α_(1A)-和α_(1B)-肾上腺素受体介导HEK293细胞增殖和Ca~(2 )-钙调蛋白依赖性蛋白激酶激活(英文)

目的:研究α_1-AR三种亚型对细胞增殖和Ca~(2 )-钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CCDPK)的作用。方法:采用磷酸钙沉淀法进行转染,用放射配基结合实验测定α_1-AR表达量。用[~3H]胸腺嘧啶参入量测定细胞增殖,用免疫沉淀和髓鞘蛋白底物法测定CCDPK的活性。结果:三株表达α_(1A)-,α_(1B)-和α_(1D)-AR的细胞株表达受体密度约为0.6 nmol·g~(-1)。在普萘洛尔存在下,去甲肾上腺素(NE)作用24 h可浓度依赖地刺激HEK293/α_(1A)-AR和HEK293/α_(1B)-AR细胞DNA合成。NE 10 μmol·L~(-1)可促进HEK293/α_(1A)-AR和HEK293/α_(1B)-AR细胞DNA合成增加,刺激CCDPK活性的升高。NE不引起HEK293/α_(1D)-AR细胞DNA合成和CCDPK活性的显著改变。结论:在转染α_1-AR亚型的HEK293细胞中激动α_(1A)-或α_(1B)-AR可引起细胞增殖,激动α_(1D)-AR则无显著改变。     

α_1-肾上腺素受体三种亚型介导的HEK293细胞中环腺苷一磷酸蓄积的特点(英文)

目的:研究α_1-肾上腺素受体各亚型介导的HEK293细胞中环腺苷一磷酸蓄积反应的特点。方法:(1)用磷酸钙沉淀法将编码三种亚型α_1-肾上腺素受体的全长cDNA分别转染到HEK293细胞中。(2)采用放射配基结合实验测定各亚型α_1-肾上腺素受体在HEK293细胞的表达量。(3)用[~3H]腺嘌呤掺入法测定环腺苷一磷酸蓄积率。结果:(1)各亚型激活后均使HEK293细胞中环腺苷一磷酸蓄积率呈浓度依赖性增加,并被α_1-受体选择性拮抗剂哌唑嗪阻断。(2)比较各亚型的药理学特性发现,在三种亚型中,α_(1A)-肾上腺素受体介导的效应最强,而α_1-肾上腺素受体各亚型对去甲肾上腺素的敏感性最高。结论:三种亚型α_1-肾上腺素受体均能介导HEK293细胞中环腺苷一磷酸的生成,并且在介导的效应和敏感性的高低等方面存在差异。     

酪氨酸蛋白激酶在不同α_1肾上腺素受体亚型Ca~(2+)调控中的作用

目的　了解酪氨酸蛋白激酶信号途径在不同α1肾上腺素受体亚型Ca2 +调控中的作用。方法　用Fura 2荧光探针双波长测定细胞胞浆游Ca2 +浓度 ([Ca2 +]i)的方法 ,在分别转染了α1A、α1B和α1D肾上腺素受体cDNA的HEK2 93细胞 ,观察酪氨酸蛋白激酶抑制剂Genistein和磷脂酶C抑制剂U7312 2 对激动不同α1肾上腺素受体亚型引起的 [Ca2 +]i 变化的影响。结果　预先用U7312 2 (0 1,10 ,5 0 μmol·L-1)与细胞共同孵育 10min ;用Genistein(10 ,10 0 ,2 0 0 μmol·L-1)与细胞共同孵育 1h。在分别转染了α1A、α1B和α1DcDNA的HEK2 93细胞 ,U73 12 2 和Genistein均能浓度依赖性地抑制肾上腺 (10 μmol·L-1)引起的双相 [Ca2 +]i 的升高。在上述细胞 ,U7312 2 (5 0 μmol·L-1)能完全抑制肾上腺素引起的[Ca2 +]i 升高 ;而用最大有效浓度 10 0 μmol·L-1的Genistein只能部分抑制肾上腺素升高 [Ca2 +]i 的作用。结论　在HEK 2 93细胞 ,不同α1肾上腺素受体亚型 (α1A α1B和α1D)激动均能部分通过酪氨酸蛋白激酶信号途径引起Ca2 +释放和Ca2 +内流。α1肾上腺素受体可能通过G蛋白和酪氨酸蛋白激酶两种途径激活磷脂酶C     

丝氨酸331是蛋白激酶C诱导血栓素α受体磷酰化和脱敏的主要部位(英文)

