普氏立克次体120kDa表面抗原C段基因的克隆与表达

采用PCR方法 ,从普氏立克次体基因组中扩增出 1 2 0kDa表面抗原C段基因片断 ,并将其克隆于原核表达载体pQE30 ,构建重组质粒pQE30 6 7,将重组质粒转入大肠杆菌M1 5 ,用IPTG诱导大肠杆菌内的目的基因表达。SDS PAGE分析发现重组质粒转化菌产生了一 6 7kDa重组蛋白 ;在免疫印迹分析中 ,该 6 7kDa重组蛋白与普氏立克次体免疫血清发生特异反应 ,显示 6 7kDa重组蛋白具有普氏立克次体 1 2 0kDa表面抗原特性     

普氏立克次体14kD蛋白基因的扩增与克隆

根据普氏立克次体弱毒株－Ｅ株１４ｋＤ表面蛋白基因的ＤＮＡ序列设计合成了一对寡核苷酸引物，二引物的５＇端分别加上了限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切位点。采用此引物对成功地扩增了普氏立克次体强毒株－－Ｂｒｅｉｎｌ株（国际标准株）的１４ｋＤ表面蛋白基因，基因的分子大小为０．７２ｋｂ。扩增获得的基因ＤＮＡ经限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ和ＥｃｏＲＩ酶切后与经相同酶切的质粒载体ｐＵＣ１９连接，转化受体大肠杆菌工程菌ＪＭ１０３，经酶切和ＤＮＡ斑点杂交鉴定，成功地克隆了扩增的普氏立克次体强毒株（Ｂｒｅｉｎｌ株）的１４ｋＤ表面蛋白基因。     

钩端螺旋体属特异性外膜蛋白抗原的分析

致病性问号钩端螺旋体(简称钩体)血清群众多,各群间交叉保护作用较弱或无,目前国内外均采用当地流行的钩体血清群来制备多价钩体疫苗,但对疫苗中未包含钩体血清群感染的保护作用极其有限,易造成钩体病的暴发流行。已知80℃灭活、生理盐水回收的腐生性双曲钩体PatocⅠ株全细胞抗原(TR PatocⅠ)能与所有钩体病人血清发生凝集反应,但其抗血清能否凝集不同血清群的问号钩端螺旋体尚不清楚。本研究中,我们采用TR PatocⅠ免疫的兔抗血清与我国15群17型问号钩体参考标准株、2群2型双曲钩体国际标准株进行了显微镜凝集试验(MAT) ,发现该抗血清能…     

用16S rRNA探针定量测定普氏立克次体在细胞内的 …

目的 以普氏立克次体为研究对象，建立一种定量测定胞内微生物敏感的方法。方法 从立克次体感染细胞提取总ＲＮＡ为样品或用硫氰酸胍裂解感染细胞，以裂解物为样品，用＾３２Ｐ标记的１６Ｓ ｒＲＮＡ特异探针做ＥＮＡ酶保护分析。根据探针分子结合数，计算出检测到的靶序列分子数，反映细胞内微生物的繁殖量。     

用16S rRNA探针定量测定普氏立克次体在细胞内的繁殖量

目的以普氏立克次体为研究对象，建立一种定量测定胞内微生物繁殖的方法。方法从立克次体感染细胞提取总ＲＮＡ为样品或用硫氰酸胍裂解感染细胞，以裂解物为样品，用３２Ｐ标记的１６ＳｒＲＮＡ特异探针做ＲＮＡ酶保护分析。根据探针分子结合数，计算出检测到的靶序列分子数，反映胞内微生物的繁殖量。结果从０．５μｌ直接裂解物可检测到３．９４×１０４个１６ＳｒＲＮＡ分子；从６ｐｇ的总ＲＮＡ中可检测到５．８２×１０４个１６ＳｒＲＮＡ分子。用本法试测立克次体在宿主细胞内的生长曲线，只表现出迟缓期及对数生长期，而无稳定期及衰退期。结论用特异性探针通过ＲＮＡ酶保护分析法可以定量测定胞内微生物在宿主细胞内的繁殖量。由本法测定到的普氏立克次体生长曲线表明难以沿用细菌的生长曲线来描述胞内微生物在宿主细胞内的生长过程     

