新生小鼠耳蜗基底膜体外培养的实验研究

目的建立可靠的新生小鼠离体耳蜗基底膜的培养方法,为内耳的研究提供新的条件和模型。方法在显微镜下完整分离出新生1～5 d小鼠的耳蜗基底膜组织,采用组织贴壁法在无血清培养基中进行培养,免疫荧光法检测新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织中毛细胞及螺旋神经元的生长状态。结果新生小鼠耳蜗基底膜离体培养24 h后,显微镜下观察可见基底膜贴壁生长良好,外周有新生上皮细胞和成纤维细胞长出;高倍显微镜下可见耳蜗内外毛细胞和支持细胞等结构;免疫荧光法检测可见毛细胞和螺旋神经元生长良好,并能保持较长一段时间。结论组织贴壁法无血清培养新生小鼠离体耳蜗基底膜是一种理想的耳科实验造模方法。     

重组腺病毒Ad-GFP转染新生小鼠离体耳蜗基底膜的实验分析

目的观察重组腺病毒Ad-GFP转染新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织的情况。方法取新生1～5 d小鼠的耳蜗基底膜,离体培养1 d后,加入重组腺病毒Ad-GFP继续培养1 d,在荧光显微镜及Confocal显微镜下观察病毒对离体耳蜗基底膜的转染情况。结果耳蜗基底膜离体培养1 d后,在显微镜下观察,可见基底膜贴壁生长良好,外周有新生上皮细胞和成纤维细胞长出;高倍显微镜下可见耳蜗内外毛细胞和支持细胞等结构。离体耳蜗基底膜培养组织加入重组腺病毒Ad-GFP继续培养1 d后,可见重组腺病毒Ad-GFP能高效转染新生小鼠离体耳蜗基底膜及其外周长出的新生上皮细胞和成纤维细胞;在新生小鼠离体耳蜗基底膜上,不仅大上皮嵴细胞区域、小上皮嵴细胞区域的细胞能被高效转染,毛细胞也能被高效转染。结论重组腺病毒Ad-GFP能高效转染新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织。     

豚鼠耳蜗基底膜硝酸银染色铺片法的改良与观察

目的 探讨改良硝酸银染色铺片法对豚鼠耳蜗基底膜的观察效果.方法 20只正常豚鼠分为对照组和改良组,每组10只.对照组采用传统的基底膜硝酸银染色铺片法,改良组采用直接曝光显色及逆向剥离的硝酸银染色铺片方法 (即改良法),观察基底膜毛细胞及听纤毛簇,比较两组的铺片效果.结果两组动物耳蜗基底膜均剥离完整,毛细胞和听纤毛簇显色清晰,但改良组较对照组制片所需时间明显缩短,且操作更为简便.结论 改良耳蜗基底膜硝酸银染色铺片法操作简便,效果满意.     

直流电脉冲刺激豚鼠耳蜗基底膜振动研究

为了在活体上研究哺乳类动物耳蜗基底膜的电－机械特性，将一对铂－铱电极分别置于３０只豚鼠耳蜗底回的前庭阶和鼓阶。用矩形直流脉冲电刺激蜗管，用激光多普勒测速仪测定电刺激诱发的耳蜗基底膜振动的幅度和速度。结果表明，在听敏度正常豚鼠的耳蜗，电刺激可诱发基底膜向正电极方向位移，其位移波形类似于电脉冲的矩形波。在矩形脉冲的起始沿和结束沿，由于外毛细胞的瞬态反应，可诱发与该部位特征频率一致的共振运动。据分析，这一共振运动是外毛细胞的主动耗能过程，并由耳蜗放大器参与。在听力受损的耳蜗，直流电刺激仍能引起基底膜的位移，但振铃运动明显减少或消失。这可能是受损毛细胞的能量代谢障碍所致。直流电刺激诱发的基底膜振动与声波一样，可通过行波沿基底膜向其它部位传输，这一特性奠定了电听觉和耳声发射的生理基础。     

