Ⅰ型胶原基因启动子研究进展

Ⅰ型胶原由α1(Ⅰ)链(COL1A1)与α2(Ⅰ)链(COL1A2)组成,人COL1A1与COL1A2基因的启动子都已鉴定并克隆.调节转录的核因子有Sp1、NF-1、AP-1、CBF、NF-κB、C-myb、c-Krox、BFCOL1、Zf9、Sp3、Smads、TGP、Egr-1、TWIST与NP/NMP4等.在COL1A1和/或COL1A2基因启动子上已鉴定出TGFβ、糖皮质激素、TNFα、IFNγ与视黄酸等的应答元件.     

COL1A1基因PCOL2和Sp1结合位点多态与先天性髋脱位的关联分析

目的 研究Ⅰ型胶原a1链(collagen type Ⅰ alpha 1，COL1A1)基因PCOL2和Sp1结合位点多态性在中国北方人群中的分布，并探讨其与先天性髋脱位(congenital dislocation of the hip，CDH)的关系。方法 在81个CDH核心家系的243名成员中，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析方法，对位于COLIAI基因启动子内的PCOL2多态(-1997G／T)和转录调控区第1内含子内的Sp1多态(1546G／T)进行基因分型，并进行传递不平衡检验。结果COL1A1，基因PCOL2结合位点G／T多态与CDH不存在明显关联(P=0．537)，中国人PCOL2多态位点的基因型和等位基因频率分布与西班牙白人群和美国白人群差异存在统计学意义；Sp1结合位点只检测到SS基因型，未检测到Ss或ss基因型。结论 COL1A1基因PCOL2和Sp1结合位点多态存在种族差异，PCOL2和Sp1结合位点多态可能与中国人CDH的发病风险无关。     

北京地区汉族人群Ⅰ型胶原基因Sp1结合位点多态性的研究

目的　探讨北京地区汉族人群 型胶原 (collagen type α1 ,COL1A1)基因 Sp1结合位点多态性的分布规律。方法　用聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性分析方法 ,对北京地区汉族 134名绝经后妇女和 43名健康男性的 COL 1A1基因 Sp1结合位点多态性进行了检测。结果　 134名绝经后妇女和 43名男性均为 SS基因型 ,即无多态位点。结论　中国汉族人可能缺乏或罕有 COL 1A1基因 Sp1结合位点多态性 ,与朝鲜人及日本人相同 ,而与高加索人种显著不同。     

COL1A1敲除抑制卵巢癌细胞 ES-2增殖

目的:探讨Ⅰ型胶原α1链(collagen type I alpha 1 chain,COL1A1)基因缺失是否抑制卵巢癌细胞的增殖。方法:构建COL1A1基因敲除的载体PX459-COL1A1,转染人卵巢癌ES-2细胞并用嘌呤霉素筛选,获得COL1A1敲除的ES-2细胞。用基因组测序方法检测COL1A1基因的编辑;细胞增殖、集落形成和细胞迁移实验检测COL1A1缺失对卵巢癌细胞增殖、集落形成及迁移的影响;细胞周期和细胞凋亡实验检测COL1A1缺失对卵巢癌细胞周期和凋亡的影响。裸鼠荷瘤模型体内实验研究COL1A1基因敲除对卵巢癌细胞增殖的影响。结果:Western blot和DNA测序结果显示CRISPR/Cas9方法可以编辑ES-2细胞的COL1A1基因,从而抑制COL1A1蛋白表达。COL1A1缺失显著抑制细胞增殖、软琼脂集落形成能力和细胞迁移(P<0.01)。此外,COL1A1缺失将卵巢癌细胞阻滞于G₂期(P<0.01),并促进细胞凋亡(P<0.01)。分子机制研究表明COL1A1缺失可以明显抑制成骨细胞特异性转录因子osterix和基质金...     

胰岛素样生长因子1和胰岛素对人α1(Ⅰ)前胶原启动子活性的影响

目的 :探讨胰岛素样生长因子 1(IGF 1)和胰岛素对人α1(Ⅰ )前胶原 (COL1A1)基因启动子的调控作用及肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFNγ)、干扰素α(IFNα)对这一作用的影响。方法 :构建含COL1A1基因启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)报告基因的重组体pCOLH0 2 7与pCOLH2 5 ,它们分别含该启动子序列 2 68～ 4 2bp( 0 2 7kb)与 2 4 83～ 4 2bp( 2 5kb)片段。将这 2个重组体瞬时转染人皮肤成纤维细胞 ,加入IGF 1或胰岛素 ,部分细胞还加入TNFα或IFNγ或IFNα,测定CAT活性。结果 :13nmol/LIGF 1使转染后的这 2个重组体活性分别增高 3 68倍与 4 0 4倍。 2 5 μmol/L的胰岛素亦使之分别增高 3 69倍与 3 93倍。TNFα、IFNγ、IFNα能降低IGF 1与胰岛素诱导的pCOLH2 5活性。结论 :IGF 1和胰岛素能在转录水平促进COL1A1基因的表达 ,TNF α、IFNγ、IFNα能抑制IGF 1和胰岛素的这一作用。     

