nm23-H1基因转染对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中β-catenin表达的影响

目的探讨nm23-H1基因转染对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中β-catenin和磷酸化β-catenin表达水平的影响,为阐明nm23-H1基因逆转肺癌转移的分子机制提供实验依据.方法以原代L9981、转染nm23-H1基因的L9981-nm23-H1和转染空载体的L9981-pLXSN三株肺癌细胞株为研究对象,应用Western Blot检测比较各细胞株胞浆、胞核中β-catenin和磷酸化β-catenin表达水平的变化,以确定nm23-H1基因转染是否能调控人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中β-catenin和磷酸化β-catenin表达.结果①β-catenin在L9981-nm23-H1细胞株胞浆中表达量(IOD)(3 649±118)显著高于L9981(1 401±31)和L9981-pLXSN(1 350±55)细胞株(P＜0.001);②β-catenin在L9981-nm23-H1细胞株胞核中表达量(2 945±68)与L9981(2 604±23)和L9981-pLXSN(2 652±53)细胞株比较均无显著性差异(P＞0.05);③磷酸化β-catenin在L9981-nm23-H1细胞株胞浆中表达量(3 123±102)显著低于L9981(4 362±131)和L9981-pLXSN(4 500±117)细胞株(P＜0.001);④磷酸化β-catenin在L9981-nm23-H1细胞株胞核中表达量(5 136±112)显著高于L9981(2 666±116)和L9981-pLXSN(2 661±66)细胞株(P＜0.001);⑤在L9981和L9981-pLXSN细胞株间β-catenin和磷酸化β-catenin在胞浆和胞核中的表达均无显著性差异(P＞0.05).结论①nm23-H1基因能够显著上调人高转移大细胞肺癌细胞株L9981胞浆中的β-catenin表达,但并未引起胞核中β-catenin聚积;②nm23-H1基因能够显著上调L9981细胞株胞核中磷酸化β-catenin表达水平,下调胞浆中磷酸化β-catenin的表达水平;③调控Wnt信号通路关键分子β-catenin表达可能是nm23-H1基因逆转人高转移大细胞肺癌细胞株侵袭转移和调控"肺癌转移抑制级联"的重要分子机理之一.     

靶向抑制ERK1/2信号传导通路对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981恶性表型的影响

背景与目的肺癌的发生和发展是一个多基因调控、多阶段多步骤发生的复杂过程，目前已知信号传导异常在肺癌发乍和发展行个阶段都具有重要作用。本研究旨在探讨外源性MEK1／2抑制剂U0126对人高转移大细胞帅癌细胞株L9981中细胞外信号调节激酶ERK1/2表达和活化的影响及细胞恶性生物学行为的影响。方法将其有nm23-H1基因杂合性缺失的人高转移大细胞肺癌原代细胞株L9981培养传代，应用蛋白印迹法（Wcstern blot）和免疫沉淀法，检测U0126对L9981中总ERK1／2和双磷酸化ERK1／2的表达水平，以及ERK1／2相对活性的影响；应用MTT法及改良Boyden小室法分别检测U0126对L9981体外增殖活代及侵袭能力的作用观律。结果不同浓度的U0126作用于L9981 20min后，随着U0126浓度的增加ERK1／2的相对活性均逐渐下降．不同U0126浓度组问磷酸化ERK1/2表达水平比较均有非常显著性差异（P〈0．01）；而不同浓度U0126组间总ERK1/2表达水平比较无显著性差异（P=0．387）。相同浓度的U0126作用于1．9981不同时间后．随着作用时间的延长．细胞中ERK1/2的相对活性均逐渐下降，各时间组间磷酸化ERK1/2表达水平比较有显著性差异（P〈0．01）；而各时间组间总ERK1／2表达水平比较无显著性差异（P=0．689）。U0126对L9981细胞株ERK1／2相对活性的作用具有时 间和剂量依赖性。不同浓度的U0126作用于L9981后，随着U0126浓度的增加，细胞体外增殖活性随之降低．不同浓度组间比较均有显著性羞异（P〈0．01）。不同浓度的U0126作用于L9981后．随着U0126浓度的增加，细胞体外侵袭能力随之降低。在U0126浓度为0、10和20μmol／1时三个剂量组间细胞体外侵袭能力比较无显著性差异（P〉0．05）．而在U0126浓度增加为40和60μmol/l时与U0126浓度为0、10和20μmol/l时细胞体外侵袭能力比较均有显著性差异（P〈0．01）。结论ERK1／2信号传导通路特异性抑制剂U0126对人高转移大细胞肺癌细胞株ERK1／2信号传导通路的抑制作用具有剂量和时间依赖性；U0126对人高转移大细胞肺癌细胞株体外增殖活性和侵袭能力的抑制作用具有剂量依赖性；提示人高转移大细胞肺癌细胞株中ERK1／2信号传导通路关键激酶MEK1／2可能是治疗肺癌的一个潜在分子靶点。     

