低强度脉冲超声波对β－磷酸三钙与兔骨髓基质干细胞相容性的影响

目的研究低强度脉冲超声波(LIPUS)对-磷酸三钙(-TCP)与兔骨髓基质干细胞(BMSCs)相容性的影响。方法抽取新西兰白兔的骨髓,分离纯化获取BMSCs,加入条件培养基和-TCP体外混合培养并随机分为两组,一组应用LIPUS对BMSCs每天作用20分钟,另一组作为对照未予作用。通过倒置相差显微镜观察细胞增殖分化情况,分别于1周、2周、3周后停止LIPUS作用,在扫描电镜下观察细胞生长情况,评估TCP与BMSCs的相容性。结果BMSCs在两组-TCP表面生长繁殖良好。混合培养1周、2周时,实验组TCP表面BMSCs数目较对照组明显增多,并具有统计学意义(<0.05)。混合培养3周时,实验组TCP表面BMSCs数目与对照组相比无统计学差异(﹥0.05)。结论LIPUS可以提高培养早期-TCP和BMSCs的生物相容性,而对于培养晚期TCP和BMSCs的生物相容性无明显影响。     

不同比例羟基磷灰石/β-磷酸三钙涂层支架修复骨缺损

背景：羟基磷灰石/β-磷酸三钙双相磷酸钙陶瓷具有良好的生物相容性与骨传导能力,可以作为涂层材料联合用于超临界骨缺损修复,但羟基磷灰石/β-磷酸三钙涂层的最佳质量比目前尚无明确报道。目的：在兔桡骨超临界骨缺损部位植入不同比例羟基磷灰石/β-磷酸三钙涂层多孔生物陶瓷支架,评估其修复作用,以期获得最佳的涂层比例。方法：采用3D打印技术制备羟基磷灰石多孔生物陶瓷支架,并在其表面使用不同比例的羟基磷灰石与β-磷酸三钙(二者质量比分别为3∶7,5∶5,7∶3)进行涂层处理,然后对支架的细胞毒性、孔隙率、力学强度、涂层厚度等参数进行测试。在36只新西兰大白兔右前肢建立15.0 mm兔桡骨超临界骨缺损模型,随机分4组处理,每组9只：空白组不植入任何材料,3∶7涂层组、5∶5涂层组、7∶3涂层组分别植入对应质量比例涂层的羟基磷灰石多孔生物陶瓷支架,术后4,8,12周,分别进行X射线片及Micro-CT检查、Van-Gieson染色、苏木精-伊红染色及Ⅰ型胶原蛋白免疫组织化学分析。结果与结论：(1)3∶7、5∶5、7∶3涂层支架的细胞毒性均为0级,涂层厚度为(75.2±0.54)μm,孔隙率分别为(54....     

多孔纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架材料复合成骨细胞的异位成骨

目的评价多孔纳米羟基磷灰石/壳聚糖﹙nHA/CS﹚支架与成骨细胞复合植入大鼠股部肌袋模型内的异位成骨能力。方法采用共沉淀和粒子沥滤法制备多孔nHA/CS。分离培养培养SD大鼠成骨细胞,并将其与多孔nHA/CS共同培养来构建组织工程骨。将所构建的组织工程骨和空白nHA/CS支架材料分别植入SD大鼠股部肌袋模型内。分别在植入2、4、6、8周后,将植入的支架材料取出行苏木精-伊红染色观察新骨形成情况,并应用JEDA-801D形态学图象分析系统来计算新骨生成率。用SPSS13.0软件包对测定结果进行单因素方差分析。结果在各观察时间段内成骨细胞复合多孔nHA/CS组新骨生成量均多于nHA/CS。结论多孔nHA/CS复合成骨细胞支架材料具有异位成骨能力。     

纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸支架材料对人成骨细胞早期附着影响的实验研究

目的以人成骨细胞（MG-63细胞）复合纳米羟基磷灰石／胶原／聚乳酸[nano-hydroxyapatite/collagen/poly（L-lactic）acid，nHAC／PLA]支架材料进行体外培养，观察其早期附着生长情况。方法将MG-63细胞在nHAC／PLA支架材料上培养，通过倒置显微镜观察、HE染色、ALP染色、细胞增殖指数测定等方法对细胞在nHAC／PLA支架材料上的早期附着情况进行研究。结果细胞在nHAC／PLA上生长良好；ALP染色阳性度高，细胞增殖指数比空白对照组有显著提高。结论nHAC／PLA支架有利于MG-63细胞的早期黏附、生长，可以用作骨组织工程的支架材料。     

射频磁控溅射法制备羟基磷灰石/β-磷酸三钙生物涂层

目的以粉末冶金烧成的羟基磷灰石(HA)/-β磷酸三钙(β-TCP)陶瓷为靶材,采用磁控溅射法在钛合金(Ti6Al4V)基体上制备HA/β-TCP生物涂层。方法利用XRD研究了复合涂层的晶化程度,讨论了涂层成分与生物降解性及相容性的关系。结果HA/β-TCP生物涂层为非晶态,经700℃,3h大气处理可显著提高涂层的晶化程度,当涂层成分为50wt%HA/50wt%β-TCP时其细胞相容性最好。结论在钛合金基体上制备HA/β-TCP生物涂层,通过HA与β-TCP的复合来控制材料的降解速度,使它的降解速度与周围骨组织的生长速度相匹配,使植入体具有良好的生物降解性、生物活性和力学性能。     

原位生长纳米羟基磷灰石晶须增强β-磷酸三钙多孔支架的生物安全性

背景：通过纳米羟基磷灰石原位生长明显提高了磷酸钙支架的强度与韧性。 目的：体外评价纳米羟基磷灰石晶须/β-磷酸三钙(nHAW/β-TCP)作为人工骨支架材料的生物相容性。 方法：急性全身毒性试验：30只小白鼠随机分为静脉实验组,腹腔实验组和对照组,分别注射浸提液及生理盐水,24,48,72 h观察动物的一般状态。溶血试验：材料浸提液与稀释人鲜血混合观察红细胞溶解情况,545 nm下检测A值计算溶血率;致敏试验：16只豚鼠随机分为实验组、阴性对照组和阳性对照组,每只豚鼠脊柱两侧皮内注射等体积nHAW/β-TCP支架材料浸提液、生理盐水及二硝基氟苯。于注射后即刻和24,48,72 h观察局部皮肤反应。细胞毒性试验：材料浸提液培养细胞进行细胞形态大体观察,采用CCK-8法观察细胞活性。 结果与结论：急性全身毒性试验：人工骨浸提液静脉及腹腔注射后不引起小鼠呼吸、进食改变或死亡,体质量稳定。溶血试验：nHAW/β-TCP的溶血率小于ISO规定的5%,可认为这种材料无溶血作用。致敏试验：豚鼠皮内注射后未出现过敏反应。细胞毒性试验：CCK-8细胞毒性试验显示不同浓度人工骨浸提液的细胞毒性为0级。提示nHAW/β-TCP复合支架不引起全身毒性反应、溶血反应和过敏反应,且无细胞毒性,生物相容性良好,符合组织工程人工骨支架材料的应用要求。     

骨髓间充质干细胞复合羟基磷灰石/磷酸三钙植骨材料的体外研究

目的研究兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)在羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)植骨材料上的黏附增殖情况。方法抽取兔股骨骨髓,进行贴壁培养BMSCs。在成骨诱导液中诱导BMSCs,于7d用钙钴法检测碱性磷酸酶活性,10d进行茜素红矿化结节染色;在成脂诱导液中诱导BMSCs,于21d进行油红O染色。将BMSCs接种到HA/TCP植骨材料上,加入成骨诱导液,采用倒置显微镜、荧光显微镜及扫描电镜检测,并采用四氮唑蓝(MTT)比色法测定HA/TCP植骨材料上BMSCs的增殖情况。结果BMSCs在成骨诱导液中7d碱性磷酸酶呈强阳性,10d矿化结节染色呈橘红色;在成脂诱导液中,21d油红O染色呈阳性。BMSCs在HA/TCP植骨材料上孔隙周围及孔隙内生长良好并大量增殖。MTT分析结果显示,HA/TCP对BMSCs的体外增殖无抑制作用。结论BMSCs与HA/TCP植骨材料有良好的生物相容性。     

