嗜肺军团菌mip基因重组质粒GFP-mip的构建及表达

目的构建嗜肺军团菌mip基因的真核重组质粒GFP-mip,并观察其在NIH3T3细胞中的表达。方法以嗜肺军团菌DNA为模版,通过PCR扩增获得mip基因,将其定向克隆到绿色荧光质粒pEGFP-C1中,构建真核重组质粒GFP-mip。经限制性核酸内切酶XhoI和BamHI酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,通过脂质体法转染到NIH3T3细胞中,利用荧光显微镜观察重组质粒的稳定表达。结果扩增出了702bpmip基因,在细胞质和细胞膜观察到较强绿色荧光。结论成功构建了真核重组质粒GFP-mip,并在NIH3T3细胞中得到了表达。     

嗜肺军团菌mip基因重组质粒GFP-mip的构建及表达

目的构建嗜肺军团菌mip基因的真核重组质粒GFP-mip,并观察其在NIH3T3细胞中的表达。方法以嗜肺军团菌DNA为模版,通过PCR扩增获得mip基因,将其定向克隆到绿色荧光质粒pEGFP-C1中,构建真核重组质粒GFP-mip。经限制性核酸内切酶XhoI和BamHI酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,通过脂质体法转染到NIH3T3细胞中,利用荧光显微镜观察重组质粒的稳定表达。结果扩增出了702bpmip基因,在细胞质和细胞膜观察到较强绿色荧光。结论成功构建了真核重组质粒GFP-mip,并在NIH3T3细胞中得到了表达。     

嗜肺军团菌主要免疫原基因真核表达质粒的构建与表达

目的 构建嗜肺军团菌主要免疫原基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip,并观察其在真核细胞中的表达.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌ip基因,将其定向插入载体pcDNA3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip.经限制性核酸内切酶HindⅢ和BamHⅠ酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ip转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot分别鉴定pcDNA3.1-ip的瞬时和稳定表达.结果 成功构建了嗜肺军团菌ip基因的真核表达重组质粒.在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pcDNA3.1-ip成功转入NIH3T3细胞,并在NIH3T3细胞中得到了瞬时表达;用嗜肺军团菌兔血清抗体检测pcDNA3.1-ip稳定转染的NIH3T3细胞,在相对分子质量为29×103处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-ip在细胞内可稳定表达IP蛋白.结论 本研究构建的嗜肺军团菌主要免疫原基因真核表达质粒pcDNA3.1-ip能够成功表达IP蛋白,表达的蛋白具有良好的免疫原性与免疫反应性.     

嗜肺军团菌mip基因的原核与真核表达重组质粒的构建

目的　扩增嗜肺军团菌 mip基因 ,导入载体 p UC18和 pc DNA3.1( ) ,构建重组质粒 p L pmip和pc DNA3.1- mip。方法　采用 PCR从嗜肺军团菌扩增得到 mip基因 ,导入载体 p UC18和 pc DNA3.1( ) ,构建重组质粒p L pmip和 pc DNA3.1- mip并转化大肠杆菌 ,用限制性酶切分析、PCR、序列分析进行鉴定。结果　扩增出 82 8bp的 mip基因 ;构建重组质粒 p L p Mip和 pc DNA3.1- mip。结论　成功扩增 82 8bp的嗜肺军团菌 Mip基因 ,构建重组质粒 p L p Mip和 pc DNA3.1- mip。     

嗜肺军团菌pip基因原核质粒的构建及其表达

目的扩增嗜肺军团菌基因pip,构建重组质粒pET-pip并在原核系统中表达。方法采用PCR,从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增出pip基因,将其定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-pip,经限制性内切酶、PCR鉴定及测序分析后,转化BL21,IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE进行鉴定。使用His-tag纯化重组蛋白PIP。结果扩增出了嗜肺军团菌726bp的pip基因,构建的原核表达重组质粒pET-pip表达并纯化出了约46kD Trx-PIP的融合蛋白。结论成功构建了嗜肺军团菌pip基因的原核重组质粒,并在大肠杆菌中得到了高效表达。     

建立检测嗜肺军团菌mip基因的PCR-微孔板反向探针杂交法

近年来随着对军团菌基因水平的深入研究和聚合酶链反应（ＰＣＲ）及其相关技术的不断发展,为军团菌检测提供了一个快速、敏感、特异的诊断方法,并已用于环境水和临床标本中的军团菌检测,具有较好的检测效果［１］。但是,要使之成为常规的临床诊断方法,尚需不断完善和...     

嗜肺军团菌momp原核重组质粒的构建和表达

目的构建嗜肺军团菌momp原核重组质粒,并纯化重组蛋白。方法以嗜肺军团菌LP1型DNA为模板,PCR扩增得到momp基因,定向克隆至原核载体PET32a（＋）中,经酶切及测序鉴定正确后,转化入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导并用SDS-PAGE电泳进行分析,其产物用亲和层析法进行纯化。结果扩增出831bp的momp基因,构建重组质粒pET-momp,诱导表达及纯化出50KD的蛋白。结论成功构建momp基因的原核表达载体并得到高效表达。     

嗜肺军团菌热休克蛋白60基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建嗜肺军团菌热休克蛋白60(HSP60)基因的真核表达载体pcDNA3.1/HSP60,并对其进行鉴定。方法应用聚合酶链式反应(PCR)技术从嗜肺军团菌扩增得到HSP60基因,并将其克隆至载体pUC18进行序列测定。将重组质粒pUC18/LpHSP60中的目的基因亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组子pcDNA3.1/HSP60,通过限制性内切酶酶切及PCR进行鉴定。结果克隆的LpHSP60基因序列与GenBank公布的一致性为98%,限制性内切酶酶切及PCR分析表明HSP60基因已成功插入pcDNA3.1中。结论成功构建了LpHSP60基因的真核表达载体,为进一步研究军团菌病HSP60基因DNA疫苗奠定了基础。     

