结核分枝杆菌Ag85B成熟蛋白基因免疫

目的　研究已构建的编码结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB) H37Ra株 Ag85 B成熟蛋白基因的真核表达质粒 p TB30 m的表达和免疫原性 .方法　以电穿孔法将 p TB30 m转染 CHO细胞 ,RT- PCR法检测转染细胞中 Ag85 B特异的 m RNA的表达 .将 p TB30 m质粒肌注免疫 BAL B/c和 C5 7BL /6小鼠 ,EL ISA法检测基因免疫的体液免疫应答效果 .分离免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,生物学方法检测 IFNγ产生水平和 MTT法检测淋巴细胞增殖 .结果　 RT- PCR检测证实 p TB30 m可在 CHO细胞中表达 .p TB30 m免疫小鼠可引起较高水平的 Ag85 B特异性的抗体应答 .免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,淋巴细胞增殖显著 ,BAL B/c和 C5 7BL/6小鼠 IFNγ的量分别达到 136 0 ng· L- 1 和 196 5 ng· L- 1 ,而生理盐水和空质粒对照组均低于 80 ng· L- 1 .结论　应进一步研究 p TB30 m作为TB的基因疫苗用于 TB的防治的效果 .     

结核分枝杆菌Ag85B/IL-2融合蛋白的原核表达、纯化、鉴定及活性初步测定

目的:在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌Ag85B/IL-2融合蛋白,并对其进行纯化、鉴定和活性初步测定. 方法:将构建的pGEX-Ag85B/IL-2重组菌BL21扩增后接种于LB培养基中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,筛选最适诱导剂浓度和最适诱导时间;梯度浓度尿素复性包涵体,经GST-Sepharose亲和层析、凝血酶切、阴离子交换层析和反相-高效液相(RP-HPLC)层析纯化Ag85B/IL-2融合蛋白,免疫印迹(Western blot)鉴定,并测定其N-末端氨基酸序列和IL-2比活性. 结果:成功在大肠杆菌中高效表达带有GST的Ag85B/IL-2融合蛋白,占菌体总蛋白的30%,主要以包涵体形式表达,于诱导后6 h表达量达最高峰. 对包涵体复性,纯化获得纯度为98.32%的Ag85B/IL-2融合蛋白,Western blot鉴定阳性,N-末端氨基酸测序与理论预期完全一致,IL-2比活性为2500 u/mg. 结论:高效表达并纯化了Ag85B/IL-2融合蛋白,为进一步研究其在膀胱肿瘤免疫治疗中的作用奠定了基础.     

结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的免疫学特性

目的　研究原核表达的结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85 B的免疫学特性 .方法　用原核表达的 Ag85 B蛋白免疫 BAL B/c小鼠 ,EL ISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果 .分离免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,MTT方法检测 IFN- γ产生水平和 MTT法检测淋巴细胞增殖 .结果　 Ag85 B免疫小鼠可引起较高水平的特异性抗体应答 ,免疫小鼠的脾淋巴细胞体外用抗原再刺激 ,淋巴细胞的增殖较显著 . MTT方法检测 Ag85 B免疫小鼠的 IFN-γ量为 96 0pg· L- 1 ,而生理盐水对照组的量低于 80 pg· L- 1 .结论　Ag85 B有可能作为新型结核疫苗的组分     

结核分枝杆菌Ag85A和Ag85B蛋白在结核病诊断的价值

目的探讨重组结核分枝杆菌Ag85A和Ag85B蛋白用于结核病的诊断价值。方法以Ag85A和Ag85B为抗原,PPD为对照,用ELISA法检测血清中特异性抗结核抗体。结果 325例肺结核病组,Ag85A、Ag85B和PPD检测的灵敏度分别为58.2%、62.2%和71.7%。健康献血组、非结核性呼吸疾病组和卡介苗接种阳转组血清同时用Ag85A、Ag85B和PPD检测,Ag85A特异性分别为94.3%、93.0%、73.7%。Ag85B特异性分别为96.4%、96.5%、85.3%。PPD特异性为93.6%、86.0%、67.9%。统计分析显示,Ag85B蛋白和PPD检测非结核性呼吸疾病组,其特异性有显著性差异（P〈0.05）。检测卡介苗接种阳转组阳性率和血清抗体滴度有显著性差异（P〈0.05）。Ag85A和Ag85B同时检测325例肺结核病组血清可显著提高检测的阳性率。结论 Ag85B蛋白抗原有较好的灵敏度和较高特异性,是ELISA的可靠抗原,与Ag85A联用可提高灵敏度,对结核病血清学诊断有较高参考价值。     