mm23-H1基因点突变对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981的GSK-3β激酶活性的影响

背景与目的 我们的前期研究结果表明nm23-H．基因的肺癌转移抑制作用可能与上调Wnt信号通路中关键激酶GSK-3β的活性、进而抑制Wnt信号通路相关。本研究的目的是探讨nm23-H1点突变对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中胞质和胞核的GSK-3β激酶活性的影响，为阐明nm23-H1基因调控肺癌转移相关信号传导通路的分子机制提供实验依据。方法 将原代人低转移大细胞肺癌细胞株NL9980、原代人高转移大细胞肺癌细胞株L9981、空载体转染细胞株L9981-pEGFP、稳定转染nm23-H1基因的细胞株L9981-nm23-H1-pEGFP以及稳定转染在44、96、118、120号位点发生突变后的nm23-H1基因的转基因肺癌细胞株L9981-nm23-H1^S44A-pEGFP、L9981-nm23-H1^P965-pEGFP、L9981-nm23-H1H118F-pEGFP和L9981nm23-H1^S120G-pEGFP作为研究对象，应用免疫共沉淀同位素闪烁计数法测定上述肺癌细胞株胞质和胞核中的GSK-3B激酶活性。结果 nm23-H1基因发生点突变后，所有转基因肺癌细胞株细胞胞质和胞核中的GSK-3β活性均较突变前有所下降。L9981-nm23-H1^S44A-pEGFP、L9981-nm23-H1^P96S-pEGFP、L9981-nm23-H1^H18F-pEGFP、L9981-nm23-H1S120G-pEGFP分别与L9981-nm23-H1-pEGFP比较，胞质与胞核中GSK-3β激酶活性均存在显著性差异（P〈0．05），其中L9981-nm23-H1^P96S-pEGFP与L9981-nm23-H1-pEGFP胞质中GSK-3β活性存在极显著差异（P〈0．01），L9981-nm23-H1^S44A-pEGFP,L9981-nm23-H1^P96S-pEGFP和L9981-nm23-H1H118F-pEGFP与L9981-nm23-H1-pEGFP的胞核中GSK-3B活性存在极显著差异（P％0．01）。结论 ①nm23-H1基因突变能显著影响其对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981胞质和胞核中GSK-3B激酶活性的调控作用；②nm23-H1基因可能通过调控L9981中GSK-3B激酶活性来抑制L9981细胞株中Wnt信号传导。     

nm23-H1基因点突变对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981的GSK-3β激酶活性的影响

