改良兔角膜上皮细胞原代培养及纯化的方法

目的 改良原代培养及纯化兔角膜上皮细胞的方法,提高角膜上皮细胞原代培养的成功率.方法 采用全角膜组织培养法培养兔角膜上皮细胞,利用机械刮除和差速贴壁法进行纯化并传代,通过倒置显微镜对细胞进行形态学观察并应用免疫组织化学的方法对细胞进行鉴定.结果 兔全角膜24 h贴壁,48 h后即可见有细胞自角膜缘爬出,5d后细胞大量爬出可见成纤维细胞和角膜上皮细胞共存,界限明显;角膜上皮细胞复层生长.在界限融合前刮除成纤维细胞,角膜上皮细胞继续旺盛生长,10 d后达到融合.兔角膜上皮细胞传至第4代后细胞体积明显变大,传至第5代,细胞衰老、凋亡.兔角膜上皮细胞免疫组织化学显示PCK单克隆抗体阳性.结论 改良原代培养及纯化兔角膜上皮细胞的方法简单、经济、有效,并可获得具有良好生物学特性的角膜上皮细胞,为角膜及角膜疾病的研究奠定实验基础.     

添加晶体皮质提高晶体上皮细胞原代培养成功率

目的介绍一种提高晶体上皮细胞原代培养成功率的方法。方法基本步骤为将一晶体前囊膜剪碎后加纯胎牛血清０．５ｍｌ和冰冻过的新生牛晶体皮质０．５～１ｍｌ，密封培养２４～４８ｈ后添加约３ｍｌ含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液继续培养。结果用该方法原代培养新生牛、幼年兔和人胚胎及角膜移植后的中青年供体标本，成功率为１００％，老年白内障手术取出标本成功率为８７％。结论添加晶体皮质可提高晶体上皮细胞原代培养成功率。     

bFGF诱导的兔晶体上皮细胞TPK及PKC磷酸化的研究

目的 :探讨bFGF对培养的兔晶体上皮细胞酪氨酸蛋白激酶 (TPK )活性的影响 ,及对兔晶体上皮细胞蛋白激酶C (PKC)活性的影响。研究TPK及PKC信号系统在LEC增殖调控中的作用。方法 :家兔晶体上皮细胞原代及传代培养 ,应用同位素掺入法检测不同浓度 (0 1、 1、 10ng/ml)bFGF作用 2 4小时后 ,1 兔晶体上皮细胞膜TPK活性的变化。 2 细胞膜PKC及细胞质PKC活性的变化。结果 :bFGF作用 2 4小时后 ,晶体上皮细胞膜TPK、PKC及胞质PKC活性均较对照组明显升高 (P <0 0 5 )。结论 :bFGF可促进兔晶体上皮细胞膜TPK活性及胞膜、胞质PKC活性升高 ,该机制可能与促进晶体上皮细胞增殖有关。     

晶状体上皮细胞培养及Ⅳ型胶原表达

目的体外培养小牛晶状体上皮细胞，免疫组织化学SABC法检测1V型胶原表达。方法小牛晶状体前囊组织块培养，晶状体上皮细胞原代和传代培养。传代2次后免疫组织化学法检测细胞内1V型胶原表达。结果原代培养2-3周后细胞成单层后传代培养，传代细胞易贴壁，9～10d后可再传代，免疫组织化学检测发现细胞质内有大量Ⅳ型胶原表达，形成细胞的骨架成分。结论晶状体上皮细胞在增生时有大量Ⅳ型胶原表达，其与晶状体后囊混浊有关。     

人晶体上皮细胞的体外培养

目的:提供一种简单可行,易于掌握的体外培养人晶体上皮细胞的方法。方法:用无齿显微镊子将晶体囊膜分离出来,剪碎后直接移至细胞培养瓶中培养,当细胞长出融合后,用胰蛋白酶消化传代。结果:接种培养4天后,可见晶体上皮细胞开始长出,并以贴壁方式生长。结论:用此方法体外培养人晶体上皮细胞,具有简单、快捷、成功率高的优点。眼科学报1997;13:170—172。     