前列腺特异性膜抗原蛋白在正常和肿瘤组织中的表达及其在前列腺癌诊断中的敏感性和特异性

前列腺癌主要是通过淋巴道和血道向远处器官转移，人体几乎任何一个器官均可发生前列腺癌转移，其中骨、肝脏和肺是最常转移的器官。另外，前列腺癌也能够直接侵犯邻近器官如膀胱。当怀疑有前列腺癌转移时，免疫组化被常规用于识别肿瘤来源。前列腺特异性抗原（PSA）和前列腺特异性酸性磷酸酶（PAP）是2种最常使用的免疫标记物，     

黑龙江立克次体外膜蛋白B基因表达及表达重组蛋白的抗原性分析

黑龙江立克次体为远东蜱传斑点热病原体,本文以黑龙江立克次体基因组为模板,扩增ompB的4段基因,利用原核表达载体构建重组表达质粒,IPTG诱导重组质粒转化的大肠杆菌表达重组目的蛋白,并对其抗原性进行分析.免疫印迹反应表明,重组表达的4个蛋白均与黑龙江立克次体感染小鼠血清反应.该4个重组蛋白分别免疫小鼠后,分析其血清的特...     

LSP抗原种属和器官特异性的研究

本文应用抗人—LSPMcAb通过ABC—免疫组织化学法和活细胞免疫吸附试验,探讨了人LSP抗原的种属和器官特异性.结果发现.人、兔、大鼠、豚鼠4种动物的肝、肾、大肠以及牛的肝、肾组织中均存在着能与抗人—LSPMcAb产生不同程度结合反应的种属非特异性和器官非特异性的抗原决定簇.本研究为进一步探讨LSP的种属和器官特异性提供了可靠的方法,同时也为应用动物LSP复制自身免疫性肝病模型提供了理论依据。     

iNOS N端融合蛋白在大肠杆菌中的表达及抗体制备

目的表达ｉＮＯＳＮ端片段并制备ｉＮＯＳ特异性抗体。方法将ｉＮＯＳＮ端片段装入原核表达载体ｐＥＴ－２８ａ（＋）,在大肠杆菌ＢＬ２１中表达,Ｈｉｓ．ＢｉｎｄＴＭ柱亲和层析分离纯化及凝胶蛋白回收的两步纯化法纯化目的蛋白,使用纯化蛋白制备ｉＮＯＳ多克隆抗体。结果得到具有较高表达量的融合蛋白,经两步纯化获得ｉＮＯＳＮ端融合蛋白纯品,将此蛋白免疫家兔,得到ｉＮＯＳ多克隆抗体,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实该抗体具有较好的反应性及特异性。结论原核表达ｉＮＯＳＮ端片段制备ｉＮＯＳ抗体具有很好的特异性。     

重组人Jo-1自身抗原的克隆、原核表达及抗原特异性鉴定

目的:旨在获得高纯人Jo-1抗原(即组氨酰-tRNA合成酶)。方法:利用RT-PCR从人胎盘总RNA中获得Jo-1的编码基因,并分别用IMPACT-CN和pMAL系统的pTYB11、pMAL-c质粒,构建了表达载体,转化至大肠杆菌ER2566、BL21。结果:经筛选与鉴定,得到阳性重组子诱导表达后均获得Jo-1融合蛋白。Western blot显示,这两种融合蛋白都具有Jo-1抗原特异性,即仅与含Jo-1抗体的多肌炎和皮肌炎自身免疫病患者血清反应,而与正常人以及188例含有其他自身抗体(分别为RNP阳性、Sm阳性、Ro/La阳性和RNP/Ro阳性)的患者血清均为阴性反应。结论:在两种表达载体中,pMAL-c-Jo-1的表达量超过菌体蛋白的50%,而且以可溶性形式存在,有利于分离纯化,为临床检测创造了条件。     

