过表达IL-12的恶性黑色素瘤细胞在肿瘤免疫微环境重建过程中抑制T细胞表面PD-1的表达

目的 探讨过表达IL-12的恶性黑色素瘤细胞B16对肿瘤免疫微环境重建过程中T细胞表面PD-1表达水平的影响。方法 利用慢病毒感染小鼠黑色素瘤细胞B16以构建稳定过表达IL-12的B16细胞株;利用qRT-PCR、ELISA检测IL-12的表达情况;通过平板细胞克隆形成实验验证转染病毒对B16细胞增殖能力的影响;利用ELISA检测B16/IL-12细胞在体内表达IL-12的能力;将健康的C57BL/6小鼠随机分为2组,分别接种B16细胞及B16/IL-12细胞,14 d后用流式细胞术检测肿瘤引流区淋巴结中高表达PD-1的T细胞比例;利用650cGy剂量的放射线照射C57BL/6小鼠以构建免疫重建模型,并将造模后的小鼠随机分为2组,分别接种B16细胞及B16/IL-12细胞,将未接受放疗处理的小鼠作为对照组接种B16细胞,记录各组小鼠肿瘤生长情况,接种细胞14 d后用流式细胞术分别检测肿瘤引流区淋巴结以及肿瘤组织中PD-1+T细胞比例。结果 B16/IL-12细胞相比于B16细胞显著增加IL-12的表达（P<0.001）;转染IL-12过表达慢病毒并未对B16细胞增殖能力造成显著影响（P>0.05）;接种B16/IL-12细胞的何瘤小鼠在其肿瘤组织中含有更高水平的IL-12（P<0.01）;常规荷瘤小鼠模型中,B16/IL-12组小鼠较B16组小鼠具有更低比例的CD4+PD-1+T细胞（P<0.01）,而CD8+T细胞群中,PD-1表达水平差异不显著（P>0.05）;免疫重建小鼠模型中,接种B16细胞的小鼠肿瘤引流区淋巴结和肿瘤组织中的CD4+PD-1+T细胞（P<0.05）及CD8+ PD-1+T细胞比例（P<0.01）均高于正常B16组小鼠,接种B16/IL-12细胞的免疫重建小鼠肿瘤引流区淋巴结及肿瘤组织中的CD4+PD-1+T细胞比例（P<0.01）和CD8+ PD-1+T细胞比例（P<0.001）相比于接种B16细胞的免疫重建小鼠均有显著降低;在小鼠肿瘤生长过程中,接种B16/IL-12细胞的免疫重建小鼠的肿瘤生长受到明显抑制（P<0.001）。结论 肿瘤区域过表达IL-12后可减少免疫重建过程中肿瘤区域T细胞表面PD-1 的表达,达到良好的肿瘤控制效果。     

重组鼠白细胞介素12与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因联合治疗小鼠B16黑色素瘤

目的：研究重组鼠白细胞介素12（AdCMVIL-12）与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（AdCMVGM-CSF）的腺病毒载体联合应用对B16黑色素瘤的抗肿瘤作用。方法：将B16黑色素瘤细胞接种于C57/BL6小鼠右侧背部皮下后,待瘤体直径达5mm时将荷瘤小鼠随机分为4组,分别为AdCMVIL-12组、AdCMVGM-CSF组、AdCMVIL-12加AdCMVGM-CSF组（联合治疗组）和AdC MVLacZ组（对照组）,每组12只,并于肿瘤组织局部分别多点注射相对应剂量的腺病毒载体,观察各组小鼠肿瘤的生长情况及其诱导的细胞免疫反应,检测各组小鼠血清IL-12和GM-CSF表达水平的变化。结果：病理学观察,联合治疗组肿瘤组织内可见大片凝固性坏死,有大量的淋巴细胞、巨噬细胞浸润。治疗30 d后,联合治疗组肿瘤平均体积为（60.73±11.36 ）mm³,与对照组、AdCMVIL-12组和AdCMVGM-CSF组［分别为（675.18±80.59）、（1 86.91±19.15）和（223.45±23.11）mm³］ 比较差异均有显著性（P>0.01）。同时,AdCMVIL-12与AdCMVGM-CSF联合基因治疗可有效延长IL-12和GM-CSF的表达时间,并且对B16黑色素瘤细胞具有很强的特异性杀伤作用,杀伤率为（69.53 ± 9.20）%。 结论：IL-12与GM-CSF联合基因治疗可增强荷B16黑色素瘤小鼠的抗肿瘤免疫反应,并能有效降低单独应用AdCMVIL-12的毒副作用。     

