抗HBsAg Fab片段和α-干扰素融合蛋白的克隆及表达

目的 为深入研究乙型肝炎的生物导向治疗，构建以人抗乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）抗本Ｆａｂ片段国导向作用，αＡ－干扰素（ＩＦＮ－αＡ）为治疗作用的融合蛋白Ｆａｂ／ＩＦＮ－αＡ原核表达载体ｐＨＳ／ＩＦＮ－αＡ。方法 用ＰＣＲ体外扩增目的基因ＩＦＮ－αＡ，并在其ＤＮＡ两端引入酶切点及５′端人工合成的Ｌｉｎｋｅｒ，重组人抗ＨＢｓＡｇ缺本Ｆａｂ片段功体ｐＨＳ相应酶切位点，酶切位点，酶切和ＤＮＡ测序鉴定筛选     

融合蛋白胸腺素α-干扰素与干扰素α对2.2.15细胞抗原表达的影响

临床上许多学者把α干扰素（IFN-α）和胸腺素α（TA1）联合起来治疗慢性乙型肝炎,结果发现联用效果明显优于单用IFN-α或TA1[1].     

干扰素α-8与乙型肝炎病毒-S2S融合基因真核表达质粒在哺乳动物细胞中的表达

目的：构建干扰素α-8(IFNα-8)与乙型肝炎(HB)病毒(HBV)-S2S融合蛋白的真核表达质粒pVAXl／IFNα-8-S2S，作为一种高效能HBDNA疫苗的备选对象。方法：以特定引物分别从正常胎肝组织及HB患者血清中扩增出IFNα-8与HBV—S2S基因片段，克隆至相应载体。再以连接引物扩增出IFNα-8与HBV-S2S融合基因片段，并将该基因片段克隆至真核细胞表达载体pVAXl，然后扩增目的基因测序，确认无误后，转染SP2／0细胞，并分别检测目的基因mRNA，了解其短暂表达与稳定表达情况。结果：所构建的质粒经过酶切电泳后证实分子量与预期相符，目的片断IFNα-8-S1S经测序证实IFNα-8序列与Genebank公布的序列相符。HBV-S2S存在3处三联密码子的无义突变。2处有义突变是703～705位CCG突变为CAG，799～801位ATA突变为ATG。表达质粒转染SP2／0细胞后，均检测到短暂表达及稳定表达之目的基因mRNA。结论；经分析表明，HBV-S2S片段存在的两处有义突变并不影响该蛋白的空间构象及关键抗原决定簇的性质。可以认为本研究完成了真核表达质粒pVAXl／IFNα-8-S2S的构建，并成功检测到目的基因的表达，为制造高效能HBDNA疫苗提供了新的备选对象。     

人源抗-HBs轻链与干扰素-α融合蛋白的克隆及表达

目的构建人源单克隆抗-HBs Fab片段-IFNα表达载体，对原核表达该融合蛋白的可行性及其效果进行实验研究。方法用聚合酶链反应（PCR）体外扩增目的基因IFN—α，单酶点插入已含人源抗HBs Fab基因的载体，插入点位于轻链基因3’末端，利用酶切、PCR鉴定，测序筛选正确插入的阳性克隆，转化大肠埃希菌Top10．挑选单克隆表达、纯化目的蛋白，用酶联免疫吸附法（ELISA）检测融合蛋白的抗原性，用Dotblot和WISH细胞检测其生物学活性。结果利用插入了人源抗-HBs Fab段基因及IFN-α基因的pBAD／gⅢA原核表达系统，成功表达了具生物活性的轻链与IFN-α的融合蛋白，其与HBsAg的亲合力与抗-HBs—Fab相近，而且具有干扰素的活性。融合蛋白对HepG2．2．15细胞初步实验结果亦显示出其具有良好的靶向性及致凋亡作用。结论轻链与干扰素IFN—α融合蛋白的成功表达表明，应用原核系统能够同时表达特异抗体和其介导的某些生物活性因子，不失为一种经济、有效的方法，为特异抗体及其介导融合蛋白的制备和临床应用提供了实验依据。     