小鼠对结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的免疫反应

目的研究结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的免疫原性。方法将40只BALB/c小鼠随机分成4组,NS组、BCG组、pcDNA-HspX组和pcDNA-Ag85B-Esat6-HspX组,每组10只。BCG组只在0周时皮内注射卡介苗1次。NS组、pcDNA-HspX组及融合基因组分别于0、2、4周肌肉注射生理盐水和重组质粒DNA,共免疫3次。在免疫的第2周,4周及最后一次免疫后2周检测体血清中的总IgG水平。同时,最后一次免疫后2周,取脾细胞检测细胞免疫反应。结果构建的融合基因重组质粒DNA免疫动物后能产生针对结核杆菌特定抗原的特异性细胞免疫和体液免疫应答,具有较强的免疫原性。结论结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因可作为DNA疫苗进行保护作用的研究。     

结核分枝杆菌Ag85B和MPT64基因疫苗的免疫原性比较

目的 :研究并比较结核分枝杆菌 (H37Rv)Ag85B和MPT6 4DNA疫苗免疫学特性 .方法 :雌性C5 7/6小鼠 2 0只 ,随机分为 4组 .A组 (PBS)、B组 (pcDNA3.1)、C组 (pcDNA/Ag85B)、D组 (pcDNA/MPT6 4 ) ;分别于胫前肌注射 7.5g·L-1利多卡因和质粒混合物 (1∶4 ,5 0 μL) ,含质粒 70 μg/次 ,末次免疫后 4wk收集血清测总IgG ,分离脾淋巴细胞用PPD刺激后分别作脾淋巴细胞增殖实验 (MTT法 )和测上清中IFN γ 含量 .结果 :Ag85B和MPT6 4基因疫苗均能诱导小鼠产生特异性的IgG(平均滴度为 1∶80和 1∶6 0 )、脾淋巴细胞增殖 (比值≥ 2 )和IFN γ 的分泌 (Ag85B 176 2ng·L-1;MPT6 4 15 2 3ng·L-1) ,其淋巴细胞增殖和IFN γ 的分泌水平 ,Ag85B优于MPT6 4 .结论 :Ag85B和MPT6 4DNA疫苗均能诱导小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫 .     

结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因的构建表达

目的：构建结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B-MPT64融合基因并在真核细胞中表达．方法：采用序贯PCR(geneSOEing)法将Ag85B和MPT64编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3经PCR扩增融合，定向克隆入pcDNA3．1( )中。采用脂质体转染法将pcDNA／Ag85B—MPT64(pcDNA／AM)转染COS-7细胞，用RT-PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达。结果：Ag85B-MPT64融合基因经双向DNA序列测定，碱基突变率为0．11％(2／1707)，突变为无意义突变；重组质粒转染COS-7细胞后经检测证实，该融合基因能在真核细胞中表达。结论：成功地构建了Ag85B-MPT64融合基因并在真核细胞中表达，融合蛋白具有良好的抗原性。     

结核分枝杆菌Ag85B-Ag85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达

目的：构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体．方法：采用gene SOE-ing法将Ag85B和Ag85A编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3行PCR扩增融合，经限制性内切酶消化后克隆入pcDNA3．1( )中构建真核表达质粒pCDAg85B-A，酶切、DNA测序鉴定，用脂质体法将pCDAg85B-A转染COS-7细胞，采用RT-PCR，ELISA方法检测其表达．结果：Ag85B-Ag85A融合基因定向克隆人pcDNA3．1( )，双向测序表明碱基无突变，Ag85B-Ag85A融合基因在真核细胞中能表达．结论：成功构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体，为结核病基因疫苗的研究奠定基础．     

结核分枝杆菌Ag85B、TB10.4及Ag85B-TB10.4融合基因的克隆表达及生物信息学分析

目的构建结核分枝杆菌Ag85B、TB10.4及Ag85B-TB10.4融合表达载体,并进行抗原的生物信息学分析,为候选疫苗筛选奠定基础。方法从结核分枝杆菌H37Rv菌株中分别扩增出Ag85B基因,TB10.4基因,Ag85B-TB10.4;将Ag85B克隆入pET-28a(+)表达载体中,将TB10.4和Ag85B-TB10.4分别克隆入pET-SUMO表达载体中。上述重组质粒转化入大肠埃希杆菌BL21菌中(DE3),经IPTG诱导表达,并对其进行生物信息学分析。结果 (1)成功将结核分枝杆菌Ag85B和TB10.4,Ag85B-TB10.4基因分别克隆入pET28a(+)和pET-SUMO表达载体中,经IPTG诱导蛋白表达后,对经超声裂解的菌液上清进行SDSPAGE电泳,表明获得了与预期蛋白大小一致的表达产物,重组融合蛋白pET-SUMO-Ag85B-TB10.4蛋白分子质量约为54kDa。(2)生物信息学分析显示Ag85B-TB10.4融合蛋白具有多个潜在抗原位点。结论成功构建了重组质粒pET-28a-Ag85B,pET-SUMO-TB10.4和pET-SUMO-Ag85B-TB10.4,并获得了Ag85B,TB10.4和Ag85B-TB10.4的可溶性原核表达产物;生物信息学分析在Ag85B与TB10.4蛋白加入一段蛋白linker后蛋白的亲水性增强,抗原决定簇面积增大,为后续的功能实验研究奠定了基础。     