改性细菌纤维素/羟基磷灰石复合多孔支架合成方法的研究

探讨不同合成方法对改性细菌纤维素/羟基磷灰石复合支架微观结构和性能的影响。采用原位复合法、物理混合法及生物矿化法制备改性细菌纤维素(TBC)与羟基磷灰石(HA)复合多孔支架,利用扫描电镜(SEM)、能谱分析(EDX)、X射线衍射(XRD)、傅里叶红外变换光谱(ATR-FTI)对不同方法合成的产物进行微观结构表征,同时通过力学实验确定不同支架的力学性能参数。SEM和ATR-FTI等结果表明,采用原位复合法、物理混合法及生物矿化法都可以成功地将HA复合在TBC的纳米纤维上,但是复合的机理各不相同。原位复合法中HA纳米颗粒是以螯合键的方式与TBC纳米纤维上的羧基联合,而物理混合和生物矿化法HA纳米颗粒是采用静电吸附的方式复合在TBC纤维上。XRD表明,不同方法合成的支架都出现了明显的(211)峰,但峰的形态有明显的差别。力学测试结果表明,复合后产物的力学性能也有很大的差异,采用原位复合的支架强度最低,复合后支架强度由4.67 MPa迅速减小到1.00 MPa,而用生物矿化复合的支架强度最高,复合后支架强度由4.67 MPa增加到到5.55 MPa。通过对不同方法合成的复合支架微观结构的表征和分析,为骨组织工程支架的设计提供依据。     

羟基磷灰石生物陶瓷材料的研究概况

羟基磷灰石和β-磷酸三钙(β-TCP)作为最有代表性的生物活性陶瓷材料,在近代生物医学工程学科领域一直受到人们密切关注。本文主要从HAP及其复合材料的合成,特性和应用等方面对HAP生物陶瓷的研究进行综述。     

基于三维打印的磷酸三钙骨组织工程支架烧结工艺研究

磷酸三钙(TCP)是构建骨组织工程支架常用的生物陶瓷材料。三维(3D)打印的TCP支架具有精确可控的孔隙结构,但存在力学性能不足的问题。由于烧结工艺对生物陶瓷支架力学性能的影响至关重要,本文详细探讨了不同烧结温度对3D打印TCP支架的力学性能的影响,测试了不同烧结温度制备的支架的表观形貌、质量和体积收缩率、孔隙率、力学性能以及降解性能。结果表明,当烧结温度为1150℃时,晶粒生长充分、气孔最少,支架具有最大的体积收缩率、最小的孔隙率以及最优的力学性能,压缩模量和抗压强度可以分别达到(100.08±18.6)MPa和(6.52±0.84)MPa,能够满足人体松质骨力学强度的要求。此外,与其他烧结温度下制备的支架相比,1150℃下烧结制备的支架在酸性环境中降解最慢,进一步说明其在长期植入时具有更佳的力学稳定性。该支架可支持骨髓间充质干细胞(BMSCs)黏附和快速增殖,具有良好的生物相容性。综上,本文优化了3D打印TCP支架的烧结工艺,提高了其力学性能,为其作为承重骨的应用奠定了基础。     

Effect of low-intensity pulsed ultrasound on l929 fibroblasts

Introduction

Ultrasound has proven to be an important therapeutic resource regarding musculoskeletal disease and is routinely used in physical therapy and medicine both therapeutically and diagnostically. The aim of the present study was to analyse the effects with different ultrasound intensities in order to establish the ideal radiation level in cell cultures.