人干扰素-α基因转移、表达及其抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的研究人干扰素-α(hIFN-α)基因的转移、表达及其抗乙型肝炎病毒的作用.方法利用聚合酶链反应(PCR)技术和基因重组技术,体外扩增hIFN-α基因并构建重组表达hIFN-α基因的逆转录病毒表达载体(pDOR-IFN-α),用NIH 3T3细胞扩增法测定其假病毒颗粒滴度,用染料吸收法检测hIFN-α活性;将假病毒颗粒感染2.2.15细胞,用固相放免法检测其上清HBsAg和HBeAg,用斑点杂交法结合计算机扫描检测其细胞HBV DNA密度.结果PCR克隆出648 bphIFN-α全基因;假病毒颗粒滴度为1×106CFU/ml;hIFN-α生物活性为239 IU/ml/1×106/48 h;对HBsAg的抑制率随培养时间(2、4、6和8 d)的延长而逐渐增高,抑制率分别为33%、55%、55%和62%,而对HBeAg的抑制则在转染后的第2天抑制率最高,以后随培养时间延长而逐渐下降,其抑制率分别为67.7%、40%、19.5%和25.3%.而对照组对HBsAg第2、4、6、8天的抑制率分别为0%、10.8%、0%和13%,对HBeAg的抑制率分别为0%、0%、0%和1.2%.而且对HBV DNA亦有明显的抑制作用,抑制率达66%;而对照组(空白载体)抑制作用不明显.结论hIFN-α基因可以成功地转移和表达,并有抑制HBV复制和表达的作用.     

人分泌型Klotho蛋白在CHO细胞中的稳定表达

目的 在CHO细胞中稳定表达人分泌型Klotho（hsKL）蛋白，制备具有天然结构的重组hsKL（rhsKL）蛋白。方法 用PCR法自克隆载体pBS—hsk1中克隆hsKL DNA，构建真核表达载体pcDNA3．1／Zeo（＋）-hskl。经核酸测序确证后，阳离子聚合物转染CHO细胞。用PCR法筛选具有Zeocin抗性的阳性细胞克隆，SDS—PAGE（银染色）法确定CHO细胞分泌蛋白的分子量，Western印记法鉴定CHO细胞的培养上清液中的rhsKL蛋白，确定稳定转染细胞株CHO—hsKL。结果 经PCR法克隆的序列与Gene Bank登录的bskl mRNA序列一致。将hsKL DNA定向插入pcDNA3．1／Zeo（＋），构建pcDNA3．1／Zeo（＋）．hsk1真核表达载体并通过阳离子聚合物转染CHO细胞获得Zeocin抗性的转染阳性克隆。SDS—PAGE和Western blot分析显示，转染的CHO培养上清中含有分子量约为66kDa的rhsKL蛋白。结论 首次实现天然结构的hsKL蛋白的重组表达——获得稳定表达细胞株CHO—hsKL。     

干扰素在慢性HBV感染肝病中的应用

应用干扰素后可使部分病人的血清HBV标志转阴,肝功能及肝组织学改善。如与糖皮质激素及抗病毒药物如阿糖腺苷,无环鸟苷并用,可提高疗效。试管内及动物模型已证实,干扰素具有抗肝纤维化作用。干扰素最常见的副作用为发热和流感样症状,一般在一至两周内改善。在目前尚无确切有效治疗HBV慢性感染的情况下,干扰素是一种有希望的药物。     

融合蛋白胸腺素α1-干扰素α抗乙型肝炎病毒活性的实验研究

目的观察融合蛋白胸腺素α1-干扰素α(TA1-IFN)体外抗乙型肝炎病毒(HBV)作用,并与胸腺素α1、干扰素α两者联合(TA1+IFN)应用的体外抗HBV作用进行比较。方法HepG22.2.15细胞接种后24h,换用含5种不同浓度(8000、4000、2000、1000、500U／ml)药物的培养基,37℃、体积分数5％CO2条件下培养,每3d换用原浓度含药培养液1次,并于第6天收集培养液,用Abbott诊断试剂盒,分别检测不同组药物作用后上清液中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)的含量,并计算其抑制率;同时用四甲基偶氮唑盐比色分析法检测不同组药物对HepG22.2.15细胞的细胞毒性作用。结果TA1-IFN体外对HBsAg、HBeAg的抑制率与药物浓度呈剂量依赖关系,并且在药物浓度达8000U／ml后趋于稳定,此时TA1-IFN对HBsAg、HBeAg抑制率分别为72.2％±0.8％、60.4％±1.1％,细胞存活率为85.2％±2.0％;而相应浓度的TA1-IFN对HBsAg、HBeAg抑制率为40.0％±0.7％、34.5％±3.2％,细胞存活率为70.0％±1.9％,两者HBsAg、HBeAg抑制率及细胞存活率比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)。结论融合蛋白TA1-IFN体外具有良好的抗HBV作用,其体外抗HBV活性比TA1-IFN联合应用强,且细胞毒性比TA1+IFN联合应用时小,本实验为融合蛋白TA1-IFN的临床研究提供了重要的理论     