目的:检测人类血栓素α受体(TPα)C端丝氨酸/苏氨酸残基的各种两氨酸诱变体作为PKC底物的能力,以确定被PKC磷酸化和脱敏的特异的丝氨酸/苏氨酸残基.方法:为了易于鉴定被磷酰化的细胞内区段,使用甘胱甘肽S-转移酶(GST)-细胞内区段融合蛋白作纯化的PKC底物,然后突变磷酰化蛋白的cDNA,以找出TPα被PKC磷酰化的主要部位,并将有组氨酸尾野生型或诱变型血栓素受体α稳定地转移到人类胚胎肾(HEK)293细胞,以研究该受体的磷酸化和脱敏.结果:仅C-端能充当纯化PKC底物.丝氨酸-331(mP4)被显示强的磷酰化,丝氨酸-324(mP1)则轻微磷酰化,丝氨酸-329(mP3)则微弱磷酰化,而其它丝氨酸/苏氨酸残基没被发现磷酰化.佛被醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸盐(PMA)诱导表达野生型TPα的HEK 293细胞磷酰化.然而不能显示触发表达丝氨酸331丙氨酸诱变受体的HEK 293受体磷酸化.用PMA预处理表达野生型受体的HEK 293细胞能抑制I-B0P诱导Ca~(2 )释放,然而用PMA预处理表达诱变受体的细胞不能中止I-BOP抑制Ca~(2 )释放.结论:丝氨酸331是TPαa磷酰化和脱敏的主要和关键部位.     

醋柳黄酮对血管平滑肌细胞胞内游离钙浓度的影响

目的 :探讨醋柳总黄酮 (TFH)对血管平滑肌细胞胞内游离钙浓度 ([Ca2 ]i)的影响。方法 :采用新一代钙荧光探针Fluo 3 AM检测在高钾、去甲肾上腺素 (NE)、血管紧张素II(AngⅡ )刺激下单层兔主动脉平滑肌细胞内游离钙水平的改变 ,并与传统的钙拮抗剂Verapamil(Ver)进行对照研究。结果 :TFH(10 0mg·L-1)对静息状态的血管平滑肌细胞[Ca2 ]i 无明显影响 ;TFH(6 0～ 10 0mg·L-1)呈剂量依赖性抑制高K 去极化引起的 [Ca2 ]i 升高 ,与Ver作用相似 ,但弱于Ver ;TFH (80、10 0mg·L-1)对NE、AngⅡ通过受体介导引起 [Ca2 ]i 升高均具有明显的抑制作用 ;在无细胞外Ca2 存在下 ,TFH (80、10 0mg·L-1)对NE引起的 [Ca2 ]i 升高也具有一定程度的抑制效应。结论 :醋柳总黄酮通过对电压依赖性钙通道和受体操纵型钙通道双重抑制降低血管平滑肌细胞内游离钙水平 ,这可能是醋柳黄酮产生舒血管降压作用机制之一。     

Tyrosine kinases participate in α_(1A)-adrenoceptor-mediated vasoconstriction in perfused rat hindlimb

目的：研究酪氨酸激酶是否参与α１Ａ肾上腺素受体引起血管平滑肌收缩的信号传导．方法：灌流大鼠后肢血管床标本，观察酪氨酸激酶抑制剂对去甲肾上腺素（ＮＥ）引起收缩反应的影响．结果：酪氨酸激酶抑制剂ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ和ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ均显著抑制ＮＥ引起的收缩反应，但对ＫＣｌ引起的收缩反应无影响；酪氨酸磷酸酶抑制剂Ｎａ３ＶＯ４显著加强ＮＥ引起的收缩反应；ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ和ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ对蛋白激酶Ｃ激动剂ｐｈｏｒｂｏｌ１２ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３ａｃｅｔａｔｅ引起的收缩反应均无影响，但均抑制Ｇ蛋白激动剂ＮａＦ引起的收缩反应．结论：Ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ和ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ敏感的酪氨酸激酶参与α１Ａ肾上腺素受体介导的大鼠后肢血管床收缩反应     

大鼠血管α_1肾上腺素受体两种亚型减敏与增敏过程的差别(英文)