背景与目的我们的前期研究结果表明nm23-H1基因的肺癌转移抑制作用可能与上调Wnt信号通路中关键激酶GSK-3β的活性、进而抑制Wnt信号通路相关.本研究的目的是探讨nm23-H1点突变对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中胞质和胞核的GSK-3β激酶活性的影响,为阐明nm23-H1基因调控肺癌转移相关信号传导通路的分子机制提供实验依据.方法将原代人低转移大细胞肺癌细胞株NL9980、原代人高转移大细胞肺癌细胞株L9981、空载体转染细胞株L9981-pEGFP、稳定转染nm23-H1基因的细胞株L9981-nm23-H1-pEGFP以及稳定转染在44、96、118、120号位点发生突变后的nm23-H1基因的转基因肺癌细胞株L9981-nm23-H1 S44A-pEGFP、L9981-nm23-H1P96S-pEGFP、L9981-nm23-H1H118F-pEGFP和L9981-nm23-H1S120G-pEGFP作为研究对象,应用免疫共沉淀同位素闪烁计数法测定上述肺癌细胞株胞质和胞核中的GSK-3β激酶活性.结果nm23-H1基因发生点突变后,所有转基因肺癌细胞株细胞胞质和胞核中的GSK-3β活性均较突变前有所下降.L9981-nm23-H1S44A-pEGFP、L9981-nm23-H1P96S-pEGFP、L9981-nm23-H1 H118F-pEGFP、L9981-nm23-H1 S120G-pEGFP分别与L9981-nm23-H1-pEGFP比较,胞质与胞核中GSK-3β激酶活性均存在显著性差异(P＜0.05),其中L9981-nm23-H1P96S-pEGFP与L9981-nm23-H1-pEGFP胞质中GSK-3β活性存在极显著差异(P＜0.01),L9981-nm23-H1S44A-pEGFP、L9981-nm23-H1P96S-pEGFP和L9981-nm23-H1 H118F-pEGFP与L9981-nm23-H1-pEGFP的胞核中GSK-3β活性存在极显著差异(P＜0.01).结论①nm23-H1基因突变能显著影响其对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981胞质和胞核中GSK-3β激酶活性的调控作用;②nm23-H1基因可能通过调控L9981中GSK-3β激酶活性来抑制L9981细胞株中Wnt信号传导.     

nm23-H1基因转染前后人高转移大细胞肺癌细胞株L9981 PKA活性变化的实验研究

目的探讨nm23-H1基因转染和forskolin对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981 PKA活性的影响.方法应用PKA通路特异激动剂forskolin对人高转移大细胞肺癌原代细胞株L9981、转基因细胞株L9981-nm23-H1-pLXSN和空载体转染细胞株L9981-pLXSN共同培养,应用放免法检测forskolin处理后不同时间点三个细胞株PKA的活性变化.结果 (1)forskolin处理前L9981、L9981-pLXSN和L9981-nm23-H1-pLXSN的PKA活性经F检验有显著性差异(P<0.01);两两比较L9981-nm23-H1-pLXSN的PKA活性显著高于L9981和L9981-pLXSN(P<0.01),而L9981与L9981-pLXSN之间比较无显著性差异(P>0.05).(2)在同一作用时间(30 min)下,三个细胞株经不同浓度forskolin处理后PKA活性均显著升高(P<0.01),在forskolin浓度为100 μmol/L时PKA活性最高,呈剂量依赖关系.(3)三个细胞株在同一浓度forskolin(100 μmol/L)处理下,PKA活性随作用时间升高,在forskolin作用时间为30 min时PKA的活性最高,呈时间依赖关系.结论 (1)nm23-H1基因转染能显著上调人高转移大细胞肺癌细胞株L9981的PKA活性,nm23-H1作为一种肿瘤转移抑制基因的作用机理与PKA信号通路可能有一定联系;(2)forskolin能显著上调L9981细胞株中的PKA活性,PKA活性升高呈时间和剂量依赖关系.     