Material and methods

Fibroblast cell cultures were divided into five groups: group I – control (did not receive irradiation); group II – 0.2 W/cm² in pulsed mode at 10% (1 : 9 duty cycle); group III – 0.6 W/cm² in pulsed mode at 10% (1 : 9 duty cycle); group IV – 0.2 W/cm² in pulsed mode at 20% (2 : 8 duty cycle); and group V – 0.6 W/cm² in pulsed mode at 20% (2 : 8 duty cycle). Each group was irradiated with 24-h intervals, observing the following post-irradiation incubation times: 24, 48, 72 and 96 h; after 24 h of each irradiation, cultures were analysed using the MTT method.

Results

Analysis of the results following ultrasound irradiation demonstrated that the effect of ultrasound with 0.6 W/cm² in pulsed mode at 10% (1 : 9 duty cycle) was statistically significant in relation to ultrasonic irradiation in pulsed mode at 20% (2 : 8 duty cycle) (p < 0.05).

Conclusions

According to parameters used in the irradiation of cultivated fibroblasts, the pulse mode regime and the control of intensity are of fundamental importance for the optimal use of therapeutic ultrasound. Furthermore, low and medium intensities decreased cell damage, which establishes that acoustic pulsed energy induces the proliferation of fibroblast cells.     

大鼠成骨细胞与壳聚糖/羟基磷灰石复合支架降解产物的生物相容性

背景：人们对壳聚糖/羟基磷灰石复合多孔生物支架在体内的降解过程并非十分清楚,而且有关其降解产物对成骨细胞的影响研究也较少。 目的：分析大鼠成骨细胞与壳聚糖/羟基磷灰石复合多孔生物支架降解产物的生物相容性。 方法：将培养的第2代大鼠成骨细胞分别在壳聚糖/羟基磷灰石复合支架降解产物浸提液和含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液中培养,培养第2,4,6,8,10天分别对两组细胞做MTT细胞计数,采用联合会推荐法测定细胞碱性磷酸酶活性,采用BCA蛋白定量法测定总蛋白。 结果与结论：在壳聚糖/羟基磷灰石复合多孔生物支架降解产物浸提液中培养的大鼠成骨细胞增殖速度、细胞碱性磷酸酶活性、细胞总蛋白合成及碱性磷酸酶与总蛋白的比值明显高于在体积分数为10%胎牛血清DMEM培养液中培养的细胞(P < 0.05)。表明壳聚糖/羟基磷灰石复合多孔生物支架的降解产物不仅可促进大鼠成骨细胞的黏附、生长和增殖,还可增强其骨化功能,具有较好的生物相容性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料;骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性;组织工程全文链接：     

双相钙磷生物陶瓷/硫酸钙骨水泥多孔三维支架的生物性能

背景：随着组织工程技术的发展,多孔生物陶瓷被越来越多的运用到骨缺损的修复中,当前的研究主要集中在这种生物陶瓷的合成及其各项性能的评价。 目的：研究一种新型骨水泥的制备方法并测定其理化性能及与成骨细胞的生物相容性。 方法：共沉淀法制备双相钙磷生物陶瓷粉体,利用胶体团聚成颗粒,烧结后得到颗粒状、多孔羟基磷灰石/磷酸三钙生物陶瓷,并按不同比例与高纯度医用半水硫酸钙混合制备钙磷陶瓷/硫酸钙骨水泥。 结果与结论：X射线衍射证实合成物质为双相钙磷陶瓷,颗粒状双相钙磷陶瓷具有多孔网状结构,骨水泥在   3 min内保持可塑状态,固化时间为15 min,固化温度为36.5 ℃,压缩强度最高为5.82 MPa,MTT毒性级为0级,成骨细胞在材料表面生长良好。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料;骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性;组织工程全文链接：     