JC病毒t抗原的融合蛋白表达及抗体制备

目的 构建JC病毒t抗原的原核融合蛋白表达载体,表达并纯化该融合蛋白.方法 采用PCR方法 从患者脑脊液中扩增JC病毒t抗原,测序正确后再克隆入pET32a(+)质粒,构建pET32a(+)-t表达重组体,并诱导表达t抗原融合蛋白.大量制备该融合蛋白并以镍柱亲和层析纯化.然后以纯化蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体.结果pET32a(+)-t表达出相对分子质量为41 000左右的重组蛋白.十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析显示,异丙基-βD-硫代半乳糖苷诱导后3.5～20.0 h融合蛋白均高水平表达.Western印迹证实具有良好的抗原性,免疫BALB/c小鼠后,成功制备了鼠多克隆抗体.结论 成功构建原核表达载体pET32a(+)-t,表达纯化t抗原融合蛋白,成功制备了JC病毒小包膜蛋白t的抗体,为进一步流行病学调查及该基因的功能研究奠定了基础.     

人护骨素-谷胱甘肽转硫酶融合蛋白基因的构建与表达

目的 克隆人护骨素(OPG)成熟肽段编码区基因并研究在大肠杆菌中OPG-谷胱甘肽转硫酶(GST)的融合蛋白的表达。方法 采用RT-PCR从人骨肉瘤细胞系MG63的总RNA中扩增OPG成熟肽段编码区cDNA，构建原核表达载体pGEX-4T-1，转化大肠杆菌后经0．1mmoL／L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后收集菌体蛋白，以SDS—PAGE电泳及Western印迹鉴定蛋白表达，应用谷胱甘肽-Sepharose4B柱亲和层析纯化目的蛋白。结果 获得人OPG成熟肽段编码区cDNA，转化菌株可表达人OPG-GST融合蛋白，蛋白表达量约为菌体总蛋白的15．5％。Western印迹表明在相对分子质量66000处融合蛋白能与人OPG多克隆抗体特异性结合。经亲和层析后获得纯度为95．7％的OPG—GST融合蛋白。结论 获得人OPG成熟肽段全长cDNA，在大肠杆菌中表达OPG—GST融合蛋白并以亲和层析法进行纯化。     

胰腺癌胆囊收缩素受体蛋白表达的研究

目的探讨胆囊收缩素受体在正常胰腺组织、胰腺癌组织、胰腺癌细胞株SW1990中的表达，以明确胆囊收缩素受体与胰腺癌的关系。方法应用免疫组织化学法和免疫细胞化学法分别检测正常胰腺组织、胰腺癌组织、胰腺癌细胞株SW1990中胆囊收缩素受体A、B亚型的表达。结果在正常胰腺组织中缺乏胆囊收缩素受体A、B亚型的表达；在胰腺癌组织、人胰腺癌细胞株SW1990中也不表达胆囊收缩素受体A亚型，但可见胆囊收缩素受体B亚型的表达；胆囊收缩素受体在癌细胞株SW1990中的表达主要位于细胞膜上，细胞质内也可见。结论胆囊收缩素受体B在胰腺癌组织、腺癌细胞株SW1990中表达；胆囊收缩素受体B亚型主要位于细胞膜上；胆囊收缩素受体B亚型在胰腺癌细胞生长中可能发挥重要作用。     

高迁移率族蛋白1蛋白在胰腺癌组织中的表达及其临床意义

目的　研究胰腺癌 (PC)组织中高迁移率族蛋白 1(High mobility group box1,HMGB1)蛋白表达 ,并探讨其与癌分化程度、肿瘤大小、浸润、淋巴及血道转移的关系。方法　用免疫组织化学SABC方法 ,检测 73例胰腺癌组织、10例癌旁组织、6例正常胰腺组织 HMGB1蛋白表达。结果　HMGB1在胰腺癌中呈强阳性表达 (76 .7% ) ,在癌旁组织中仅有微弱表达 ,正常胰腺组织无表达 ;HMGB1的阳性率与癌分化程度无关 (P>0 .0 5 ) ;与肿瘤的大小、浸润、淋巴及血道转移呈正相关 (P<0 .0 1)。结论　 HMGB1在胰腺癌中呈强阳性表达 ,可作为胰腺癌生长、转移及预后的重要判定指标。     