Ag85A与Ag85B DNA疫苗对膀胱肿瘤免疫效应的实验研究

目的 研究单独及联合应用Ag85A与Ag85B DNA疫苗对膀胱肿瘤的免疫效应.方法 选择6～8周龄雌性Wistar大鼠作为实验对象.以膀胱灌注MNU建立膀胱原位癌模型,左后肢皮下注射BTT739细胞株建立种植性膀胱肿瘤模型.于末次膀胱灌注后14 d随机处死10只大鼠,以确定模型是否成功建立.每种模型均随机分为6组(每组8只):生理盐水(NS)组、pcDNA3.1组(空白质粒组)、pcDNA3.1-Ag85A(Ag85A)组、pcDNA3.1-Ag85B(Ag85B)组、pcDNA3.1-Ag85A+Ag85B组(联用组)、卡介苗(BCG)组,并予相应干预治疗.计算各组肿瘤生长抑制率、荷瘤鼠脾脏T细胞亚群数量变化,检测血清干扰素(IFN)-γ水平,剥离肿瘤进行病理组织学检查.结果 肿瘤生长抑制率:BCG组最高达63.53%,其余依次为联用组53.56%、Ag85B组33.08%、Ag85A组11.50%、空白质粒组1.10%;干预治疗后空白质粒组T细胞亚群无明显变化,其余各组CD4+T细胞与CD8+T细胞亚群的数量及CD4+/CD8+比值均有增加(P＜0.05或P＜0.01);空白质粒组血清IFN-γ平无变化,BCG组升高最明显,其余依次为联用组、Ag85B组、AgB5A组.病理组织学观察显示BCG组、联用组、Ag85B组肿瘤坏死明显,而Ag85A组、NS组和空白质粒组肿瘤坏死不明显.结论 Ag85A与Ag85B DNA疫苗对大鼠原位及种植性膀胱癌有明显的免疫效应,Ag85B DNA疫苗的免疫效力强于Ag85A DNA疫苗;两者联用效果更显著,但不及BCG的抗肿瘤效果.     

结核分枝杆菌Ag85B与IL-2基因双顺反子真核表达质粒的构建及体外表达

目的:构建结核分枝杆菌Ag85B与白细胞介素2(IL-2)双顺反子真核表达质粒。方法:以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,通过PCR扩增出Ag85B基因。采用亚克隆的技术从pcDNA3.1-IL-2中获得小鼠IL-2基因的cDNA片段。将两者分别定向插入真核双表达载体pIRES,构建表达两个目基因的双顺反子重组质粒,然后用脂质体包裹体外转染A549细胞,RT-PCR检测Ag85B及IL-2的表达。结果:酶切分析及序列测定证实重组质粒构建正确;该重组质粒能在体外表达Ag85B及IL-2 mRNA。结论:成功构建了结核杆菌Ag85B及IL-2基因双顺反子真核表达质粒,为进一步在整体动物水平的实验研究奠定了基础。     

结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株的构建

目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85B编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，PCR扩增Ag85B编码基因，用限制性内切酶消化后，插入真核表达载体pVaxl中，转化大肠杆菌DH5a，进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌PCR扩增为阳性，经限制性内切酶消化后可见目的条带，所测定序列与报道的Ag85B序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株。     

结核分支杆菌Ag85B融合蛋白表达载体的构建及纯化

目的：构建结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌的融合表达载体,制备MBP／Ag85B融合蛋白并将其纯化。方法：常规方法构建重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B,内切酶EcoRⅠ/HindⅢ酶切鉴定;重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B转化大肠杆菌,经0．3mmol／L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D thiogalactoside,IPTG）诱导表达产生融合蛋白（MBP／Ag85B）,Western blot鉴定表达产物。pMAL纯化树脂（Amylose resin）对MBP／Ag85B融合蛋白纯化。结果：重组质粒pMAL-p2-Ag85B经EcoRⅠ／HindⅢ酶切后,1％琼脂糖凝胶电泳证实Ag85B正向插入pMAL-p2载体,重组菌经IPTG诱导后,有约70kD蛋白表达,与预期的融合蛋白分子量相符,蛋白表达量约占细菌总蛋白量的40％;Western blot显示,MBP／Ag85B融合蛋白与人抗结核IgG抗体呈特异性反应;经Amylose resin纯化后,MBP／Ag85B融合蛋白的纯度可达95％以上。结论：成功构建结核分支杆菌Ag85B重组融合蛋白表达质粒并制备及纯化其融合蛋白,为进一步研究Ag85B生物学功能及其抗原表位分析奠定了物质基础。     