低强度脉冲超声通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制骨肉瘤细胞的增殖

目的:阐述低强度脉冲超声（LIPUS）对骨肉瘤细胞增殖的调控作用和机制,探索低强度脉冲超声治疗骨肉瘤的潜在价值。方法:在时间梯度实验中,将MG-63细胞分为LIPUS组和Control组,对LIPUS组加载1、6、12、18和24 h的低强度脉冲超声,CCK-8检测各组细胞增殖活力,Western Blots检测24 h低强度脉冲超声对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响。在机制实验中,将MG-63细胞分为Control组、LY294002组、LIPUS组和LIPUS+740Y-P组,对各组施加对应的干预措施后使用CCK-8检测各组细胞增殖能力,Western Blots检测各组增殖相关蛋白PCNA和Cyclin D1的表达情况。所有数据重复3次后使用单因素方差分析统计。结果:加载低强度脉冲超声18和24 h后,LIPUS组的细胞增殖活力较对照组显著降低（P<0.010, P<0.001）,这些结果表明LIPUS可抑制MG-63细胞的增殖。LIPUS可抑制p-PI3K、p-AKT和p-mTOR的表达（P<0.001）,即抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活,而不影响PI3K、AKT和mTOR的表达。使用LIPUS就如同使用PI3K的抑制剂（LY294002）一样,可以抑制MG-63细胞的增殖（P<0.001）,在使用PI3K的激动剂740Y-P后,可逆转LIPUS对MG-63细胞增殖的抑制（P<0.001）。这些结果表明LIPUS可以通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活来抑制骨肉瘤细胞的增殖。结论:低强度脉冲超声通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制骨肉瘤细胞的增殖,它可能是单独或联合放化疗治疗骨肉瘤的有效方法之一。     

低强度脉冲超声对大鼠急性肌腱损伤早期血管生成的影响及机制

背景:越来越多研究表明,低强度脉冲超声可以促进急性肌腱损伤的愈合,但其具体机制尚不清楚。目的:观察低强度脉冲超声对急性肌腱损伤后早期血管生成的影响,并检测与血管内皮生长因子相关信号通路的调控关系,进而揭示其潜在作用机制。方法:8-12周龄SPF级雄性SD大鼠局部注射Ⅰ型胶原酶3 d建立急性跟腱损伤动物模型,随机分为超声组和对照组。超声组每日使用有效辐射面积为1 cm^(2)的超声小探头垂直于跟腱部位进行低强度脉冲超声治疗,对照组不干预。治疗2周后进行超声影像学检查,观察肌腱早期愈合情况;治疗1,2周后行苏木精-伊红染色和CD31免疫组织化学染色观察组织血管数量变化,Western blot和qRT-PCR检测跟腱组织中血管内皮生长因子相关信号通路分子的表达。结果与结论:①灰阶超声显示:超声组较对照组跟腱更为连续,回声强度更低且较为均匀,肌腱厚度明显降低(P<0.05);②苏木精-伊红染色和CD31免疫组织化学结果一致显示:治疗2周后,超声组的新生血管数量明显较同期对照组增多(P<0.05);③Western blot和qRT-PCR结果显示:治疗2周后超声组跟腱中血管内皮生长因子、Yes相关蛋白、血管生成素2、富含半胱氨酸的血管生成素诱导物61的蛋白和mRNA表达均显著高于对照组(P<0.05);④结果表明:低强度脉冲超声通过上调血管内皮生长因子表达显著增加了急性肌腱损伤早期血管生成数量,加速了肌腱愈合。     

β-磷酸三钙/聚乳酸叠层生物材料的理化性能

本文研究了β—磷酸三钙／聚乳酸叠层复合支架在体外37℃生理盐水中的降解过程，内容包括材料的重量、力学强度、聚乳酸分子量、材料周围环境的pH值、Ca^2 浓度等参数随时间的变化，并证实材料理化特性适合于骨组织工程支架材料的要求。支架材料的生物相容性评价实验结果表明骨髓基质细胞与支架间有良好的亲和性。     