晶体上皮细胞单克隆抗体的动物实验研究：第一部分晶体上皮细胞…

试图以免疫学方法制备特异性晶体上皮细胞膜单克隆抗体来抑制晶体上皮细胞的生长，以探索防止后发障的发生。共分四部分：１。晶体上皮细胞的培养；２，晶体上皮细胞膜单克隆抗体的制备；３，抗体的免疫学检测，４，所制备的单克隆抗体对动物和人的晶体上皮细胞的抑制作用。报告家兔晶体上细胞的原代和继代培养的方法并进行讨论。     

四种不同种属晶状体上皮细胞的原代培养及生长特性

目的：：探索大鼠、兔、犬及人四种不同种属晶状体上皮细胞( lens epithelial cells, LECs)的原代培养条件,并观察其生长特性。方法：采用不同方法取出四种晶状体囊或前囊组织,改良组织块法进行原代培养,并在倒置显微镜下观察四种LECs的形态学特征及变化。结果：大鼠、兔、犬及人四种LECs均可采用改良组织块贴壁法进行原代培养。随着种属级别的升高,LECs贴壁能力逐渐增强,细胞由不规则的多角形向卵圆形发展、胞核渐渐圆润、胞浆越来越丰富,经多次传代后四种LECs均有向纤维化发展的趋势。结论：成功改良了大鼠、兔、犬及人 LECs 的原代培养方法,在细胞及分子水平为白内障及其相关领域的研究提供了技术支撑。     

盖玻片辅助人晶状体上皮细胞原代培养法

目的：建立人晶状体上皮细胞原代培养的简便方法并比较不同来源人品状体上皮细胞的生物学特性。方法：取胎龄20周合法引产胚胎眼晶状体囊膜、中山眼科中心眼库眼晶状体囊膜和白内障患者术中撕取的前囊膜，分别在培养皿中铺平，加10乩10％DMEM培养液润湿后加盖盖玻片防止卷曲并促进粘贴．添加培养液浸没盖玻片，37℃培养。同时取相同来源的囊膜按照组织块法培养。观察细胞增殖情况并比较原代人晶状体上皮细胞与人晶状体上皮细胞系SRA01／0413晶体蛋白的表达差异。结果：在盖玻片辅助下，胚胎眼晶状体囊膜第2天即可见明显的增殖细胞由囊膜缘长出，眼库眼囊膜和白内障患者术中撕取的囊膜在3～4d的潜伏期后亦可见增殖细胞长出；组织块法培养出现部分组织块漂浮，且胚胎眼囊膜潜伏期延长至3-4d，眼库眼囊膜和白内障患者晶状体囊膜潜伏期延长至4-5d。结论：盖玻片辅助的改良组织块培养法能尽快获得体外培养的原代晶状体上皮细胞，且操作简便，值得推广应用于品状体病的研究。     

巨噬细胞对培养兔晶体上皮细胞增殖率及DNA合成率的影响

采用细胞计数及Ｈ＾３ＴＤＲ液闪测定的方法，观察巨噬细胞对体外培养兔晶体上皮细胞增殖率的影响。结果表明，在巨噬细胞调理液作用２４小时后，晶体上皮细胞增殖率及ＤＮＡ合成率均较对照组明显增高（Ｐ〈０．０５），并保持至作用后第５天。由此证实，巨噬细胞及其活性因子可促进晶体上皮细胞增殖。该机制可能与白内障术后后囊混浊有关。     

巨噬细胞增强兔晶体上皮细胞c—fos原癌基因的表达

目的验证关于人工晶体表面沉着的炎细胞可刺激残留的晶体上皮细胞增生的推测。方法将巨噬细胞及巨噬细胞调理液与培养的兔晶体上皮细胞共同孵育，用纯化的抗人Ｆｏｓ蛋白抗体做免疫细胞化学染色（ＡＢＣ法）。结果经巨噬细胞及其调理液作用的晶体上皮细胞较对照组生长迅速。在巨噬细胞后４小时，及巨噬细胞调理液作用后１小时，晶体上皮细胞核呈Ｆｏｓ蛋白染色阳性反应，而对照组为阴性。结论上述结果表明巨噬细胞能增强晶体上皮细胞     

