新疆细粒棘球蚴免疫诊断抗原B亚单位3基因的克隆及序列分析

目的确定细粒棘球蚴抗原B亚单位3(EgAgB8/3)的特性并为研究其免疫功能奠定基础。方法根据已报道的编码EgAgB8/3的基因序列(AF362442)设计引物,进行基因扩增,利用DNAstarProtean软件对该抗原进行分析。结果成功克隆到EgAgB8/3基因,扩增片段为207 bp;序列比对结果显示,新疆细粒棘球蚴EgAgB8/3基因与GenBank登录号为AF362442序列完全一致,同源性为100%。对该抗原分析认为具有潜在的抗原表位位点。结论细粒棘球蚴EgAgB8/3在对包虫病的免疫诊断上是较好的候选抗原,并为研究该蛋白的免疫功能及建立以EgAgB8/3抗原为主的包虫病终末宿主免疫诊断方法奠定了基础。     

细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因的克隆和序列分析

目的获得细粒棘球蚴（E.granulosus）诊断抗原（diagnostic antigen）P-29基因并进行序列分析。方法从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA,根据GenBank公共数据库检索出细粒棘球蚴诊断抗原P-29基因的已知序列设计一对引物,通过RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因,将其重组到pGEM-T载体后进行序列测定和分析。结果成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因,测序表明该片段由717bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为100％,推导编码氨基酸序列同源性为100％。结论成功克隆细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因序列,可做为包虫病重组抗原的候选基因。     

细粒棘球蚴抗原B对NOD小鼠1型糖尿病的预防作用

目的探讨细粒棘球蚴抗原B(抗原B)对非肥胖糖尿病(NOD)小鼠1型糖尿病免疫机制的影响。方法将造模成功的20只NOD小鼠依据随机数字表法分为抗原B处理组和生理盐水处理组,各10只。记录并比较两组小鼠初始/成模后/用药后1、2、3周的体质量和血糖变化值。运用酶联免疫吸附测定法检测小鼠血清中白细胞介素(IL)2/IL-10的水平;运用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测胰腺组织中两种细胞因子的表达量。结果在用药后3周各组小鼠之间体质量比较差异有统计学意义(P<0.05),生理盐水处理组体质量下降明显;生理盐水处理组血糖上升水平较抗原B处理组高(P<0.05)。酶联免疫吸附测定结果显示,抗原B处理组IL-2水平较生理盐水处理组低,血清IL-10水平高于生理盐水处理组(P<0.05)。荧光定量PCR结果:抗原B处理组IL-2 mRNA表达量较生理盐水处理组显著下调,IL-10显著上调(P<0.05)。结论细粒棘球蚴抗原B可以降低IL-2水平,升高IL-10水平,暂可认为使Th1/Th2细胞发生免疫偏移,向着有利于胰岛保护的方向,细粒棘球蚴抗原B可能有预防或治疗1型糖尿病的作用。     

细粒棘球蚴线粒体rRNA的序列测定

通过EST方法对细粒棘球蚴cDNA库进行筛选,将得到的EST序列送入GenBank和EBI进行同源性分析及登陆,对有意义的EST进行通测,得到了完整的细胞线粒体rRNA序列。并进行了同源性比较及质粒转化。为细粒棘球蚴的系统分类,鉴定及进化研究提供了新的有用依据。     

细粒棘球蚴AgB亚单位抗原基因的克隆和表达系统的优化

目的从我国细粒棘球绦虫分离株（新疆源和甘肃源）中克隆AgB1和AgB2两个亚单位基因,并试用不同的表达载体对两个AgB亚单位基因的表达情况进行比较观察。方法设计特异性引物,扩增AgB1和AgB2亚单位抗原基因,分别用pET28a（＋）、pET32a（＋）和pGEX4T-13种表达载体构建重组质粒,对AgB亚单位基因在不同载体中的表达情况进行比较。结果从我国细粒棘球绦虫分离株中克隆的AgB1和AgB2抗原基因与GenBank中的序列比对,AgB1与德国人源、巴西羊源、意大利牛源均有一定的核苷酸和氨基酸差异;AgB2与乌拉圭羊源序列完全一致。在3种载体中表达重组蛋白的结果显示,不同载体和表达系统对重组表达蛋白的生物活性和可溶性有较大的影响。结论成功地克隆了细粒棘球蚴AgB亚单位基因,AgB1和AgB2基因在3种不同表达载体中的表达情况及对融合标签蛋白的血清基础反应性的比较分析表明,两个重组抗原在pET32a载体中的表达优于pET28a和pGEX4T-1载体。     