研究α_1肾上腺素受体(α_1-AR)不同亚型之间激动剂诱导的减敏和利血平化诱导的增敏过程的差别.方法:采用大鼠离体血管收缩功能实验,观察主动脉、肾动脉和肠系膜动脉在CEC 100 μmol·L~(-1)温育30 min后,NE介导的累积浓度收缩曲线(CCRC)的变化,以观察不同血管的亚型差异;在观察减敏时,血管用NE 10 μmol·L~(-1)预温育1 h,洗出后做NE的CCRC;在观察增敏的差异时,大鼠用reserpine 4 mg·kg~(-1)ip 48 h后,观察NE诱导的CCRC的变化.本实验在灌流液中含yohimbine和propranolol以阻断α_2-和β-AR,这样NE仅激活α_1-AR.结果:CEC 100 μmol·L~(-1)温育30 min,使NE介导的主动脉,肠系膜动脉的最大收缩分别降低82.5±3.0％和54.2±9.5％,而对肾动脉则无影响,再次肯定主动脉主要含α_(1B)-AR,肾动脉主要含α_(1A)-AR,肠系膜动脉兼含两种亚型.NE 10 μmol·L~(-1)温育1 h后,NE介导的主动脉,肾动脉和肠系膜动脉收缩的敏感性降低,EC_(50)分别增加了14.4±5.9,1.8±0.8和7.3±1.8倍;而在利血平化大鼠NE介导肾动脉收缩反应增加了56％,主动脉则无变化.结论:α_(1B)-AR亚型介导的反应易发生减敏;a_(1A)-AR亚型介导的反应易发生增敏.     

α_(1D)-肾上腺素受体的稳定表达及其Ca~(2+)调控

目的探讨人α_(1D)-肾上腺素受体（α_(1D)-adrcnerslcreceptor,α_(1D)-AR）触发细胞的Ca(2+)释放和Ca(2+)内流机制。方法：将编码人α_(1D)-ARcDNA转染到缺乏α1－AR的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞,建立稳定表达纯一α_(1D)-AR的细胞系。采用Fura－2技术观察细胞胞浆Ca(2+)浓度变化。结果：肾上腺素激活α_(1D)-AR后既触发了CHO细胞的Ca(2+)释放又引起细胞外Ca(2+)内流。磷脂酶C（phospholipaseC,PLC）抑制剂U－73122抑制α_(1D)-AR激发Ca(2+)释放的同时也抑制了Ca(2+)内流。结论：人α_(1D)-AR与PLC激活途径相耦联释放细胞内储存Ca(2+)并通过“充电式Ca(2+)内流”机制触发细胞外Ca(2+)内流。     

内源和外源去甲肾上腺素对自家血灌流毁脑脊髓大鼠肾血管平滑肌的作用

本实验用颈动脉血恒速满流毁脑脊髓大鼠(pithed rat)单侧肾脏的方法,观察了高度选择性α_1受体阻断剂哌唑嗪和α_2受体阻断剂育亨宾与去甲肾上腺素、肾上腺素及电刺激肾交感神经对肾血管平滑肌的相互作用。哌唑嗪明显抑制电刺激引起肾灌流压升高,但尚存留一小部分既不能被增加哌唑嗪的剂量所阻断也不能被育亨宾所阻断。由肾动脉直接注射去甲肾上腺素和肾上腺素引起灌流压升高作用的绝大部分可被哌唑嗪所阻断,所存留的一小部分又可被育亨宾所阻断。结果提示,在肾血管平滑肌突触后膜存α_1在和α_2两种受体亚型,以α_1受体为主,但也有很小比例的α_2受体。     

大鼠处理普奈洛尔后改变α_1受体亚型介导的心功能(英文)

目的:研究普奈洛尔(Pro)作用后,大鼠心肌α_(1A)和α_(1B)受体亚型介导正性肌力和正性频率变化.方法:测定Pro大鼠和正常鼠左心室乳头状肌和右心房收缩力和心率.结果:给予Pro后,苯肾上腺素(Phe)使乳头状肌收缩力由53±17 mg增加到90±18 mg(P<0.05).Pro和对照组收缩力分别增加20±12和5±5 mg(P<0.05).氯乙基可乐定使两组收缩力变化无区别.5-甲基乌拉地尔存在时Phe使Pro组收缩力增加13±5mg,对照组无变化.正常和心率抑制时,Phe使两组动物α_(1B)介导心率增加无差别.结论:β受体阻断,α_1介导正性肌力增加主要由α_(1B)作用增强引起.     