COL1A1/COL1A2基因突变分析与成骨不全的产前基因诊断

目的对有成骨不全(Osteogenesis Imperfecta,OI)孕史的患者,进行系统B超及COL1A1/COL1A2基因检测,希望建立OI患儿产前诊断方案,为OI患儿进行产前诊断提供技术保障。方法对于有OI孕史的孕妇,进行系统B超监测;根据胎儿股骨、长骨的超声影像学表现,初诊为成骨不全。抽取羊水,采用直接测序法对羊水DNA的COL1A1和COL1A2基因全编码外显子及启动子区域进行突变位点检测。检出的新突变,对孕妇夫妇及家系其他成员直接测序证实。产前诊断标本均需做母血污染鉴定。结果胎儿超声影像学表现为股骨短小,胫腓骨弯曲成角,颅骨变薄且发现多处骨折,考虑OI。STR法鉴定,羊水无母血污染。DNA序列分析结果显示COL1A1基因鉴定出19个SNP位点,没有鉴定出突变位点;COL1A2基因鉴定出13个SNP位点及第36外显子的第2180位置碱基发生错义突变位点(c.2180G>A,p.Gly727Asp)。孕妇在COL1A2基因的第36外显子亦存在错义突变位点(c.2180G>A,p.Gly727Asp),但其临床特征不一致。其他成员均未检测到Gly727Asp突变。结论有OI孕史的孕妇,采取B超和COL1A1/COL1A2基因诊断技术,可以快速、有效对高危胎儿做出确诊,为预防患病胎儿出生提供技术保障。     

胰岛素样生长因子1和胰岛素对人a1（I）前胶原启动子活性的影响

目的：探讨胰岛素样生长因子1（IGF-1）和胰岛素对人a1(I)前胶原（COL1A1）基因启动子的调控作用及肿瘤坏死因子a(TNFa）、干扰素γ（IFNγ）、干扰素a(INFa）对这一作用的影响。方法：构建含 COL1A1基因启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶（CAT）报告基因的重组体pCOLH0.27与pCOLH2.5,它们分别含该启动子序列-268～ 42bp(0.27kb)与-2483～ 42bp(2.5kb)片段。将这2个重组体瞬时转染人皮肤成纤维细胞,加入IGF-1或胰岛素,部分细胞还加入TNFa或IFNγ或IFNa,测定CAT活性。结果：13nmol/L IGF-1使转染后的这2个重组体活性分别增高3.68倍与4.04倍。2.5umol/L的胰岛素亦使之分别增高3.69倍与3.93倍。TNFa、IFNγ、IFNa能降低IGF-1与胰岛素诱导的pCOLH2.5活性。结论：IGF-1和胰岛素能在转录水平促进COL1A1基因的表达,TNF-a、INFγ、IFNa能抑制IGF-1和胰岛素的这一作用。     

营养不良性大疱性表皮松解症的分子遗传学进展

显性和隐性遗传性营养不良性大疱性表皮松解症 (DEB)的致病基因均定位于编码 型胶原基因 (COL7A1)上。COL7A1每一功能区 (三螺旋区、铰链区、启动子区、剪接位点、增强子区等 )内均可能发生突变 ,突变类型有甘氨酸置换、启动子突变、提早终止密码突变 (PTC)等 ;DEB的分子病理发生和遗传异质性与 COL 7A1突变密切相关 ,本文就这些方面的最新研究进展作一综述。     

COL 2A1基因突变与Ⅱ型胶原病

Ⅱ型胶原是关节软骨的主要的结构成分。COL 2A1基因编码的Ⅱ型胶原α1链,3条相同的α1链组成Ⅱ型胶原蛋白。α1链包括N端、三螺旋区和C端,三螺旋区由Gly-X-Y重复序列组成。COL 2A1基因突变位点常发生在Gly-X-Y三螺旋重复位置,且表型突变位点发生在比N端和C端严重。COL 2A1基因突变所导致的一组疾病总称为Ⅱ型胶原病,Ⅱ型软骨成长不全与软骨形成不足、脊柱骨骺发育不良、Kniest发育不良、骨性关节炎以及I型Stickler综合征等,本文就COL 2A1基因突变与Ⅱ型胶原病的研究进展作一综述。     