全长细粒棘球蚴95抗原基因的克隆及DNA疫苗的构建

目的：克隆分析新疆地区细粒棘球蚴95（Eg95)抗原全长基因的结构特点，并构建Eg95 DNA疫苗。方法：根据细粒棘球蚴95抗原基因序列设计PCR引物，应用PCR方法从新疆株细粒棘球蚴cDNA文库中克隆获得Eg95全长抗原目的基因。利用定克隆技术将全长Eg95抗原基因片段克隆至真核表达质粒pcDNA3上，构建DNA疫苗pcDNA3-Eg95，测序确定基因碱基序列。利用DNAman软件及GeneBank/Blast功能，对其进行基因全序列分析及同源性比较。结果：从新疆株细粒棘球蚴cDNA文库中克隆均为正确连接全长Eg95抗原基因的重组质粒，可作为DNA疫苗作进一步的研究。新疆株全长Eg95抗原基因与GeneBank中已登录的新西兰株Eg95抗原基因序列一致。结论：成功克隆并构建了新疆株全长细粒棘球蚴95抗原基因DNA疫苗。     

细粒棘球绦虫原头蚴抗原对犬的免疫效果和抗原组份分析

分别用细粒棘球绦虫活原头蚴匀浆抗原和分泌抗原２ｍｌ，加完全佐剂和不完全佐剂，免疫犬２次，每次间隔２１天，可使犬获得不完全抗攻击感染的能力。匀浆抗原的免疫优于分泌抗原，感染率为２５％，与对照组９０％比有显著差异，并对体现人虫体的发育有明显抑制作用，孕卵率为０；分泌抗原的感染率、孕卵率与对照组相比差异不大，经抗原蛋白组份分析，原头匀浆抗原显示１４条蛋白组份，分别为２２．５、３１．０、３６．０、４０．０     

细粒棘球蚴95抗原基因的克隆及原核表达质粒的构建

目的：克隆细粒棘球蚴95（Eg95)抗原基因，构建携带目的基因的原核表达载体，为细粒棘球蚴抗原的免疫保护机制研究提供材料。方法：应用PCR方法从细粒棘球蚴cDNA文库中克隆获得Eg95抗原基因，将其克隆至pUCm-T载体，测序确定其正确性。利用定向克隆技术将Eg95抗原基因片段克隆至原核表达质粒pET28上，根据选择标记的卡那霉素抗性基因筛选到阳性克隆，通过酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆，测序确定序列。结果：测序表明所有pET28-Eg95阳性克隆均为正确连接95抗原基因的重组质粒。结论：pET28-Eg95可以进一步用于重组蛋白的表达及抗细粒棘球蚴感染的实验研究。     

细粒棘球绦虫66 kDa抗原的超微结构定位

目的：确定细粒棘球绦虫66kDa抗原在虫体组织超微结构中的精确定位。方法：本实验采用金标免疫组织化学方法，电镜观察66kDa抗原在细粒棘球绦虫原头蚴及成虫超薄切片中的定位。结果：该抗原定位于细粒棘球绦虫原头蚴及成虫虫体的体表、微毛内外、皮层、皮层合体细胞体(核周体)内和皮下肌纤维中。结论：该抗原可能由皮层合体细胞产生。     

细粒棘球蚴AgB亚单位基因的联合表达和血清学评价

目的为进一步提高AgB抗原在诊断中的敏感性和特异性,将细粒棘球蚴AgB1和AgB2两个亚单位基因在同一载体中进行联合表达,并对联合表达的重组抗原和单基因表达的AgB1、AgB2在血清抗体检测中的差异进行比较研究。方法在表达载体PET32a中构建AgB1+AgB2(AgBs)联合基因的重组质粒,用ELISA检测重组抗原与病人血清的反应性。结果构建了AgBs重组质粒,经测序证实插入的联合基因片段序列正确。AgBs重组质粒表达的融合蛋白分子量为38kDa,为不溶性蛋白。联合表达抗原AgBs对细粒棘球蚴病(CE)血清的敏感性为84.4%,特异性为80.5%;单基因表达的AgB1和AgB2的敏感性分别为75.6%和57.8%,特异性分别为72.6%和91.2%。结论成功构建了AgB亚单位联合表达基因,联合表达的AgBs抗原对CE血清的诊断价值优于单基因表达的AgB1或AgB2抗原。     