槐耳清膏对人高转移大细胞肺癌细胞L9981血管生成相关基因表达的影响

背景与目的肺癌是全世界对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤之一。目前从植物中开发抗肿瘤药物是国内外抗肿瘤新药开发的一个热点。本研究的目的是观察槐耳清膏对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981血管生成相关基因mRNA转录表达的影响及意义，并探讨其可能的分子机制。方法体外培养人高转移大细胞肺癌细胞L9981，应用台盼蓝拒染法做细胞毒性实验，实验分为：空白对照组，槐耳清膏组，顺铂化疗组，联合用药组。应用RT-PCR检测四组细胞株用药前后β-catenin、E-cadherin、TIMP-1、CD44V6、MMP-2、endostatin、VEGF mRNA的表达。应用Boyden小室法检测四组细胞株用药前后体外侵袭力改变。结果①槐耳清膏对L9981细胞的生长有明显的抑制作用，且抑制率随药物浓度增加而上升。槐耳清膏组（1g／L）与顺铂化疗组（顺铂3mg／L）及联合用药组（槐耳清膏0．05g／L＋顺铂1．5mg／L）比较抑制率无明显差异（P〉0．05）。②经槐耳清膏处理后，L9981细胞的β-catenin、E-eadherin、TIMP-1、andostatin、MMP-2的mRNA表达水平上调，而VEGF、CD44V6表达水平下调，其中TIMP-1、endostatin表达水平明显上调，CD44V6表达水平明显下调。③槐耳清膏组、顺铂化疗组、联合用药组细胞株的体外侵袭力均明显低于空白对照组（P〈0．05）。结论①槐耳清膏在体外对人高转移大细胞肺癌细胞L9981具有生长抑制作用，该抑制作用呈剂量依赖性。②槐耳清膏对L9981的生长抑制作用可能与其调控血管生成相关基因mRNA的表达有关。③槐耳清膏联合顺铂有一定的协同抗肿瘤作用。     

硒化合物诱导人高转移大细胞肺癌L9981产生活性氧变化的研究

背景与目的已有研究表明甲基硒酸具有防癌和抗癌作用。本研究拟探讨甲基硒酸及亚硒酸钠在人高转移大细胞肺癌L9981的代谢过程中是否产生活性氧及其变化,进一步明确氧化应激在不同硒化合物中发挥抗癌效应的地位。方法应用细胞活力计数仪,检测硒化合物对L9981的生长抑制影响;采用活性氧荧光探针羧基-H2DCFDA探测经硒化合物诱导的L9981细胞内活性氧的含量;采用N-乙酰半胱氨酸(NAC)与硒化合物同时处理L9981细胞后,流式细胞术检测细胞内活性氧的变化。结果①2.5μMMSA即可明显抑制L9981细胞生长,且随浓度增加,效应增强。②甲基硒酸及亚硒酸钠均可诱导L9981产生显著的ROS变化,亚硒酸钠产生时间早于MSA;③采用NAC同时处理L9981后,甲基硒酸能够显著的促进细胞产生活性氧,而亚硒酸钠能够显著的抑制细胞内活性氧的产生。结论①甲基硒酸及亚硒酸钠对L9981均具有抑制生长的作用,并且具有剂量依赖性;②氧化应激反应参与了MSA及亚硒酸钠诱导L9981细胞死亡的过程。     

应用生物发光技术研究甲基硒酸对L9981-Luc肺癌细胞株移植瘤模型生长转移的影响

背景与目的 甲基硒酸是一种新型的人工合成的硒化合物.研究发现甲基硒酸对肿瘤细胞的生长转移有抑制作用.本研究的目的是探讨甲基硒酸对L9981-Luc裸鼠异体移植瘤生长和转移能力的抑制作用及机制.方法 建立L9981-Luc肺癌细胞株移植瘤模型,用精诺真活体动物可见光成像系统观察肺癌移植瘤肿瘤生长转移情况.实验将6周龄裸鼠15只,随机分为3组,每组5只,对照组每日腹腔注射生理盐水0.2 mL;甲基硒酸组每日腹腔注射甲基硒酸溶液50μg (0.2mL);顺铂组每周腹腔注射顺铂4 mg/kg.结果 接种第21天,不同组间原发瘤发光值比较差异有统计学意义(P=0.002);顺铂组发光值明显低于对照组(P=0.001),甲基硒酸组发光值明显低于对照组(P=0.031).不同药物处理组胸部转移信号发光值差异无统计学意义(P＞0.05).结论甲基硒酸能明显抑制L9981-Luc裸鼠异体移植瘤生长,并有抑制L9981-Luc原发瘤肺转移的趋势.     