应用寡核苷酸圈套技术研究胰岛素调控人α1(Ⅰ)型胶原基因转录

目的应用寡核苷酸圈套技术研究胰岛素对人COL1A1基因转录的调控。方法建立稳定转染pCOLH12.5质粒(含CAT基因与人COL1A1基因-2483～ 42bp片段)的WI-38细胞株,加入不同剂量胰岛素,测CAT值;分别瞬时转染不同序列ssPT入克隆细胞株中,加入2.5μmol/ml的胰岛素,测CAT值。结果2.5μmol/ml的胰岛素显著增加了COL1A1基因启动子活性;含sp1位点的ssPT浓度为120 nmol/L时,受胰岛素刺激所增加的CAT值得到显著抑制,不含sp1位点的ssPT无此作用。结论ssPT能够应用于基因转录调控的研究。胰岛素在人COL1A1基因上的反应元件可能位于启动子-129至-105区域内。     

胰岛素样生长因子1和胰岛素对人α1(Ⅰ)前胶原启动子活性的影响1

目的探讨胰岛素样生长因子1(IGF-1)和胰岛素对人α1(Ⅰ)前胶原(COL1A1)基因启动子的调控作用及肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFNγ)、干扰素α(IFNα)对这一作用的影响.方法构建含COL1A1基因启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的重组体pCOLH0.27与pCOLH2.5,它们分别含该启动子序列-268～+42bp(0.27kb)与-2483～+42bp(2.5kb)片段.将这2个重组体瞬时转染人皮肤成纤维细胞,加入IGF-1或胰岛素,部分细胞还加入TNFα或IFNγ或IFNα,测定CAT活性.结果13nmol/LIGF-1使转染后的这2个重组体活性分别增高3.68倍与4.04倍.2.5μmol/L的胰岛素亦使之分别增高3.69倍与3.93倍.TNFα、IFNγ、IFNα能降低IGF-1与胰岛素诱导的pCOLH2.5活性.结论IGF-1和胰岛素能在转录水平促进COL1A1基因的表达,TNF-α、IFNγ、IFNα能抑制IGF-1和胰岛素的这一作用.     

NF-κB结合元件缺失对NOX1启动子转录活性的影响

目的:构建含NADPH氧化酶1(NOX1)近端启动子区的pGL3萤光素酶报告基因载体及缺失NF-κB结合元件的相应载体,分别测定其相应活性,探讨NF-κB结合元件缺失对NOX1启动子区转录活性的影响。方法:采用PCR法克隆NOX1启动子区序列(1 415 bp),将目的片段与pGL3萤光素酶载体分别双酶切、纯化后进行连接(pGL3-NOX1-1415),测序鉴定;应用Alibaba 2.1软件分析NOX1近端启动子区,获取NF-κB结合元件;重叠PCR法将含该元件的启动子区域(88 bp)缺失,并构建相应载体(pGL3-NOX1-1327)。将两载体分别与pRL-TK内参质粒瞬时转染进入A549细胞,采用TNF-α(10μg/L)刺激细胞24 h,萤光酶标仪检测A549细胞的萤光素酶活性。结果:测序鉴定结果提示pGL3-NOX1-1415及NF-κB结合元件缺失的pGL3-NOX1-1327载体构建成功;细胞实验显示,TNF-α刺激后,转染pGL3-NOX1-1415的A549细胞萤光素酶活性明显强于对照组(P0.05),而转染NF-κB结合元件缺失的pGL3-NOX1-1327的细胞萤光素酶活性明显低于转染pGL3-NOX1-1415组(P0.05)。结论:TNF-α诱导A549细胞NOX1基因活化与NF-κB密切相关,NF-κB参与了TNF-α诱导的NOX1基因启动子的转录调控。     