锶磷灰石多孔陶瓷复合成骨细胞的体内异位成骨研究

目的比较不同孔隙率的锶磷灰石（含5%锶的羟磷灰石,Sr-HA）陶瓷复合成骨细胞后体内异位成骨能力。方法实验试样分复合成骨细胞的不同孔隙率组和未复合成骨细胞的不同孔隙率组。先抽取健康兔的骨髓组织,体外培养,诱导分化为成骨细胞,分别与孔径约为450～700μm、孔隙率分别为50%、60%、70%的Sr-HA及孔隙率为70%的纯羟磷灰石陶瓷体复合,自体回植到兔左侧背脊肌内;未复合成骨细胞的不同孔隙率组试样则种植在兔右侧背脊肌内作为阴性对照。植入后4、12、24周取材,行大体观察、组织学检查。结果复合成骨细胞的各组陶瓷在植入兔背脊肌内4周后均有类骨质形成,随着植入时间的延长,骨组织的数量不断增加;孔隙率为70%的Sr-HA陶瓷和HA陶瓷的成骨性能明显优于50%、60%孔隙率的Sr-HA陶瓷。未复合细胞的陶瓷材料在组织学检查中未见有类骨质形成。结论Sr-HA多孔陶瓷是较理想的骨组织工程支架材料,成骨细胞复合Sr-HA陶瓷用于骨缺损的修复,具有广阔的临床应用前景。     

复合骨碎补总黄酮的丝素蛋白/壳聚糖支架在兔关节软骨损伤中的应用研究

目的 以丝素蛋白/壳聚糖支架为载体将骨碎补总黄酮应用于兔软骨损伤局部,观察修复效果,为临床提供实验数据。方法 制备丝素蛋白/壳聚糖支架、骨碎补总黄酮缓释微球与负载骨碎补总黄酮缓释微球的丝素蛋白/壳聚糖支架,扫描电子显微镜下观察支架形貌,同时检测该支架的体外缓释能力。24只新西兰大白兔随机分3组,利用电钻在股骨滑车部位构建直径3.5 mm、深1.5 mm的软骨损伤模型,空白组软骨缺损处不植入任何材料,对照组植入单纯的丝素蛋白/壳聚糖支架,实验组植入负载骨碎补总黄酮缓释微球的丝素蛋白/壳聚糖支架,术后12周、24周行标本大体与组织学观察,RT-PCR检测修复组织Sox-9、II型胶原与聚集蛋白聚糖mRNA的表达量,Western blot检测软骨缺损部位II型胶原蛋白表达,分析软骨修复效果。结果 丝素蛋白/壳聚糖支架具有良好的三维孔隙结构,孔洞之间相互联通;制备的载药微球表面较光滑,为较规则的圆球形;载药微球均匀分散于丝素蛋白/壳聚糖支架基质中。丝素蛋白/壳聚糖支架可在体外持续稳定地释放骨碎补总黄酮,实验组软骨损伤修复效果优于对照组,对应的ICRS评分与Wakitani组织学评分高于对照组...     

Regions recognized on the light chain of botulinum neurotoxin type A by T lymphocytes of SJL and BALB/c mice primed with inactivated toxin

Lymph node cells (LNC) from SJL (H-2^s) and BALB/c (H-2^d) mice primed once with inactivated botulinum neurotoxin type A (BoNT/A) were examined for their T-cell responses to each of 32 synthetic overlapping peptides (19 residues each, L1–L32) that encompass the entire L chain (residues 1–448) of BoNT/A. LNC of SJL gave strong responses to 6 regions on, L2 (residues 15–23), L10/11/12 (127–173), L19 (253–271) and L21 (281–299), and moderate to weak responses to L9 (113–131), L14/15 (183–215) and L27 (365–383). In BALB/c, LNC gave a substantial T-cell response only against peptide L12 (residues 155–173), and responded very weakly to 9 other peptides. The results were compared with the recognition profiles determined previously in these two strains after multiple BoNT/A injections. Overall responses to the L-chain peptides of T cells in later profiles were found to be somewhat weakened in SJL and stayed essentially at a similar level in BALB/c, although responses to BoNT/A increased. In SJL, response to L10 (127–145) remained the highest in the later profile. Strong responses against L12 (155–173) observed in both strains at early stage were reduced to an insignificant level. Cross-reactivity to tetanus neurotoxin by BoNT/A-specific T cells was observed in SJL but not in BALB/c. Design of an effective synthetic peptide vaccine will require incorporation of both T cell- and Ab-recognition elements of the BoNT molecule. Significance and possible implications of these results on BoNT/A-specific T-cell responses of BoNT-treated patients are discussed.