恙虫病立克次体sta58主要抗原基因片段的克隆及表达

作者设计合成一对ＤＮＡ引物，经ＰＣＲ扩增出Ｋａｒｐ及ＣＭＹ株恙虫病立克次体ｓｔａ５８主要抗原基因片段，分别建立其无性繁殖系，构建了表达质粒ｐＢＶＲＫ５和ｐＢＶＲＣ４５，在国内首次应用大肠杆菌成功表达了恙虫病立克次体抗原。其意义在于为我国恙虫病立克次体研究提供特异性核酸探针，为恙虫病基因工程诊断试剂的研制奠定物质基础。     

旋毛虫Ts87重组蛋白诱导的小鼠黏膜免疫保护性研究

本实验探讨旋毛虫Ts87重组蛋白灌胃免疫小鼠诱导的黏膜免疫保护性作用。实验分对照组、佐剂组(霍乱毒素B亚单位组,CTB)和免疫组(CTB Ts87重组蛋白),灌胃免疫,间隔1周共免疫3次。末次免疫后第7天用400条旋毛虫感染期幼虫攻击,比较3组小鼠肠道成虫数、雌虫生殖力和肌幼虫数。且于末次免疫后第7天刮取肠黏液、取血检测特异性sIgA、IgG抗体水平。结果显示免疫组小鼠成虫减虫率、新生蚴减虫率、肌幼虫减虫率分别是81·34%、67·02%、84·49%;小鼠肠黏液sIgA水平及血清IgG水平显著高于对照组和佐剂组。结果表明Ts87重组蛋白黏膜免疫能够诱导小鼠产生抗旋毛虫的保护性免疫。灌胃免疫能显著提高肠黏液特异性sIgA水平,对促进肠道成虫的排出有明显作用。     

全沟硬蜱、森林革蜱及嗜群血蜱经卵传播新塔拉塞维奇立克次体的检测研究

本研究旨在明确新塔拉塞维奇立克次体是否可以在全沟硬蜱、森林革蜱及嗜群血蜱3种媒介蜱中经卵传播。以在东北林区采集的牛寄生饱血雌蜱为样本,在实验室条件下人工培育,以获得3种蜱的不同时期的形态,并使用PCR方法检测各虫态中新塔拉塞维奇立克次体的感染情况,从而研究新塔拉塞维奇立克次体在蜱生活周期中的传递规律。共采集牛寄生饱血雌蜱91只,其中全沟硬蜱14只,森林革蜱55只,嗜群血蜱24只。新塔拉塞维奇立克次体感染率为85.71%,5.45%,12.50%。卵的最低感染率分别为全沟硬蜱(2%)、森林革蜱(1.3%)、嗜群血蜱(1.1%),幼蜱的最低感染率分别为全沟硬蜱(5%)、森林革蜱(1.7%)、嗜群血蜱(2.2%)。且3种蜱雌蜱、卵、幼虫均检测到的新塔拉塞维奇立克次体,序列比对一致。感染的幼蜱均可通过叮咬使小鼠感染,三种蜱都能经卵传播新塔拉塞维奇立克次体。全沟硬蜱感染率高可能是东北林区新塔拉塞维奇立克次体的主要媒介蜱。     

重组表达的着丝粒蛋白-B N-端抗原在抗着丝粒自身免疫病血清检测中的应用

目的 分析重组表达的CENP-B抗原对抗着丝粒自身免疫病血清的鉴定结果,探讨其作为临床诊断指标的可行性。方法 通过构建原核表达载体,在大肠杆菌中高效表达CENP-B-N端300个氨基酸的1段多肽;纯化包涵体,制备重组表达的CENP-B抗原,并利用ELISA、Western blot的方法对临床诊断为阳性的ACA血清进行鉴定。结果 重组表达的CENP-B N-端抗原对ACA血清的ELISA阳性检出率为99％,Western blot阳性检出准确率为97％。结论 重组表达的CENP-B抗原可以作为抗着丝粒自身免疫病血清临床诊断的1个指标。     