酶-机械分离-酶消化法分离培养兔眼虹膜色素上皮细胞

目的　建立兔眼虹膜色素上皮细胞体外培养体系。方法　采用酶 机械分离 酶消化法分离兔眼IPE细胞 ,台盼蓝染色法测定细胞活力 ,在体外对其进行原代及传代培养扩增 ,倒置相差显微镜观察IPE细胞的生长情况。取第 2次传代的IPE细胞行AE1/AE3及S 10 0抗体细胞免疫组化染色对其进行鉴定。结果　酶 机械分离 酶消化法分离得到IPE细胞的活力为 70 %～ 85 % .原代细胞 16～ 4 8h贴壁 ,72h后开始生长 ,细胞大多呈多角形或方形 ,少数为梭形 ,12～ 16d生长融合为单层细胞。第 1次传代的IPE细胞 6～ 12h贴壁 ,5～ 7d生长融合为细胞单层。IPE细胞在体外培养可传 5～ 6代。免疫组化染色显示 ,几乎所有细胞胞浆呈现棕黄色阳性反应 ,对照组胞浆不染色。结论　酶 机械分离 酶消化法分离培养兔眼IPE细胞易于操作 ,联合应用细胞角蛋白、S 10 0蛋白单克隆抗体的免疫组化技术可用来鉴定IPE细胞。     

体外生长的晶体上皮细胞扫描电镜和透射电镜观察

应用扫找电镜和透射电镜技术对休外培养的人晶体上皮细胞进行观察，研究其在体生长和移行状态下超微结构变化。结果显示原代培养的细胞保见明显的细胞间连结及胞浆内大量的线粒体，高尔基氏体和核糖体等结构，而传代培养和长期培养的细胞浆内细胞器明显一减少，细胞内细胞骨架结构增加，为上皮细胞的增殖和分化提供了形态学基础，对探讨白内障的病因及术后晶体囊混浊的预防具有重要价值。     

兔角膜缘干细胞的体外培养

目的 探寻兔角膜缘干细胞体外培养方法。方法 分别用20％小牛血清营养液和20％胎牛血清营养液兔角膜缘干细胞行体外培养，观察细胞贴壁生长情况；同时对生长良好的原代细胞进行消化传代，进一步观察传代细胞的形态和生长情况。结果 20％胎牛血清营养液组，角膜缘干细胞在培养48－72h有80％贴壁生长，7－10天形成良好单层，细胞呈圆形、卵圆形或多边形，类似角膜上皮细胞；传代培养细胞形态仍正常，生长良好，但混有成纤维细胞。20％小牛血清营养液培养72h，仅有20％细胞贴壁生长，且细胞形态极不规则，有细胞“拉网”现象，培养14天仍未形成单层。结论 角膜缘干细胞的培养较常规细胞培养难，需要特殊培养基。20％胎牛血清营养液能作为角膜缘干细胞培养的基础液。     

碱性成纤维细胞生长因子对牛眼晶体上皮细胞的促增殖作用

目的观察碱性成纤维细胞生长因子（ｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ｂＦＧＦ）对牛眼晶体上皮细胞的作用。方法首先进行牛眼晶体上皮细胞原代与传代培养；在第２代培养细胞中添加ｂＦＧＦ，浓度１０－２～１０２ｎｇ／ｍｌ，借助甲基噻唑基四唑（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ＭＴＴ）测定方法观察ｂＦＧＦ对晶体上皮细胞增殖的影响。结果牛眼晶体上皮细胞体外具有易于贴附、细胞融合较快以及生长迅速等特点。添加ｂＦＧＦ后，可促进晶体上皮细胞的增殖，尤其是１０２ｎｇ／ｍｌ显示出明显的促增殖作用。结论ｂＦＧＦ在促进白内障术后晶体上皮细胞的增殖及后囊混浊上起了重要作用。     

巨噬细胞对体外培养兔晶状体上皮细胞增殖的影响

目的探讨白内障术后后囊混浊的发病机制。方法观察巨噬细胞对兔晶状体上皮细胞（rabbitlensepithelialcells，RLEC）增生的影响。结果实验组加有巨噬细胞，BLEC增殖活跃。巨噬细胞上清液48及72小时能明显促进BLEC的生长。结论巨噬细胞促进晶体上皮细胞的增生，可能是引起白内障术后后囊混浊的原因之一。     