人结直肠癌干细胞标志物富含亮氨酸重复单位的G蛋白耦联受体5基因的表达及意义

目的 探讨人结直肠癌组织及外周血中干细胞标志物富含亮氨酸重复单位的G蛋白耦联受体5(lgr5)基因的表达及其与临床病理特征间的关系.方法 采用SYBR Green实时定量PCR方法检测27份结直肠癌组织及配对的正常组织中、1 7例患者及8名健康对照者外周血中lgr5mRNA的表达.应用Wilcoxon秩和检验分析lgr5 mRNA在不同组织间、临床病理参数之间的表达差异.结果 结直肠癌组织中lgr5 mRNA表达水平为1.000(0.012,496.353),高于配对正常组织的0.147(0.004,73.002),差异有统计学意义(Z=8.029,P＜0.01).结直肠癌患者外周血中lgr5mRNA表达水平为0.742(0.077,456.566),高于健康对照组的0.104(0.034,0.274),差异有统计学意义(Z=2.048,P＜0.05).结直肠癌组织lgr5 mRNA在不同性别、年龄、肿瘤原发部位、肿瘤大小、组织学类型组间表达差异均无统计学意义(P均＞0.05),但有淋巴结转移组lgr5 mRNA表达高于无淋巴结转移组,差异有统计学意义(Z=2.066,P＜0.05).结论 lgr5在结直肠癌组织及外周血中的表达上调可能参与了结直肠癌的生长及转移.     

人TAT-PDX-1融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

目的构建人TAT-PDX-1表达载体,并对其融合蛋白进行纯化。方法采用RT-PCR技术从人胰腺组织中获得目的基因hPDX-1,将TAT序列与PDX-1克隆到原核表达载体pET-28a;用IPTG诱导、表达融合蛋白;NiNTAagaros纯化融合蛋白,Western blot鉴定。结果目的片段PDX-1被有效扩增,DNA序列测定表明所构建重组质粒pET28a-TAT-h PDX-1与设计相同;TAT-PDX-1融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达并成功纯化。结论成功地获得了TAT-hPDX-1融合基因的表达产物,为进一步研究及临床应用奠定了基础。     

弓形虫GRA6可溶性蛋白在大肠埃希菌中的表达及纯化

目的在大肠埃希菌中高效表达及纯化弓形虫GRA6抗原,为制作弓形虫感染基因工程诊断试剂盒奠定基础.方法将重组pGEX-GRA6表达载体转化大肠埃希菌BL21-Codon Plus（DE3）-RP菌株,在异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导下表达.超声破壁后,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表达产物的表达形式,并对表达产物以硫酸铵沉淀、Sephedax G50脱盐和GST亲和层析柱进行目的蛋白的纯化.通过Western blotting检测其纯化的重组抗原的免疫反应性.结果GRA6以融合蛋白（GST-GRA6）的形式在大肠埃希菌中得到了高效表达.对表达产物可溶性分析表明,表达蛋白在上清液中和包涵体中均有表达.在上清液中表达的可溶性蛋白经纯化后蛋白纯度可达90%以上.Western blotting分析表明纯化蛋白能被弓形虫感染的人血清所识别.结论GRA6在大肠埃希菌中得到了高效表达,重组抗原经纯化后能特异性地被弓形虫感染者血清所识别.     

HSP70-GST融合蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建小鼠热休克蛋白70(HSP70)重组原核表达质粒,获取小鼠HSP70-GST融合蛋白。方法先用RT-PCR方法从小鼠脑基因组中扩增出HSP70基因cDNA序列,应用T-A克隆技术,克隆到质粒pMD—Tvector,经DNA测序证实基因碱基无误后,亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1 中进行表达。结果表达产物经Western Blot分析,在109 KD处有一明显特异带,与预期结果相符。结论构建重组融合表达载体pGEX—HSP70,用基因工程的方法在原核细胞中成功表达出小鼠 HSP70-GST融合蛋白。     

人热休克蛋白70在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的在毕赤酵母(pichiapastoris)中高效表达人热休克蛋白70(hHSP70),制备具有天然与hHSP70相同结构和活性的重组hHSP70(rhHSP70)。方法用PCR法自人DNA文库中克隆hHSP70的DNA,构建真核表达载体pPICZα/hHSP70。经核酸测序确证后,电转化毕赤酵母菌株X33。用PCR法筛选Zeocin抗性的转染阳性克隆,Westernblot法鉴定甲醇诱导的培养上清液中的rhHSP70,筛选高表达工程菌。结果经PCR法克隆的hHSP70DNA序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。将hHSP70DNA定向插入pPICZα,构建pPICZα/hHSP70真核表达载体并经电转化获得Zeocin抗性的转染阳性克隆。SDSPAGE和Westernblot分析显示了甲醇诱导的培养基上清中含有rhHSP70,分子量72kD。氨基酸序列分析证实rhHSP70氨基端15个氨基酸与天然rhHSP70完全一致。rhHSP70表达量高达250mg·L-1。结论获得高效表达rhHSP70的毕赤酵母工程菌。