蜗内直流电对耳蜗基底膜振动的影响

目的：探讨外加直流电流后对耳蜗基底膜振动的影响。方法：在豚鼠耳蜗底回距圆窗龛缘2．4mm处开一直径约0．4mm小孔,作为测量活体基底膜的振动速度测试窗,在测试窗上,下缘的鼓阶,前庭阶各开一小孔,将铂－铱电极置入鼓阶,前庭阶作为跨蜗管的电刺激电极,用激光多普勒干涉测速仪观察直流电流对纯音诱发的基底膜振动速度的影响。结果：当外加电流前庭阶极性为正,鼓阶极性为负时,可以看到基底膜振动速度显著增大,给相反极性电流时,基底膜振动速度减小。结论：生理状态下的正内淋巴电位是耳蜗将声音能量转变为神经冲动的必要条件,适当提高外毛细胞顶端正电位,有助于提高耳蜗放大器的增益,外加负电位则严重影响耳蜗放大器的增益。     

小鼠耳蜗毛细胞体外培养研究方法

目的建立耳蜗Corti器体外培养模型.方法取刚出生2～3天小鼠耳蜗,采用鼠尾胶表面平铺培养并结合荧光染色方法观察耳蜗毛细胞的生长情况.结果耳蜗基底膜经1～5天培养,内、外毛细胞和支持细胞生长良好,排列有序,无任何衰亡和缺损.结论耳蜗Corti器可以在体外培养环境存活一定时间并健康生长.     

耳蜗毛细胞肌动蛋白的结构与功能

本对近年来有关耳蜗毛细胞内肌动蛋白的献进行综述，重点阐述了耳蜗毛细胞内肌动蛋白在毛细胞内的分布、结构特点以及功能意义。     

蜗内直流电对耳蜗基底膜振动的影响

目的探讨外加直流电流后对耳蜗基底膜振动的影响.方法在豚鼠耳蜗底回距圆窗龛缘2.4mm处开一直径约0.4mm小孔,作为测量活体基底膜的振动速度测试窗.在测试窗上、下缘的鼓阶、前庭阶各开一小孔,将铂-铱电极置入鼓阶、前庭阶作为跨蜗管的电刺激电极.用激光多普勒干涉测速仪观察直流电流对纯音诱发的基底膜振动速度的影响.结果当外加电流前庭阶极性为正,鼓阶极性为负时,可以看到基底膜振动速度显著增大,给相反极性电流时,基底膜振动速度减小.结论生理状态下的正内淋巴电位是耳蜗将声音能量转变为神经冲动的必要条件.适当提高外毛细胞顶端正电位,有助于提高耳蜗放大器的增益.外加负电位则严重影响耳蜗放大器的增益.     

顺铂对离体培养小鼠耳蜗毛细胞钙蛋白酶表达的影响

目的：观察顺铂对离体培养小鼠耳蜗毛细胞钙蛋白酶（calpain ）表达的影响,探讨顺铂致耳蜗毛细胞凋亡的机制。方法取出生后3 d的昆明小鼠300只（600耳）,分离出耳蜗基底膜600条,体外培养24 h后,随机分为对照组和4、8、16μg／ml顺铂组,每组150条;对照组加入2ml新鲜培养基,顺铂组分别加入2 ml含不同浓度顺铂（4、8、16μg／ml）的新鲜培养基,再继续培养24 h后,应用Hoechst 33258荧光染色观察耳蜗毛细胞凋亡情况,并应用免疫荧光染色和免疫印迹（Western blot）技术检测calpain 1（μ－calpain）和calpain 2（m －calpain）在耳蜗毛细胞的表达。结果4、8、16μg／m l顺铂组耳蜗毛细胞凋亡率分别为15．63％±0．20％、38．40％±2．64％和64．24％±0．05％,均高于对照组（5．55％±0．12％）,呈现明显的量效关系;不同浓度顺铂组μ－calpain和m －cal‐pain的表达均较对照组明显增强（ P＜0．01）,且m －calpain的表达随顺铂浓度的增高而明显增强（ P＜0．01）。结论顺铂可通过calpain通路诱导小鼠耳蜗毛细胞凋亡,从而发挥毒性效应。     

三种检测耳蜗毛细胞死亡模式方法的比较

目的评估三种检测耳蜗毛细胞死亡模式方法的优缺点.方法以噪声暴露诱导灰鼠耳蜗毛细胞死亡,采用DNA荧光染料碘化丙锭(Propidium iodide,PI)染色法,原位末端标记法(TUNEL)和Caspase-3染色法标记毛细胞死亡模式,对比三种检测方法.结果PI染色法可将正常、凋亡、坏死和缺失的毛细胞区分开来,TUNEL法能初步鉴别毛细胞死亡模式,Caspase-3标记可定性凋亡和坏死的毛细胞.结论PI染色法快速、简便、可靠、经济,可用于定量检测凋亡和坏死的毛细胞.     