不同成分培养基对原代兔晶状体上皮细胞生长的影响

目的:研究不同培养基对兔晶状体上皮细胞(LEC)培养的影响。方法:使用组织块贴壁法原代培养兔LEC,倒置显微镜观察不同培养基(DMEM低糖、高糖、F12)下兔LEC形态、生长速度的情况。结果:DMEM低糖和高糖培养基使培养2wk后的细胞开始出现分化,并停止生长,晶状体上皮细胞明显成纤维细胞化。DMEM/F12培养基使细胞生长良好,传至第5代时细胞开始发生转化变为成纤维细胞。结论:DMEM低糖和高糖培养基造成兔LEC增殖抑制,DMEM/F12培养基适合兔LEC的生长。     

柔毛霉素对兔晶体上皮细胞体外生长抑制的实验研究

目的：研究柔毛霉素（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）对兔晶体上皮细胞体外生长抑制，探索使用柔毛霉素以预防后发障的发生。方法：分离培养家兔晶体上皮细胞，传代后在２４孔培养板培养７２小时，计数后加入不同浓度的柔毛霉素作用１０分钟后，吸出药物并冲洗后培养５天，结果：柔毛霉素的ＬＤ５０为０．５μｇ／ｍｌ～０．７７μｇ／ｍｌ，经高浓度药物（１０μｇ／ｍｌ）作用后的标本几乎无细胞存活；经０．５μｇ／ｍｌ药物浓度作用后的细胞形态发生变化。结论：显示出低浓度柔毛霉素短时间作用后即能有效抑制晶体上皮细胞的增生。     

Baicalein对兔角膜上皮细胞的毒性分析

目的探讨12-LOX选择性抑制剂baicalein的药物毒性,为baicalein的临床应用提供参考。方法体外原代培养兔角膜上皮细胞,加入30μmol/L baicalein继续培养2、4、6d,MTT法测定细胞抑制率。制作兔角膜上皮缺损模型,同浓度baicalein制成滴眼药局部应用,观察其对在体兔角膜上皮增生和移行的影响。结果30μmol/L baicalein对体外原代培养兔角膜上皮细胞作用2d的细胞抑制率为2.6%,作用4d、6d对细胞生长没有明显的抑制作用。缺损闭合实验显示此浓度baicalein对在体兔角膜上皮细胞的增生和移行无任何影响。结论30μmol/L baicalein安全,对兔角膜上皮细胞的生长无影响。     

γ—干扰素及肝素抑制兔晶体上皮细胞生长的实验研究

目的:研究γ—干扰素及肝素对体外培养的兔晶体上皮细胞(RLEC)的生长抑制作用,探讨后发性白内障的防治方法。方法:RLEC原代细胞来自正常健康的新西兰大白兔。胰酶消化法传代。第三代细胞分别与0.1～10000u/ml剂量的γ—干扰素及100～5000u/ml的肝素孵育48小时,用MTT法检测γ—干扰素及肝素对晶体上皮细胞生长的抑制作用效果。结果:0.1～100u/ml剂量组的γ—干扰素对体外培养的RLEC无明显的抑制作用,1000u/ml及10000u/ml剂量组的γ—干扰素则对RLEC有较明显的抑制作用,其增殖抑制率分别为27％及38％。100～5000u/ml剂量组的肝素对RLEC均有明显的抑制作用。结论:一定浓度的γ—干扰素及肝素对兔晶体上皮细胞生长具有直接抑制作用。眼科学报1997;13:167—169。     

人晶状体上皮细胞的体外培养

目的建立一种简单可行的人晶状体上皮细胞体外培养的方法.方法利用组织块贴片法,对人晶状体的前囊膜和赤道部囊膜进行培养.对培养的细胞进行形态学观察和鉴定.结果组织块贴壁48～72h后可见人晶状体上皮细胞从组织块边缘长出,具有上皮细胞的形态特点,10～15 d后融合.在体外细胞可传五代,但第三代以后细胞表型向成纤维细胞转化.SABC法染色结果细胞胞浆内α-晶状体蛋白染色阳性.结论成功地建立起人晶状体上皮细胞体外培养模型,可用于后囊膜混浊发病机理和药物试验研究.