嗜肺军团菌pilE基因体外表达及其免疫原性研究

目的 构建嗜肺军团菌Ⅳ型菌毛pilE基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-pilE,研究其真核细胞中的表达及其免疫原性.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌pilE基因,将其定向插入载体pcDNA3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1.-pilE.经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-pilE转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western-blot分别鉴定pcDNA3.1-pilE的瞬时和稳定表达产物.将pcDNA3.1-pilE作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFN-γ产生水平、CTL杀伤活性等指标,评价疫苗的免疫原性.结果 扩增出了429 bp的PilE基因,在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,在相对分子质量15000处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-pilE在细胞内表达PilE蛋白.pcDNA3.1-pilE免疫组的免疫原性均高于对照组pcDNA3.1( )组(P＜0.01).结论 成功构建了嗜肺军团菌pilE基因的真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中得到了表达,免疫小鼠后诱导了特异的体液免疫应答和细胞免疫应答.     

引入CpG基序的嗜肺军团菌lgA基因真核表达质粒的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的 构建了引入CpG基序的lvgA基因的真核表达质粒pclvgA/CpG,并在NIH3T3细胞中表达.方法 采用PCR方法 将特定CpG基序作为核酸佐剂构建于嗜肺军团菌lvgA基因侧翼,定向克隆人真核表达载体pcDNA3.1/myc-his(+),构建重组质粒pclvgA/CpG,体外阳离子脂质体转染法转染NIH3T3细胞.结果 通过测序证实真核表达质粒pclvgA/CpC中lvgA/CpC克隆片段长为657 bp,推测lvgA基因编码蛋白大小约为27.7 Ku,lvgA基因及两侧翼原设计CpG基序完整扩出,测序序列与设计序列完全符合.用免疫荧光检测重组质粒在NIH3T3细胞中瞬时表达.结论 本实验成功构建了嗜肺军团菌pclvgA/CpG真核表达质粒,并在NIH3T3细胞检测到其瞬时表达信号.     

嗜肺军团菌PAL抗原基因的克隆及真核表达

目的 构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-PAL,并观察其在NIH3T3细胞中的表达.方法.结论PCR扩增嗜肺军团菌PAL基因,定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1( )中,将经酶切、PCR扩增及序列测定正确的重组质粒命名为pcDNA3.1-PAL.脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-PAL转染NIH3T3细胞,经免疫荧光和RT-PCR检测其瞬时表达和稳定表达产物.结果 重组质粒pcDNA3.1-PAL转染NIH3T3细胞后获得了有效表达.结论 成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3.1-PAL为嗜肺军团菌核酸疫苗的进一步研究奠定了基础.     

嗜肺军团菌flaA基因的克隆及原核融合表达

目的 构建嗜肺军团菌鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)的融合表达载体,并在原核系统表达,为进一步研究鞭毛亚单位蛋白的致病作用和免疫保护性提供前提条件.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌flaA基因,与带有硫氧还蛋白基因(Trx)的高效原核表达质粒pET32a( )定向重组,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-flaA融合蛋白, 用SDS-PAGE及Western blot进行鉴定.结果 限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了嗜肺军团菌1435 bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-flaA,SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET-flaA在大肠杆菌中得到了高效融合表达.结论 成功构建嗜肺军团菌flaA基因重组质粒,并在原核系统中得到了高效表达.     

深圳市公共场所冷却塔水中嗜肺军团菌Mip序列分型研究

目的研究深圳市公共场所冷却塔水中嗜肺军团菌的基因特征。方法采用军团菌巨噬细胞感染力增强因子基因（Macrophage Infectivity Potentiator,mip）分型方法。提取深圳市51株嗜肺军团菌菌株DNA,聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）技术扩增mip基因,并将PCR扩增产物进行测序。结果每菌株测序后,序列与European Working Group for Legionella Infections（E.W.G.L.I）组织建立的数据库进行比对。51株嗜肺军团菌分为5种型别,分别为L.pnuemophile-phil-1、L.pnuemophile-sg3、L.pnuemophile-D-15、L.pnuemophile-sg10与L.pnuemophile-97-2898。结论mip分型方法可用于嗜肺军团菌的基因分型。深圳各区不同场所冷却塔水中分离的嗜肺军团菌株之间存在差异,L.pnuemophile-phil-1型别为优势型别占60.8％。     

人脂蛋白脂酶基因重组质粒的构建及其表达

目的研究野生型人脂蛋白脂酶(LPL)cDNA重组表达质粒的构建了及其在COS-1细胞中的表达。方法采用RT-PCR法从人大网膜脂肪组织获取LPL cDNA基因,以pcDNA3.1Zeo( )质粒作为载体,运用基因克隆技术构建野生型人LPLcDNA重组质粒,限制性内切酶酶切、PCR以及双向测序鉴定重组质粒;运用L ipofectam ine 2000TM将重组pcDNA3.1Zeo( )-LPLcDNA质粒导入COS-1细胞,RT-PCR法检测LPL mRNA,ELISA法和比色法分别检测细胞裂解液及细胞培养基中LPL浓度及活性。结果经限制性内切酶酶切及PCR鉴定,证实LPL基因已被连接到pcDNA3.1Zeo( )质粒中;DNA双向测序证实其产物与基因库中LPL基因序列完全一致。LPL mRNA和蛋白表达及其活性测定结果表明,pcDNA3.1Zeo( )-LPL cDNA重组质粒已转染入COS-1细胞中。结论实验成功构建野生型人LPL cDNA重组表达质粒,并证实其能在COS-1细胞中有效表达。