TNF-α基因启动子多态性与多发性骨髓瘤易感性关系的观察

为了探讨TNF α基因启动区 30 8、 2 38位点多态与多发性骨髓瘤 (MM )易感性的关系。采用SSP PCR (sequencespecificprimer PCR )方法检测 5 6例中国汉族MM患者和 114名中国汉族健康对照者TNF α基因启动区 30 8、 2 38位点等位基因频率 ,分析两位点多态性与MM易感性的关系。结果显示 ,MM组与对照组 2 38位点A的频率分别为 15 18% (17/ 112 ) ;15 79%(36 / 2 2 8) ,两组间比较无显著差异 (P =0 884 ) ;MM组与对照组 30 8位点A的频率分别为 1 79% (2 / 112 ) ;9 2 1% (2 1/2 2 8) ,两组间比较有显著差异 (P =0 0 10 ) ,MM组明显低于对照组。结论 :在所研究的人群中未发现TNF α基因启动子 2 38位点多态性与MM易感性相关 ,但MM患者TNF α基因启动区 30 8位点A的频率明显低于对照组 ,推测TNF α 30 8位点A为MM发病的保护性因素     

抵抗素基因启动子-420C/G、细胞色素P4501A1-MspI多态性与吸烟的交互作用对非酒精性脂肪性肝病的影响

目的:探讨抵抗素基因启动子-420C/G、细胞色素P4501A1-Msp I(CYP1A1-Msp I)基因多态性与吸烟的交互作用与非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的关系。方法:采用病例-对照研究的方法,以1 200例NAFLD患者及1 200例健康对照者的外周血白细胞为样本,利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术分析了抵抗素基因启动子-420C/G和CYP1A1-Msp I基因多态性。结果:-420C/G(GG)基因型和CYP1A1-Msp I(m2/m2)基因型频率分布分别为49.75%、50.08%(病例组)和24.00%、24.25%(对照组),两者经χ2检验差异显著(P0.01)。-420C/G(GG)基因型者患NAFLD的风险显著增加。CYP1A1-Msp I(m2/m2)基因型者患NAFLD的风险也显著增加。基因突变的协同分析发现-420C/G(GG)/CYP1A1-Msp I(m2/m2)基因型者在NAFLD组和对照组中的分布频率分别为39.83%和12.83%,两者经χ2检验有显著差异(P0.01)。-420C/G(GG)/CYP1A1-Msp I(m2/m2)基因型者患NAFLD的风险显著增加。病例组的吸烟率显著高于对照组的吸烟率(P0.01),吸烟与-420C/G(GG)和CYP1A1-Msp I(m2/m2)基因型均有交互作用。结论:-420C/G(GG)、CYP1A1-Msp I(m2/m2)基因型和吸烟是NAFLD的易患因素,基因多态性与吸烟的交互作用增加了NAFLD的发病风险。     

盐酸石蒜碱通过Akt/Smad通路抑制肝星状细胞增殖与活化

目的探索并验证盐酸石蒜碱(LH)抗肝纤维化活性,并初步阐明其机制,为LH研发成为抗肝纤维化药物提供理论支持。方法利用I型胶原α1(COL1A1)启动子-荧光素酶报告系统筛选LH抗肝纤维化活性,利用SRB方法检测LH对人肝星状细胞LX2增殖的影响。通过TGF-β1诱导LX2细胞活化建立体外肝纤维化模型,运用q RT-PCR和Western blot方法检测不同浓度LH对肝纤维化标志基因转录水平以及蛋白表达水平的抑制作用。Western blot方法检测肝纤维化相关信号通路的蛋白表达变化。结果 LH可剂量依赖性地抑制COL1A1基因启动子活性,提示其可能有抗肝纤维化活性。LH显著抑制肝星状细胞LX2的增殖,其对LX2细胞的IC_(50)值为(9.79±1.02)μmol/L;LH可以抑制活化的LX2细胞肝纤维化相关基因的mRNA和蛋白的水平;LH可以抑制Akt/Smad信号通路的活性。结论 LH可能通过Akt/Smad信号通路抑制肝星状细胞增殖与活化,从而发挥抗肝纤维化的作用。     