白细胞介素12基因转染抑制B16细胞成瘤性及转移性的研究

目的探讨白细胞介素１２（ＩＬ１２）基因转移对弱免疫原性的小鼠Ｂ１６黑色素瘤细胞生长与转移的影响。方法构建小鼠ＩＬ１２两个亚单位ｐ４０、ｐ３５ｃＤＮＡ表达载体;经脂质体ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮ介导,将两真核表达载体同时导入Ｂ１６细胞;应用逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）检测ｐ４０、ｐ３５ｍＲＮＡ表达;用生物学活性检测法（致分裂激活的活化的小鼠脾细胞增殖）检测ＩＬ１２分泌;经皮下或静脉接种肿瘤细胞,检测其体内成瘤性及转移性。结果ＩＬ１２基因转染的Ｂ１６细胞（Ｂ１６ＴＩＬ１２）能够表达ｐ４０及ｐ３５ｍＲＮＡ,分泌有生物活性的ＩＬ１２;Ｂ１６ＴＩＬ１２细胞体内成瘤性降低,成瘤延迟,肿瘤生长慢,荷瘤小鼠存活期延长（Ｐ＜００１）;肺转移率降低,肺内转移灶明显减少（Ｐ＜００１）。结论ＩＬ１２基因转染可明显抑制肿瘤生长与转移     

阳离子脂质体包裹的IL-12基因对小鼠黑色素瘤的治疗作用

目的:观察体内注射阳离子脂质体包裹的小鼠白细胞介素12(mIL-12)基因对小鼠黑色素细胞瘤的治疗作用.方法:C57BL/6小鼠在接种B16黑色素细胞后3、5、7、9 d分别给予lipofectin包裹的pCmIL-12质粒治疗,观察小鼠的肿瘤生长速度、生存期以及NK细胞活性的变化.结果:阳离子脂质体明显增强pCmIL-12质粒在体内的抗肿瘤生长活性,并延长荷瘤小鼠的存活期.此外,pCmIL-12/阳离子脂质体还能显著增强荷瘤小鼠的NK细胞活性.结论:阳离子脂质体介导的IL-12基因对小鼠黑色素瘤有明显的治疗效果.     

白细胞介素12基因修饰的Lewis肺癌瘤苗的抗肿瘤免疫作用

目的：研究白细胞介素12（IL-12）基因修饰的Lewis肺癌瘤苗的抗肿瘤免疫作用。方法：用含IL-12基因的腺病毒载体,在体外以不同感染系数感染Lewis肺癌细胞,并分别接种于C57BL/6小鼠皮下,观察其致瘤性的变化;并用Lewis肺癌细胞及B16黑色素瘤细胞再 次攻击免疫后的C57BL/6小鼠,观察肿瘤发生情况。 结果：以各种感染系数AdCMVIL-12制备的瘤苗,接种于小鼠皮下后,无肿瘤生长,完全消除了Lewis肺癌细胞的致瘤性;瘤苗注射6 d后,用Lewis肺癌细胞再次攻击,仍无肿瘤生长,抑瘤率达100%;用B16黑色素瘤细胞攻击,10~12 d均有肿瘤生长,说明此瘤苗具有肿瘤特异性。结论：AdCMVIL-12能消除Lewis肺癌细胞的致瘤性,并能诱导显著的抗肿瘤免疫反应,对肿 瘤的复发及转移有较好疗效。     