Comparative ultrastructure of subsurface cisternae in inner and outer hair cells of the guinea pig cochlea

Summary The subsurface cisternal systems of outer hair cells (OHCs) from different cochlear regions have been compared with the subsurface cisternal system of inner hair cells. Three main observations have been made: (1) the number of cisternal layers, when there is more than one present, is reduced along the length of an individual outer hair cell; (2) basal outer hair cells may have only one fenestrated cisternal layer; and (3) the inner hair cells possess a lateral cistern and associated pillar and filament complexes which are very similar to those of some basal OHCs. These observations are discussed in relation to hypotheses regarding the role of these structures in hair cell motility.Presented at the 25th Workshop on Inner Ear Biology in London, England, 4–7 September 1988     

Imaging and cell count in cleared intact cochlea in the Mongolian gerbil using laser scanning confocal microscopy

Objectives

To draw up a clearing protocol for Mongolian gerbil cochlea, and to assess the feasibility of quantifying and analyzing 3D cell architecture in the transparent cochleae.

CBA小鼠内耳感觉上皮的参考数据

目的测量成年CBA小鼠耳蜗和前庭的有关数据,为内耳感受器定量分析提供参考依据。方法将6只出生后3个月左右的成年CBA小鼠(12耳)的耳蜗和前庭各终器取出并制备成全耳蜗基底膜铺片和全前庭终器铺片。测量全耳蜗基底膜的总长度,以及基底膜和Corti器在耳蜗不同部位的宽度。观察并记录全耳蜗毛细胞的总数和基底膜上不同区间的毛细胞密度。观察并记录椭圆囊斑和球囊斑毛细胞的总数及其微纹区和周边区的毛细胞密度,记录壶腹嵴上的毛细胞密度。结果正常成年CBA小鼠的耳蜗基底膜长度为(5.76±0.196)毫米(平均数±标准差,下同),基底膜的宽度在耳蜗底部距起始端约1.5毫米处为(339.1±9.87)微米,在耳蜗中部距起始端约3毫米处为(304.5±11.82)微米,在耳蜗顶部距起始端约5毫米处为(300.1±7.22)微米,说明小鼠耳蜗基底膜的宽度从底回到顶回逐渐变窄。Corti器的宽度在耳蜗底部距起始端1.5毫米处为(37.80±2.24)微米,在耳蜗中部距起始端约3毫米处为(45.00±2.67)微米,在耳蜗顶部距起始端约5毫米处为(52.20±3.16)微米,可见Corti器的宽度从底回到顶回逐渐变宽。CBA小鼠全耳蜗毛细胞的总数为(3116.41±151.91)个,其中内毛细胞总数为(680.67±17.50)个,而外毛细胞的总数是(2435.8±143.46)个。耳蜗内、外毛细胞的平均密度为(541.1±9.36)个/毫米,其中内毛细胞的平均密度为(118.3±2.68)个/毫米,外毛细胞的平均密度为(422.8±11.87)个/毫米,耳蜗毛细胞在耳蜗基底膜上不同区间的毛细胞密度无明显差异(P>0.05)。小鼠椭圆囊斑上的毛细胞总数为(3300±177.51)个,球囊斑上的毛细胞总数为(3045±361.57)个。前庭球囊斑和椭圆囊斑微纹区和周边区的毛细胞密度基本相同(P>0.05),两个囊斑微纹区的平均毛细胞密度为(40.2±6.59)个/0.0025mm2,两个囊斑周边区的平均毛细胞密度为(53.2±7.18)个/0.0025mm2,可见囊斑微纹区的毛细胞密度低于周边区。尽管小鼠上半规管和后半规管壶腹嵴的毛细胞区被位于嵴中央的上皮细胞分隔为两个区域,但三个壶腹嵴上的毛细胞密度基本相同,其平均密度为(44.7±7.15)个/0.0025mm2。结论本实验所得CBA小鼠耳蜗和前庭测量数据,为进一步定量观察CBA小鼠内耳病理学改变提供了重要的参考依据。     

支持细胞在哺乳动物耳蜗发育及功能中的作用

耳蜗的感觉上皮细胞有毛细胞和支持细胞两种类型.许多研究旨在探讨听力损失的基本机制,重点针对毛细胞和螺旋神经元,较少关注支持细胞.目前对支持细胞作用的了解已从单纯的结构支持扩展到耳蜗毛细胞分化发育、耳蜗离子稳态、毛细胞感音功能的调节以及突触发生发育、毛细胞损伤修复的多个方面.本文对支持细胞在哺乳动物耳蜗发育及功能中的关键作用做一综述.     