nm23-H1基因转染逆转人高转移大细胞肺癌恶性表型分子机制的实验研究

背景与目的nm23-H1是公认的肿瘤转移抑制基因。我们的前期研究结果发现nm23-H1基因可明显抑制人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中细胞外信号调节激酶ERK1／2的活性。本研究旨在探讨肿瘤转移抑制基因nm23-H1及外源性ERK1／2通路抑制剂U0126对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中ERK1／2及其细胞恶性生物学行为的影响，为阐明nm23-H1基因调控肺癌转移相关信号传导通路的分子机制提供实验依据。方法将稳定转染nm23-H1基因的人高转移大细胞肺癌细胞株L9981-nm23-H1、原代细胞株L9981（nm23-H1基因杂合性缺失）和转染空载体细胞株L9981-PLXSN培养传代，应用蛋白印迹法（Western blot）和免疫沉淀法，检测应用U0126（40μmol／L，处理细胞20min）处理后三个肺癌细胞株中总ERK1／2和双磷酸化ERK1／2表达水平的变化；应用MTT法及改良Boyden小室法分别检测三个肺癌细胞株应用U0126处理后细胞体外增殖活性及侵袭能力的变化。结果L9981-nm23-H1细胞株磷酸化ERK1／2表达水平、ERK1／2相对活性经U0126处理后均显著低于L9981和L9981-PLXSN细胞株（P〈0．01），而L9981和L9981-PLXSN细胞株间磷酸化ERK1／2表达水平、ERK1／2相对活性比较均无显著性差异（P〉0．05）；三个肺癌细胞株总ERK1／2水平处理后比较均无明显变化，差异均无显著性（P〉0．05）；L9981-nm23-H1细胞株体外增殖能力及侵袭力均显著低于L9981细胞株和L9981-PLXSN细胞株（P％0．01）；U0126能显著下调L9981细胞株体外增殖活性及侵袭能力（P〈0．01）。结论阻断L9981细胞株中ERK1／2的激活后可发生与转染nm23-H1基因相似的细胞生物学行为的变化，即细胞的体外增殖能力及侵袭力均显著降低，提示nm23-H1基因转染逆转人高转移大细胞肺癌恶性表型的分子机制可能与其下调ERK1／2信号转导通路中关键激酶ERK1／2的活性有关。     

人高、低转移大细胞肺癌细胞株双向凝胶电泳图像分析

背景与目的　肺癌转移是肺癌的恶性标志和特征,也是肺癌患者治疗失败和死亡的主要原因。 为了更好地了解和阐明肺癌转移的分子机制,发现早期诊断和逆转肺癌转移的分子标志物,本研究应用双向 凝胶电泳技术,比较人高转移大细胞肺癌细胞株(L9981)和人低转移大细胞肺癌细胞株(NL9980)间蛋白质组 表达的差异。方法　利用固相pH梯度双向凝胶电泳,分离L9981和NL9980细胞株的总蛋白,用图像分析 软件比较分析并识别细胞间的差异表达蛋白质。结果　应用比较蛋白质组学技术对L9981和NL9980细胞 株的蛋白质表达进行双向电泳分离,成功地获得了蛋白组分辨率高、重复性好的双向凝胶电泳图谱。在三次 重复实验结果中,在L9981和NL9980细胞株中检测到的蛋白质点数分别为902±169和941±173,蛋白质斑 点位置在IEF方向的平均偏差为(0.858±0.076)mm,在SDS PAGE方向的平均偏差为(1.514±0.127)mm, 蛋白质表达量的变异为12.06%～12.22%。经ImageMaster软件分析后发现有15个蛋白质点仅在L9981 肺癌细胞株中检测到有表达,27个蛋白质点仅在NL9980中检测到有表达。发现4个蛋白质点在两种肺癌 细胞株中均存在,但在两种细胞株间的表达量差异在2倍以上,其中3个蛋白质点在L9981中表达量显著高     

Methylseleninic Acid on The Apoptosis Induction and Invasion Inhibition in Human High-Meta-static Large Cell Lung Cancer Cell Line L9981

Background and Objective Lung cancer, which has been proved to have fastest increasing rate of morbidity and mortality, appears to be one of the most dangerous malignant tumor that is     

Effects of Methylseleninic Acid on the Proliferation and Cell Cycle in Human High Metastatic Large Cell Lung Cancer Cell Line L9981 and Its Molecular Mechanism

Background and Objective Lung cancer is the rst killer of human being in the whole world. Recently, although many treatment strategies have been developed, the anti-cancer effects have     