CD3AK和黄芪多糖联合治疗荷瘤动物的实验研究

目的　探讨CD3AK和黄芪多糖 (APS)对荷瘤动物的治疗作用。方法　将黑色素瘤B1 6细胞移植到C57BL/ 6小鼠腹腔建立动物模型 ,分别用APS、CD3AK及二者联合治疗荷瘤鼠 ,检测荷瘤鼠脾NK细胞活性和脾淋巴细胞IL - 2诱生水平以及荷瘤鼠生存期。结果　单纯APS和单纯CD3AK细胞能延长荷瘤鼠的生存期 ,分别为 1 8.64± 1 .2 1天和 2 5 .34± 3 .68天 (荷瘤鼠对照组为 1 4 .67± 2 .82天 ,P <0 .0 1 ) ;二者联合应用 ,APS能显著增强CD3AK细胞的抗肿瘤作用 ,延长荷瘤鼠的生存期 ,其生存期为 35 .65± 3 .74天 (P <0 .0 0 1 )。通过对荷瘤鼠进行细胞免疫功能观察发现 ,CD3AK细胞和APS均具有抵抗荷瘤鼠NK细胞活性、IL - 2产生能力下降的作用 ;APS对CD3AK仍有显著增强效应。结论　APS是一种实用而有效的生物反应调节剂 ,CD3AK和APS联合应用对晚期肿瘤有一定治疗效果     

携带鼠白细胞介素-12基因重组腺病毒载体的构建及其对致瘤性的影响

目的 :构建携带鼠白细胞介素 - 1 2基因腺病毒载体 ( Ad CMVIL- 1 2 )并观察其影响 B1 6黑色素瘤致瘤性的效果。方法 :将鼠 IL- 1 2基因构建进含有 CMV启动子的双顺反子重组腺病毒载体内 ,分离纯化后 ,转染 2 93细胞 ,48h后提取细胞总 RNA,进行 RT- PCR、琼脂糖凝胶电泳 ,选取特异性片段 TA克隆、测序 ;将 B1 6黑色素瘤细胞与 Ad CMVIL- 1 2在 37℃、5 %CO2 培养箱中孵育2 h后注射到 C57/ BL6小鼠右侧腹股沟皮下 ( MOI=1 0 0 ) ,观察 Ad CMVIL- 1 2对 B1 6黑色素瘤致瘤性的抑制作用。结果 :测序结果证明 Ad CMVIL- 1 2构建成功 ,实验组未见肿瘤生长 ,抑瘤率达1 0 0 %。结论 :成功地构建 Ad CMVIL- 1 2 ,并具有明显的抑制肿瘤生长的作用。     

人参皂苷Rg3联合X射线照射对黑色素瘤细胞生长的抑制作用

目的：观察人参皂苷Rg3联合X射线照射对黑色素瘤细胞生长的抑制作用。方法：建立黑色素瘤C57BL/6J小鼠动物模型,观察Rg3联合照射对小鼠体内肿瘤生长的影响;通过黑色素瘤B16细胞体外培养,观察Rg3对其细胞受照后存活率的影响。结果：小鼠接种B16细 胞第6天,Rg3给药组肿瘤体积明显缩小,与对照组比较差异有显著性（P<0.001）;照射后12 d,照射组和给药加照射组肿瘤均明显缩小,后者缩小更为显著（P<0.05）;同时,Rg3联合X线照射使其细胞存活率下降,与其他3组比较差异有显著性(P<0.05)。结论：人参皂苷Rg3具有抑制肿瘤细胞生长的作用,联合X射线照射对抑瘤具有放射增敏作用。     

穿心莲内酯滴丸抗小鼠黑色素瘤作用的研究

目的 研究穿心莲内酯滴丸的抗肿瘤作用.方法 采用C57BL/6小鼠作为实验动物于右腋下皮下接种小鼠黑色素瘤细胞B16,建立小鼠B16皮下移植瘤模型,用穿心莲内酯滴丸(0.143 mg·20 g-1)和对照药物氢化穿心莲内酯滴丸(0.143 mg·20 g-1)灌胃治疗,观察肿瘤体积、肿瘤质量、小鼠生存率的变化,分析穿心...     