三种神经活性物质对离体豚鼠耳蜗外毛细胞内游离钙浓度的影响

目的研究神经活性物质对耳蜗外毛细胞内游离钙离子浓度（［Ｃａ２＋］ｉ）的影响。方法应用显微荧光测钙技术检测豚鼠耳蜗离体外毛细胞［Ｃａ２＋］ｉ在加入乙酰胆碱、ＡＴＰ、碳酰胆碱之后的变化。结果在含钙的细胞外液中，乙酰胆碱、ＡＴＰ和碳酰胆碱均可引起［Ｃａ２＋］ｉ升高，幅度分别为（０．７４±０．１２９）μｍｏｌ／Ｌ（乙酰胆碱），（０．６５±０．１１）μｍｏｌ／Ｌ（ＡＴＰ），（１．１６±０．２７）μｍｏｌ／Ｌ（碳酰胆碱）；而细胞外液中无钙时，ＡＴＰ仅可引起缓慢而小幅度（０．１８±０．０５）μｍｏｌ／Ｌ的［Ｃａ２＋］ｉ升高。结论同属胆碱能毒蕈碱受体激动剂的乙酰胆碱和碳酰胆碱可作用于受体，打开离子通道，使细胞外Ｃａ２＋进入细胞内，导致外毛细胞［Ｃａ２＋］ｉ升高；细胞外液有Ｃａ２＋时，ＡＴＰ引致的［Ｃａ２＋］ｉ升高，可能是因为引发了内向的Ｃａ２＋流，细胞外液无Ｃａ２＋时，［Ｃａ２＋］ｉ升高则可能源于细胞内钙库的释放。     

豚鼠耳蜗螺旋器细胞微管蛋白的表达

目的研究正常生理状态下微管蛋白(tubulin)的结构特征和分布规律。方法采用免疫荧光标记技术,借助激光扫描共聚焦显微镜,逐层观察耳蜗毛细胞中微管蛋白的分布特点。结果豚鼠耳蜗内毛细胞、外毛细胞和支持细胞内都有微管蛋白的特异性染色,支持细胞内微管蛋白的分布自基底转到顶转逐渐减弱(纵向梯度),豚鼠耳蜗感觉细胞的微管蛋白表达则无此特征,外毛细胞静纤毛中微管蛋白着色明亮,三排"V"形清晰可见,这与以往结果不同。结论豚鼠耳蜗外毛细胞中微管蛋白的结构和分布无差异,支持细胞内的分布存在差异。表明局部结构的梯度决定局部功能的差异。     

谷氨酸调节耳蜗内毛细胞游离钙的实验观察

目的探索谷氨酸(glutamate,Glu)对离体耳蜗内毛细胞(innerhaircells,IHC)内钙信号的调控作用及其生理病理意义。方法在激光共聚焦显微镜下用钙敏荧光探针Fluo-3作为指示剂,观察外源性谷氨酸对分离的10个豚鼠耳蜗IHC胞内游离钙离子浓度(［Ca2+］i)的影响。结果分离好的正常IHC呈烧瓶形状,有明显的颈部,皮板上可观察到静纤毛,大球形的细胞体中间可见圆形的细胞核。形态完好的IHC大约存活2h,Fluo-3钙敏荧光探针染色后IHC胞体、胞核及表皮板有明显的染色梯度,表明游离Ca2+浓度从细胞核向细胞质逐渐减少。终浓度为3.85μmol/L的Glu对游离IHC内［Ca2+］i有增高趋势,而对游离外毛细胞(outerhaircells,OHC)内［Ca2+］i浓度无影响。观察10个IHC,发现9个［Ca2+］i浓度增加,1个无变化;观察10个OHC,发现7个［Ca2+］i无变化,3个略有下降。当Glu浓度增高后,IHC内［Ca2+］i先是迅速升高,继而逐渐下降。IHC外形由烧瓶状逐渐变成球形,提示IHC水肿变性。结论Glu可选择性调控IHC内［Ca2+］i,而对OHC内［Ca2+］i无影响,而过量的Glu刺激,可造成IHC［Ca2+］i的堆积,从而IHC水肿变性。