精子蛋白sp32/OY-TES-1mRNA及其蛋白在正常组织表达的探讨

目的 了解正常组织中sp32/OY-TES-1 mRNA的表达量是否存在差异以及该蛋白的表达情况,为sp32/OY-TES-1表达谱增加更多信息.方法 提取40例(19种)正常组织总RNA,逆转录-聚合酶合成cDNA,普通PCR检测cDNA质量;构建目的 基因sp32/OY-FES-1及看家基因HPRT质粒,制备标准品,绘制标准曲线,建立实时定量PCR(TaqMan)方法和优化反应体系,检测组织中sp32/OY-TES-1和HPRT的表达,sp32/OY-TES-1mRNA的表达量以OY-TES-1/HPRT表示.通过制备的OY-TES-1多克隆抗体,结合免疫组织化学检测sp32/OY-TES-1蛋白在多种正常组织中的表达.结果 正常组织中sp32/OY-TES-1mRNA阳性率为72.50%(29/40);2.非睾丸正常组织中sp32/OY-TES-1 mRNA的相对表达量值(目的 基因/看家基因)为0.000 1～0.495 0,呈对数正态分布;3.睾丸组织中sp32/OY-TES-1 mRNA的相对表达量为44.9,是其他正常组织的91～1 000倍;4.免疫组织化学(IHC)显示在所检测的多种正常组织和细胞中(10例睾丸组织、8例结肠、7例肝、6例骨骼肌、5例胃、5例晶状体、4例精子、3例外周血白细胞和1例肾),除4例精子和1例肾组织中的肾小管外,其余均未见OY-TES-1蛋白阳性反应.结论 sp32/OY-TES-1 mRNA广泛地表达在各种正常组织,表达量因组织不同而异;睾丸组织是所检测的正常组织中其mRNA表达量最高的组织.而sp32/OY-TES-1蛋白比其mRNA更具有限制性表达的特点.     

旋毛虫Hsp70与Ts87融合蛋白的构建表达及鉴定

本文构建并表达了旋毛虫热休克蛋白70（Ts－Hsp70）与排泄分泌抗原Ts87的融合蛋白,并对融合蛋白进行纯化和免疫学鉴定。本研究采用限制性内切酶EcoRⅠ酶切位点将目的基因Ts－Hsp70与Ts87相连接,插入pET28－a （＋）质粒,转入大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达、纯化,获得的融合蛋白rTs－Hsp70－Ts87用Western blot的方法鉴定。经PCR、酶切鉴定、测序分析,结果显示,目的基因片段大小为2721 bp,构建的重组质粒与预期相符。经IPTG诱导表达,通过镍离子柱层析纯化复性后得到可溶的融合蛋白rTs－Hsp70－Ts87,其相对分子质量约为100 kDa; Western blot结果显示,该蛋白可被抗His标签单抗、 rTs－Hsp70免疫血清、 rTs87免疫血清识别。以上结果表明,本研究成功构建并表达了融合蛋白rTs－Hsp70－Ts87,为进一步研究rTs－Hsp70－Ts87的免疫保护性,开发新的有效抗旋毛虫病的疫苗奠定基础。     

弓形虫分泌蛋白ROP2的原核重组表达与免疫反应性鉴定

本研究在大肠杆菌工程菌中重组表达弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）,并初步评价其免疫反应性。主要步骤为体外细胞培养速殖子,提取总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增ROP2基因全长,与pET-41 Ek／LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌Rosetta^TM（DE3）pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白GST-6×His—ROP2,最后以重组蛋白与人源弓形虫抗血清的Western blotting反应评价rROP2免疫反应性。本研究获得了ROP2全长重组蛋白,初步证明其良好的免疫反应性,为进一步改进弓形虫免疫学诊断方法,研究分泌蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础。     

乙型肝炎表面抗原124aa分子在大肠杆菌中的高效表达

利用聚合酶链反应特异性扩增编码乙型肝炎表面抗原羧基末端１２４个氨基酸的基因片段,并将其大肠杆菌中获得了高效表达。表达产物氨基末端有１个含６组氨酸肽段的２０氨基酸融合部分,分子量１６１７８Ｄａ,以包含体形式存在,约占细菌总蛋白２２％。