从黑色素瘤荷瘤小鼠中分离纯化髓系抑制性细胞

目的：从黑色素瘤荷瘤小鼠脾脏中分离得到CD11b＋Gr-1＋的髓系抑制性细胞（ Myeloid derived suppressor cells ,MDSCs）。方法给C57BL/6小鼠注射LPS或者小鼠黑色素瘤细胞株B16BL6后,取小鼠的脾脏细胞,检测其中CD11b＋Gr-1＋的MDSCs 细胞的比例。通过流式细胞仪（ flow cytometry, FCM）分选出CD11b＋Gr-1＋的细胞,培养24小时后,CBA（cytometric bead array）法检测其分泌IL-10的情况;提取CD11b＋Gr-1＋细胞的总RNA,利用RT-PCR的方法检测其表达IFN-β、TGF-β、iNOS、ARG-1和IDO的情况。结果与注射LPS相比,注射B16BL6细胞株的小鼠脾脏中CD11b＋Gr-1＋的MDSCs细胞的比例更高;利用FCM分选得到CD11b＋Gr-1＋的MDSCs,进一步鉴定发现其表达IL-10、IFN-β、TGF-β、iNOS、ARG-1和IDO。与先前报道的MDSCs的特征相一致。结论可从B16BL6荷瘤小鼠脾脏中获得高纯度的MDSCs用于实验研究。     

卡介苗热休克蛋白70对肿瘤细胞裂解物免疫原性的影响

的：观察卡介苗热休克蛋白70（BCGHSP70）对肿瘤细胞裂解物（TCL）免疫原性的影响,为TCL相关肿瘤疫苗的制备提供依据。方法：应用冻融法制备B16黑色素瘤细胞裂解物B16TCL,将BCGHSP70与B16TCL在体外混合制备BCGHSP70-B16TCL。将C57BL/6小鼠随机分为BCGHSP70-B16TCL组、PBS组、BCGHSP70组和B16TCL组,分别于第1和14天皮下免疫BCGHSP70-B16TCL、PBS、BCGHSP70和B16TCL。于末次免疫后第7天处死小鼠,MTT法观察不同免疫组小鼠脾淋巴细胞在B16TCL体外刺激后的增殖情况,计算刺激指数（SI）。结果：应用冻融法能够使B16细胞完全裂解,所制备的B16TCL中含有丰富的蛋白成分。与PBS组、BCGHSP70组和B16TCL组比较,BCGHSP70-B16TCL组免疫小鼠脾脏明显增大;BCGHSP70-B16TCL免疫组SI高于PBS免疫组（P=0.00）、 B16TCL免疫组（P=0.01）和BCGHSP70免疫组（P=0.00）。结论：BCGHSP70　能够增强B16TCL的免疫原性,提示BCGHSP70可能作为有效的免疫佐剂用于TCL相关肿瘤疫苗的研究。     

三氧化二砷对小鼠恶性黑素瘤抑制机制的探讨

目的:探讨三氧化二砷(As₂O₃)对小鼠B₁₆细胞实体瘤的生长抑制作用及对端粒酶活性表达的影响,旨在为临床治疗黑素瘤提供理论和实验依据。方法:以不同浓度As₂O₃作用的鼠黑素瘤B₁₆细胞荷瘤小鼠,用TRAP-PAGE-银染法检测药物作用后瘤体组织端粒酶活性的表达;通过测定荷瘤小鼠瘤体大小和肿瘤组织内微血管密度来反映不同剂量As₂O₃的抑瘤作用。结果:As₂O₃能抑制鼠B₁₆细胞实体瘤的生长,破坏肿瘤组织微血管的形成(P<0.01);As₂O₃能明显抑制鼠B₁₆细胞实体瘤端粒酶的活性。结论:As₂O₃对于B₁₆细胞实体瘤的生长有显著的抑制作用,这可能与其抑制肿瘤组织内微血管的形成和端粒酶表达活性有关。     