Noninvasive Assessment of Using Bioluminescent Imaging(BLI) to Research Methylseleninic Acid' Effect on the Growth And Spontaneous Metastasis in Human High-Metastatic Large Cell Lung Cancer Cell Line L9981

Background and Objective The disease incidence and mortality of lung cancer has been increased dramatically for recent 50 years in many countries in the world. In2002, the new cases of     

齐墩果酸抗人肺癌细胞增殖、侵袭和诱导细胞凋亡的研究

 目的　研究齐墩果酸抗人肺癌细胞增殖、侵袭和诱导细胞凋亡的作用 ,并探讨其抗侵袭作用的机理。方法　用细胞增殖抑制试验、软琼脂集落形成试验、对重建基底膜的侵袭试验、趋化运动试验、对层粘连蛋白的粘附试验以及组织蛋白酶B活性测定观察齐墩果酸对PGCL3细胞侵袭能力的影响 ,用吖啶橙 -溴乙啶荧光双染法和TUNEL法检测细胞凋亡。结果　齐墩果酸可降低PGCL3细胞增殖能力并呈剂量依赖性 ,IC50 为 4 0 .71 μmol/L ;35 μmol/L和 4 5 μmol/L齐墩果酸均能抑制PGCL3细胞的侵袭能力 (P <0 .0 1 )且有剂量依赖性。抗侵袭作用机理的分析结果显示上述浓度的该药物对细胞的运动、粘附及组织蛋白酶B分泌均有明显的抑制作用 (P <0 .0 5和P <0 .0 1 ) ;软琼脂集落形成率也显著降低 ;上述浓度的药物处理 4 8h均使PGCL3细胞凋亡率显著升高 (P <0 .0 1 )。结论　齐墩果酸有抗PGCL3人肺癌细胞增殖和侵袭作用 ,并有诱导PGCL3细胞凋亡的作用。其抗侵袭机理不是对侵袭的某一环节的阻断 ,而是对侵袭各个基本环节都有抑制作用     

人肺癌细胞株L9981-nm23-H1的建立

目的 建立转染野生型nm23-H，基因的人大细胞肺癌细胞株L9981nm23-H。。方法 应用基因克隆技术构建逆转录病毒载体pLXSN-nm23H1-EGFP。脂质体法转染PA317细胞，得到逆转录病毒，并将病毒感染L9981细胞，获得L9981-nm23H1。应用PCR和Western blot检测L9981-nm23-H1细胞中nm23H1基因及其蛋白表达。结果 成功构建了逆转录病毒载体pLXSNnm23-H1-EGFP。nm23-H1 cDNA导入到L9981细胞株中，并检测到L9981-nm23-H1细胞中有nm23-H1蛋白表达。结论 nm23-H1基因在细胞株L9981-nm23-H1中能持续、稳定和高效表达。     

人大细胞肺癌细胞系NL9980和L9981的建立及其生物学特性研究

目的 探讨从人大细胞肺癌细胞株WCQH-9801分离构建不同转移潜能肺癌细胞株的可能性，并鉴定其生物学和分子生物学差异。方法 应用单个细胞克隆技术分离建立不同肺癌细胞亚系NL9980和L9981；应用Southern blot、RT-PCR、Western blot检测NL9980和L9981细胞株中nm23-H1基因多态性、mRNA和蛋白转录表达水平；应用MTT法、平板法、Boyden小室法、染色体分型法以及动物实验检测NL9980和L9981细胞株的体内体外生物学特征。结果 ①成功分离建立具有不同转移能力的人大细胞肺癌细胞系NL9980和L9981；②L9981细胞系存在nm23-H1等位基因杂合性缺失、mRNA和蛋白表达缺失，而NL9980细胞株：nm23-H1等位基因结构和转录表达均正常；③L9981细胞株的体外增殖能力、克隆形成率和体外侵袭力均显著高于NL9980细胞株；④L9981细胞株在裸鼠体内的成瘤性和肺部转移率均显著高于NL9980；⑤NL9980和L9981染色体众数比较无显著性差异。结论 ①NL9980和L9981细胞株具有不同的生物学和分子生物学特征；②L9981细胞株的高侵袭和高转移潜能可能与nm23-H1等位基因缺失有关。