分枝杆菌Ag85B多克隆抗体的研制

目的在原核系统中表达并纯化GST-Ag85B融合蛋白,制备兔抗Ag85B多克隆抗体.方法首先构建编码结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组表达质粒pGEX-Ag85B,将此质粒转入大肠杆菌,诱导表达融合蛋白并加以纯化;然后将纯化的蛋白免疫家兔,提取家兔的抗血清,纯化制备多克隆抗体并进行鉴定.结果成功构建了原核表达质粒pGEX-Ag85B,转化入大肠杆菌BL21中诱导表达并成功纯化,用纯化的GST-Ag85B融合蛋白成功制备了兔抗Ag85多克隆抗体.结论制备的多克隆抗体为进一步的研究奠定了基础.     

细胞因子IL-18基因对Ag85A DNA疫苗诱导产生抗体水平的影响

目的 :研究表达含白介素 (IL) 18基因的质粒 ,对结核分枝杆菌 (MTB)H37Rv Ag85A基因疫苗诱导免疫应答的影响。方法 :从正常人外周血单核细胞 (PMBCs)中提取RNA ,用RT PCR扩增IL 18cDNA ,并克隆入载体pGEM Teasy中。测序证实后 ,亚克隆真核表达载体pcDNA3.1的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。将分别表达人IL 18基因的真核表达质粒pcIL18与MTBpcAg85A基因疫苗联合肌注免疫BALB c小鼠 ,共免疫 3次 ,每次间隔 2周。每次免疫后 2周采血 ,分离血清 ,用ELISA检测小鼠血清抗Ag85A抗体的滴度。结果 :用RT PCR成功地从人PMBCs的RNA中扩增IL 18cDNA ,测序结果正确。用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定证实 ,目的基因已插入载体pcDNA3.1中 ,阳性克隆命名为pcIL18。联合应用pcIL18,三次免疫后血清抗Ag85A抗体的滴度明显较单独应用pcAg85A增高。结论 :pcIL18与pcAg85A基因疫苗联合免疫 ,可显著增强Ag85A抗原的特异性体液免疫应答。pcIL18+pcAg85A基因联合免疫是否具有增强Ag85A抗原特异性细胞免疫的作用有待进一步研究     

结核分枝杆菌Ag85BmRNA在脊柱结核病灶中的检测和临床意义

目的探讨逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）在脊柱结核临床诊治中的应用价值,从病原学角度出发探讨脊柱结核手术病灶的切除范围。方法用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测25例脊柱结核患者病灶硬化壁、硬化壁外“亚正常骨”以及干酪样坏死组织中的结核分枝杆菌Ag85BmRNA。结果干酪样坏死组织、硬化骨组织、亚正常骨组织Ag85BmRNA检测阳性率分别76％（19／25）、64％（16／25）、28％（7／25）,组间差异有统计学意义（P〈0．05）,平均报告时间2d。结论（1）逆转录聚合酶链反应检测脊柱结核病灶中结核分枝杆菌,具有快速、灵敏、特异性高等特点;（2）脊柱结核病灶硬化壁中存留具有生物活性的结核菌;（3）亚正常骨组织应根据具体情况并结合影像资料判断切除范围。     

结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌中的高效表达

目的 通过结核分支杆菌Ag85B蛋白编码基因在大肠杆菌中稳定表达，以获得大量纯化的Ag85B蛋白。方法 采用DNA重组技术构建结核分支杆菌Ag85B基因的表达载体，双酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定重组子，阳性重组子转化大肠杆菌，并诱导表达外源蛋白。十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)鉴定Ag85B蛋白抗原在大肠杆菌中的表达，对染色的凝胶扫描，以测定目的蛋白表达水平。结果 菌体蛋白经SDSPAGE，含阳性重组质粒的菌体蛋白中出现一条新蛋白带，表达量占菌体总蛋白的33％～38％。Ag85B蛋白抗原在大肠杆菌中表达方式主要是包涵体形式。结论 构建的大肠杆菌重组体能高效表达结核分支杆菌Ag85B蛋白抗原。