IL-12联合B7-1基因放射治疗对小鼠B16移植肿瘤生长的影响

目的：探讨基因联合放疗对小鼠B16移植肿瘤的抑制作用。方法：碱裂解法提取纯化质粒DNA，微量注射法直接将质粒DNA导入体内肿瘤；建立荷瘤小鼠模型, 于小鼠右后肢皮下接种5×10⁵个B16黑色素瘤细胞，待肿瘤直径达0.3~0.5 cm时开始治疗；肿瘤局部注射pNE-mIL-12和pcDNA-B7-1质粒3次，并给予3次X线照射，观察小鼠移植肿瘤的生长情况。结果：pNE-mIL-12重组质粒与pcDNA-B7-1质粒联合2 Gy放射治疗组肿瘤生长速率最低，小鼠生存时间明显延长（P<0.01~P<0.001），末次照射后31 d小鼠死亡率仅为22.2%，而且其中有1只小鼠肿瘤消退。结论：多基因联合放疗可有效抑制小鼠B16移植肿瘤的生长，其效果好于单基因治疗和单纯放疗。     

体内直接导入转基因IL—2包装细胞的抗瘤作用

利用构建分泌人ＩＬ－２的逆转录病毒的包装细胞，直接体内注射，观察了对Ｂ１６小鼠黑色素瘤生长影响及转基因效果。狭缝印迹分析结果显示，Ｂ１６细胞在体内获得ＩＬ－２ｍＲＮＡ表达。同时，肿瘤生长受到抑制，表现在小鼠成瘤与存活时间延长，免疫功能也获得增强，ＩＦＮ－γ水平升高。本结果与本室以往报道的体外基因转移的动物实验结果相符，提示直接体内注射病毒包装细胞可转移外源基因及显示抑癌作用。     

结核杆菌抗原85A与GM-CSF诱发抗鼠黑色素瘤效应研究

目的：用结核杆菌抗原85A（Ag85A）和细胞因子GM-CSF,作为异种抗原及免疫增强剂,研究其在鼠体内能否有效地诱导抗黑色素瘤免疫应答。方法：用分子生物学法构建重组质粒pRSC-Ag85A/GM-CSF,通过细胞转染获得稳定表达Ag85A和GM-CSF的B16黑色素瘤细胞。48只C57BL/6小鼠随机均分为B16细胞组、B16-pRSC细胞组、B16-Ag85A细胞组和B16-Ag85A/GM-CSF细胞组,分别将上述不同B16细胞经背部皮下接种小鼠。通过观察其致瘤性的强弱、荷瘤鼠生存时间、鼠血清IFN-γ水平以及CTL、NK细胞杀伤活性,分析Ag85A和GM-CSF在抗肿瘤免疫效应中作用。结果：B16-Ag85A/GM-CSF细胞组小鼠肿瘤生长明显受到抑制,生存时间较对照组平均延长40%,血清IFN-γ分泌较对照组高1倍,CTL、NK细胞杀伤活性与其他各组相比也有较大的提高。结论：接种稳定表达Ag85A和GM-CSF的B16细胞能降低对小鼠的致瘤性,诱导有效的抗肿瘤效应。     

C57BL/6J小鼠及鸡胚B16细胞移植瘤血管生成拟态的观察及其MMP7和MMP9的表达

[目的]探讨黑色素瘤B16细胞鸡胚和小鼠移植瘤组织中MMP7和MMP9的表达与血管生成拟态形成的关系,初步探讨宿主微环境对肿瘤细胞的影响.[方法]分别建立黑色素瘤B16细胞鸡胚和小鼠移植瘤模型,通过HE切片观察血管生成拟态的分布情况,利用免疫组化方法检测MMP7和MMP9的表达.[结果]B16细胞鸡胚和小鼠移植瘤组织中均可见血管生成拟态,并且前者显著多于后者.鸡胚移植瘤组织和小鼠移植瘤组织中MMP7的阳性细胞百分比分别为34.55±8.98和15.27±4.21,前者显著高于后者(P＜0.01),MMP9的阳性细胞百分比分别为16.38±3.34和10.53±1.95,前者显著高于后者(P＜0.01).[结论]鸡胚移植瘤可用于研究肿瘤生长早期的生物学行为,MMP7和MMP9的表达可能与肿瘤生长早期血管生成拟态的形成有关.     