细粒棘球绦虫烯醇酶(EgEnolase)基因的克隆和序列分析

目的 细粒棘球绦虫烯醇酶基因(EgEnolase)的克隆和所编码的蛋白质的结构、功能以及应用前景分析.方法 利用美国国家生物技术信息中心(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的在线分析工具BLASTx和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPaSy.http://ca.expasy.org/),以及CBS Prediction Servers提供的蛋白序列在线分析工具,结合Vector NTI suite生物信息学分析软件,从GenBank中细粒棘球绦虫的表达序列标签(EST)数据库中发现烯醇酶的5'端和3'端的EST序列,根据预测的编码区两端序列设计引物,从细粒棘球绦虫青海绵羊分离株中用多聚酶链式反应(PCR)方法扩增其基凶组序列,PCR产物克隆到T载体,测序并分析序列中的内含子,以内含子两侧序列的合并序列为引物.采用不对称PCR方法去除其中的内含子序列,预测编码蛋白的结构和功能特征,并分析其应用前景.结果 细粒棘球绦虫青海绵羊株烯醇酶基因的基因组序列长为1 449 bp,含有两个长度分别为78 bp和69 bp的小内含子.该基因编码433个氨基酸;预测其氨基酸序列中含有一段跨膜区(aa104-124),N端在膜外,C端在膜内,恰好分为两个不同的功能域,膜内区是执行酶催化功能的主体,Swiss-Model模建的3D结构显示,膜内区由α螺旋和β折叠相间排列形成桶样结构,底物结合位点、催化中心、Mg2+结合位点等关键位点在空间上紧密靠近,位于桶形结构的中心.该蛋白还有一个潜在的核定位序列aa190-199 .该蛋白含有多个T、B细胞表位,且膜外的aa49-57.和膜内的aa228-236兼性的T、B细胞表位,线性B细胞表位aa206-213中包含了催化位点Glu210.结论 细粒棘球绦虫烯醇酶可能是一个位于虫体皮层表膜具有较好的免疫诊断和疫苗应用前景的膜蛋白,同时还可能进入细胞核调节基因表达.     

用核酸原位杂交技术观察细粒棘球绦虫66kDa抗原mRNA在虫体上的细胞定位

目的：用核酸原位杂交技术观察细粒棘球绦虫66kDa抗原mRNA在虫体上的细胞定位以及在虫体发育的不同时期mRNA含量的变化。方法：以66kDa抗原的cDNA克隆EgA31为模板制备RNA探针，与细粒棘球绦虫原头蚴、育囊和成虫虫体进行原位杂交实验。结果：原位杂交实验显示EgA31 mRNA主要位于原头蚴和成虫的皮层下某种细胞中，并在棘球蚴育囊的生发层中也存在这种细胞。在原头蚴向成虫的发育过程中虫体吸盘处细胞内EgA31 mRNA含量显著增加。结论：含EgA31 mRNA的细胞很可能是皮层细胞；EgA31蛋白可能参与吸盘上肌纤维的收缩作用并与虫体的免疫逃避功能有关。     

包虫疫苗候选抗原基因FABP的克隆与序列分析

目的 获得细粒棘球蚴脂肪酸结合蛋白（FABP）基因序列资料，并进行序列分析。方法 从包虫包囊内获取细粒棘球蚴原头蚴（protocloex)，提取RNA和DNA，分别以cDNA和基因组DNA为模板扩增出FABP基因；并将其分别克隆到T载体后进行序列测定和分析；同时将从cDNA扩增得到的FABP基因亚克隆到原核表达载体（pTGEX-4T)。结果 获得长度分别为402bp和482bp两个FABP基因，序列分析表明内含子区域在349…427bp，同源性比较结果FABP基因ORF内一个碱基突变。结论 获得了FABP基因，为研究其免疫效果奠定了基础。     

新疆吉木乃县犬肠寄生虫调查及细粒棘球绦虫虫株探讨

1983年4月在新疆吉木乃县调查细粒棘球绦虫终宿主犬107只,共发现肠寄生虫10种。感染各种寄生虫的犬为79只,73.8％。感染细粒棘球绦虫(E. granulosus)的犬为29只,27.1％。并发现细粒棘球绦虫成虫的虫体节数、顶突钩的形态、成熟节片的位置、睾丸的分布、孕节与虫体前部之比等方面与文献记载有一定差异。提示吉木乃地区可能存在细粒棘球绦虫不同的株。在一犬肠内首次发现棘头虫(Oncicola sp.)感染。犬的其他肠寄生虫感染为水泡带绦虫(T. hydatigena)44只,41.1％、多头绦虫(M. multiceps)15只,14％、豆状带绦虫(T. pisiformis)6只,5.6％、猫泡尾带绦虫(H. taeniaeformis)1只,0.93％、犬复孔绦虫(D. caninum)1只,0.93％、线中殖孔绦虫(M.lineatus)1只,0.93％、狭头钩虫(U. stenocephala)1只,0.93％、犬弓蛔虫(T. canis)21只,19.6％。