IL-13和乙醇促进人肺成纤维细胞胶原的表达

目的:研究乙醇和/或白细胞介素13(IL-13)对人肺成纤维细胞(HFL-1)Ⅰ、Ⅲ型胶原α1链基因(COL1A1、COL3A1)以及Ⅰ型胶原蛋白(CoⅠ)表达的影响,探讨肺纤维化的机制。方法:培养HFL-1,通过实时定量荧光RT-PCR检测乙醇和/或IL-13对HFL-1细胞IL-13受体(IL-13Rα1、IL-13Rα2、IL-4Rα)mRNA、COL1A1 mRNA和COL3A1 mRNA表达的影响,ELISA的方法检测乙醇和/或IL-13对HFL-1分泌CoⅠ的影响。结果:单独低浓度乙醇(25、50、100、200mmol/L)作用HFL-1后,与对照组相比IL-13Rα1 mRNA与IL-4Rα mRNA水平比对照组显著增高(P<0.05),而IL-13Rα2 mRNA水平比对照组显著降低(P<0.05)。单独低浓度乙醇(25、50、100、200 mmol/L)对HFL-1的COL1A1 mR-NA和COL3A1 mRNA表达无影响(P>0.05)。IL-13(10、20、50μg/L)可以促进HFL-1的COL1A1 mRNA和COL3A1 mR-NA的表达(P<0.05),且存在浓度依赖性。乙醇(200 mmol/L)与IL-13(10、20、50μg/L)共同作用刺激HFL-1促进COL1A1 mRNA和COL3A1 mRNA的表达比IL-13(10、20、50μg/L)单独作用强(P<0.05)。IL-13组(10、20、50μg/L)和乙醇(200 mmol/L)与IL-13(10、20、50μg/L)共同刺激组HFL-1均有CoⅠ的分泌,但共同刺激组HFL-1分泌CoⅠ量显著增加(P<0.05)。结论:单独低浓度乙醇(25、50、100、200mmol/L)不影响HFL-1细胞的COL1A1和COL3A1表达,但可以影响HFL-1细胞IL-4Rα、IL-13Rα1和IL-13Rα2的表达,而乙醇与IL-13共同刺激与单独IL-13刺激相比对HFL-1的COL1A1和COL3A1以及CoⅠ的表达有显著的促进作用。     

Sp3对β-catenin基因转录调控作用初探

 目的:观察转录因子Sp3对β-catenin启动子转录活性的影响,探讨Sp3与Wnt/β-catenin信号通路的关系。方法:采用脂质体法将Sp1和(或)Sp3转录因子表达质粒单独/共同与β-catenin启动子（-410/-1 bp）报告基因质粒瞬时转染HEK293T细胞;通过双萤光素酶报告基因实验检测报告基因转录活性的变化。结果:（1）Sp1表达质粒在0.4 μg剂量时能提高启动子的活性2.4倍,Sp3表达质粒在0.4 μg剂量时能显著提高启动子的活性5.3倍。（2）0.4 μg总量的Sp1与Sp3表达质粒共转染293T细胞,随着Sp3/Sp1比例的递增,β-catenin启动子转录活性无明显变化。（3）共同转染Sp1 0.3 μg与Sp3 0.1 μg时,启动子活性提高3.5倍,比单独转染的转录活性强。结论: Sp3能促进β-catenin基因启动子（-410/-1 bp）的转录,Sp1的转录激活作用则较弱;在转录过程中Sp1和Sp3可能存在协同作用;Sp3可能在转录水平调控β-catenin的表达从而影响Wnt/β-catenin信号通路。     

营养不良性大疱性表皮松解症的分子遗传学进展

显性和隐性遗传性营养不良性大疱性表皮松解症（DEB）的致病基因均定位于编码Ⅶ型胶原基因（COL7A1）上，COL7A1每一功能区（三螺旋区，铰链区，启动子区，剪接位点，增强子区等）内均可能发生突变，突变类型有甘氨酸置换，启动子突变，提早终止密码突变（PTC）等；DEB的分子病理发生和遗传异质性与COL7A1突变密切相关，本就这些方面的最新研究进展作一综述。     

胃癌相关基因COL1A2、FN1、COL6A3预后分析

目的分析胃癌和癌旁组织差异表达基因,筛选出胃癌相关的关键基因,分析关键基因与胃癌预后的关系。方法利用NCBI(美国国立生物技术信息中心)公共数据平台GEO(Gene Expression Omnibus)中胃癌基因芯片数据GSE2685、GSE19826、GSE79973,采用GEO在线分析工具GEO2R分析数据,选取TOP250,输出差异表达基因,并通过在线生物信息学绘制韦恩图,获得共有差异基因;通过KM plotter数据库的应用分析COL1A2、FN1、 COL6A3与预后的关系。结果通过分析GSE2685、GSE19826、GSE79973芯片数据,共获得6个共表达基因,利用差异倍数作图,选取差异倍数在2倍以上的基因COL1A2、FN1、COL6A3进行分析,KM plotter数据库的分析显示COL1A2、FN1、COL6A3与胃癌的总生存期成负相关。结论 COL1A2、FN1、COL6A3在胃癌组织中表达高于癌旁组织,是胃癌的危险因素,其表达水平越高预后越差。