠坐骨神经切断后行神经外膜小间隙缝合，转化生长因子β1抗体组采用微量加样器于神经吻合口间隙内注射质量浓度为50mg／L的Anti-外源性转化生长因子β1溶液0．1mL；生理盐水对照组注射等量生理盐水，逐层缝合伤口。分别于术后4，12周取材，按照Petersen分级标准对皮肤、肌肉、筋膜和神经组织与周围组织粘连的程度进行评估。结果：实验纳入大鼠48只，全部进入结果分析。瘢痕成分的评估：①两组术后大体观察：术后两组大鼠皮肤及肌肉、筋膜愈合良好，均未发生伤口进开、进裂、感染现象。转化生长因子β1抗体组术后12周神经吻合口与周围组织粘连明显减轻，优于生理盐水对照组。②两组术后12周神经组织切片Masson染色结果：转化生长因子B1抗体组神经吻合口远端神经轴索增生活跃．胶原纤维形成较少．以神经外膜为主；生理盐水对照组神经吻合口远端神经纤维生长排列紊乱，连续性差，被胶原纤维包裹，胶原沉积较多，神经外膜肥厚。④术后12周两组Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维含量灰度值测量结果比较：转化生长因子β1抗体组Ⅰ型胶原纤维含量明显低于生理盐水对照组[（41．112&;#177;11．065），（49．561&;#177;8．097），P〈0．05]，而Ⅲ型胶原纤维含量基本相似[（34．223&;#177;7．130）．（32．284&;#177;5．497），P〉0．05]。神经再生功能的评估：①术后12周两组坐骨神经功能指数比较：转化生长因子β1抗体组明显高于生理盐水对照组[（-19．090&;#177;22．493），（-28．660&;#177;22．649），P〈0．05]。②两组术后12周电生理学检查结果：转化生长因子β1抗体组神经传导速度明显优于生理盐水对照组[（29．603&;#177;3．972），（16．215&;#177;4．619）m／s，P〈0．05]。③两组术后周围神经纤维的镀银染色及周围神经髓鞘染色结果：转化生长因子β1抗体组髓鞘厚度和再生神经纤维的直径均优于生理盐水对照组[（1．36&;#177;0．23），（0．93&;#177;0．48）；（9．40&;#177;0．86），（7．99&;#177;0．36）μm；P均〈0．05]。结论：周围神经损伤后神经端或对端的吻合治疗中，局部应用外源性转化生长因子β1抗体，能够抑制或减少局部神经胶原瘢痕的产生，从而有效促进大鼠周围神经功能的恢复。     

化学去细胞神经同种异体移植后近期感觉及运动传导功能的神经电生理观察

目的：以化学去细胞同种异体坐骨神经移植修复犬坐骨神经的粗大和长段缺损，观察其近期神经电生理恢复。方法：12犬随机分成去细胞神经移植组(实验组)和自体神经移植组(对照组)各6犬。右侧坐骨神经造成5．0cm长缺损，以两种神经移植物桥接修复。术后6个月行神经电生理观察，包括小腿三头肌运动诱发电位、神经移植段运动传导速度、感觉诱发电位等。结果：①方波(1．0～2．0mA，0．1ms，1．0Hz)刺激移植段近侧神经，均在小腿三头肌上记录到运动诱发电位曲线。②神经移植段运动传导速度，实验组平均为47．2m／s，对照组为60．9m／s，正常值为122．0m／s。③方波(5．0～10．0mA，0．2ms，1．9Hz)刺激胫神经远端，均在颅顶部记录到感觉诱发电位曲线；两组动物的感觉恢复程度相似，但均不及正常侧。结论：化学去细胞神经同种异体移植修复犬坐骨神经长段缺损，术后6个月近期感觉及运动传导功能恢复与自体神经移植相似。     

化学去细胞神经同种异体移植后近期运动功能的恢复

目的：研究去细胞同种异体神经移植修复大型哺乳类动物粗大和长段周围神经缺损的效果。方法：15只犬分成去细胞神经同种异体移植组6只、自体神经移植组6只、新鲜神经同种异体移植组3只。右侧坐骨神经主干造成5．0cm长缺损，分别以上述3种神经移植物桥接修复。术后6个月进行步态分析：结果：同种异体移植组和自体神经移植组功能恢复一般情况相似．正常组、同种异体移植组及自体神经移植组犬距小腿关节角度平均极大值分别为59．0&;#176;,58.0&;#176;和61．9&;#176;，平均极小值分别为16．4&;#176;，7．6&;#176;和8．4&;#176;。新鲜神经同种异体移植组无任何恢复；同种异体移植组和自体神经移植组的右后肢运动及步态周期非常相似，距小腿关节跖屈及背伸肌群的肌力均有一定程度的恢复，但不及正常犬。结论：化学去细胞神经同种异体移植修复犬坐骨神经长段缺损．在术后6个月近期运动功能恢复与自体神经移植相似。     

应用组织工程化周围神经修复大鼠坐骨神经缺损的实验研究

目的：探讨组织工程化周围神经修复大鼠坐骨神经缺损的可行性。方法：应用预制的组织工程化周围神经修复大鼠坐骨神经15mm缺损。术后12周，分别进行显微解剖观察，再生轴突神经电生理测定，再生轴突生长和成熟情况的组织学观察及其图像分析处理。结果：组织工程化周围神经移植体结构完整，组织相容性良好：组织工程化周围神经移植组与自体神经移植组相比相对动作电位幅值恢复率差异无显著性意义(P&;gt;0．05)。再生轴突在组织工程化周围神经移植体内生长良好，并可见较好的髓鞘结构形成。组织工程化周围神经移植组与自体神经移植组相比再生轴突密度恢复率差异无显著性意义(P&;gt;0．05)。结论：组织工程化周围神经可修复大鼠坐骨神经15mm缺损；