茶多糖对实验小鼠B16F10细胞瘤治疗效应的机制研究

目的:观察茶多糖(TPS)对实验小鼠黑色素B16F10细胞瘤治疗效应,探讨茶多糖抑制黑色素细胞瘤的免疫学机制。方法:将C57BL/6随机分组,建立小鼠黑色素细胞瘤模型,通过持续灌胃服用茶多糖28 d,观察并记录荷瘤小鼠一般情况、肿瘤体积变化,最终检测实验小鼠NK细胞活性以及IFN-γ和IL-4分泌水平。结果:1TPS治疗组延缓了小鼠体质量改变,差异均有统计学意义(P<0.05),以中剂量治疗组尤为明显(P<0.01);2TPS治疗组小鼠肿瘤直径与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),以中剂量治疗组差异最为显著(P<0.01),中剂量抑瘤率最好;3TPS治疗组的NK细胞活性在效靶比为20∶1时,与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),中剂量治疗组的NK活性达39.06%,差异有显著统计学意义(P<0.01);4TPS治疗组IFN-γ分泌水平均显示升高,而IL-4分泌水平则呈现下降,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),以中剂量治疗组变化尤为显著(P<0.01)。结论:在本实验条件下,TPS对荷瘤小鼠显示出较为有效的治疗效应,以中剂量治疗组(400 mg/kg)效果最好,其机制可能与增强小鼠NK细胞活性、增加IFN-γ以及降低IL-4分泌水平等免疫调节有关。     

白细胞介素-24基因对B16细胞小鼠移植瘤的抑制作用

[目的]探讨重组质粒pEGFP-N1-白细胞介素(IL)-24基因对黑色素瘤B16细胞小鼠移植瘤的抑制作用及其机制.[方法]构建黑色素瘤B16细胞小鼠模型,随机分为3个组,分别向各组小鼠瘤体内注射给予脂质体包裹的基因重组质粒pEGFP-N1-IL-24(实验组),pEGFP-N1(阳性对照组)和PBS缓冲液(阴性对照组).应用HE染色对肿瘤组织形态进行观察,RT-PCR法测定移植瘤中Bax,Bcl-2,VEGF的表达,Western Blot方法研究肿瘤细胞凋亡情况.[结果]HE染色观察结果显示,实验组肿瘤组织细胞变大、胞质疏松、核深染,可见核固缩、核溶解、核碎裂.RT-PCR实验扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测结果示,实验组Bax基因及Bax蛋白的表达均较其他两组明显升高(P<0.05),而实验组Bcl-2和VEGF基因及Bcl-2和VEGF蛋白的表达均较其他两组明显降低(P<0.05).[结论]IL-24对小鼠体内的黑色素瘤B16细胞的生长有抑制作用.     

含鼠GM-CSF基因的腺病毒载体对荷B16黑色素瘤小鼠免疫功能的影响

目的：研究含鼠GM-CSF基因的腺病毒载体（AdCMVGM-CSF）直接注射荷B16黑色素瘤小鼠瘤体内对小鼠免疫功能的影响。 方法：将B16黑色素瘤细胞（5×10⁶/只）接种于C57/BL6小鼠右侧背部皮下后,将荷瘤小 鼠随机分为2组,每组12只,待瘤体直径达5 mm时分别注射AdCMVGM-CSF、AdCMVLacZ （5×10⁸ PFU/只）,检测每组小鼠的免疫功能及其对B16黑色素瘤的抑制作用。 结果：AdCMVGM-CSF实验组小鼠注射后第10天,荷瘤鼠血清中GM-CSF水平［(1 563.72±136.58)ng·L^-1］高于对照组（P<0.01）,肿瘤组织周围的CD8＋ T细胞表达明显增强。 结论：AdCMVGM-CSF可增强荷B16黑色素瘤小鼠的抗肿瘤免疫反应,具有抑制肿瘤生长的作用。