酪氨酸激酶抑制剂对hTrp3蛋白介导的α_(1B)-AR引起的Ca~(2+)内流的影响

目的　探讨Trp3(transientreceptorpotential 3)蛋白是否参与α1B AR引起的Ca2 + 内流以及酪氨酸激酶对其调控作用。方法　采用脂质体转染 ,将hTrp3cDNA分别转染到HEK2 93细胞和已有α1B受体稳定表达的HEK2 93细胞 ;Westernblot方法检测Trp3蛋白表达情况 ;Fura 2 /AM荧光分光光度法 ,测定胞浆游离Ca2 + 浓度。结果　HEK2 93细胞上可检测到hTrp3的内源性表达 ,转染后其表达增加。α1B HEK2 93细胞转染hTrp3cDNA后 ,α1B AR引起的Ca2 +内流显著增加 (P <0 0 1) ;转染hTrp3cDNA对thapsigargin诱导的Ca2 + 内流无作用。 5～ 30 μmol·L-1genistein对转染细胞α1B AR诱发的Ca2 + 内流有抑制作用 ,最大抑制率达(75 2± 12 6 ) %。结论　Trp3cDNA转染可能主要通过非CRAC(calciumreleaseactivatedcalcium )途径增加α1B AR引起的Ca2 + 内流 ,这一过程很大程度上依赖酪氨酸激酶的调控     

胍丁胺抑制兔房室结细胞的自发活动(英文)

目的:研究胍丁胺(Agm)对兔房室结细胞自发活动的影响及其作用机制.方法:应用玻璃微电极方法.结果:Agm不仅剂量依赖地抑制兔房室结细胞自发活动的V_(max),APA和VDD,RSF;而且延长APD_(90);idazoxan能明显抑制Agm的作用;而L-NAME不能影响Agm的作用;提高灌流液中的Ca~(2 )浓度可对抗Agm的作用;ATP-敏感性钾通道开放剂(lemakalim)可拮抗Agm延长APD_(90)的作用.结论:Agm对房室结细胞自发活动的抑制作用由咪唑啉受体和/或肾上腺素α_2-受体介导,并与Ca~(2 )内流和K~ 外流减少有关.     

老年大鼠心脏肾上腺素受体亚型的改变(英文)

目的:研究老年心脏肾上腺素受体亚型的改变.方法:制备3月龄与25月龄Wistar大鼠心脏膜标本,分别采用~(125)I-BE2254与~(125)I-Pindold作放射配基结合分析,测定α_1与β-肾上腺素受体.结果:老年大鼠心脏的α_1与β-肾上腺受体密度分别由年轻大鼠的119±4与45.9±1.9pmol/g下降至70±6与36.4±1.6 pmol/g(P<0.01),α_1-AR降低的幅度大于β-AR.此外α_(1A)与α_(1B)亚型之比由年轻大鼠的39:61下降至26:74(P<0.05).结论:老年大鼠心脏肾上腺素受体减少,且不同亚型减少的程度不同.     

胍丁胺对异丙肾上腺素诱发豚鼠乳头状肌后除极的影响(英文)

目的:研究胍丁胺(Agm)对异丙肾上腺素(Iso)诱发豚鼠乳头状肌早发和晚发后除极(EAD和DAD)的影响及其作用机制。方法:细胞内玻璃微电极技术。结果:(1)Agm明显抑制Iso诱发的EAD和DAD;(2)预先应用NOS抑制剂L-NAME0.5mmol·L~(-1),不能影响Agm1.0mmol·L~(-1)对Iso 20nmol·L~(-1)诱发EAD和DAD的抑制作用;(3)预先应用咪唑啉受体(IR)和肾上腺素能α_2受体(α_2-AR)拮抗剂idazoxan 0.1mmol·L~(-1)则可阻断这种作用。结论:Agm对Iso诱发EAD和DAD的抑制作用由α_2-AR和/或IR介导,并与钙内流减少有关。     

新型酪氨酸激酶抑制剂对hERG钾通道电流作用研究

目的探讨新型酪氨酸激酶抑制剂对hERG钾通道电流的影响。方法应用全细胞膜片钳技术,记录HEK293细胞异源表达的hERG钾电流,观察新型酪氨酸激酶抑制剂对hERG钾通道电流的抑制作用。结果新型酪氨酸激酶抑制剂能作用于hERG钾通道,并以浓度依赖的方式抑制hERG钾电流,半数抑制浓度(IC50)分别为PA1101(10.80±3.01)μmol/L,PA1102(9.55±1.81)μmol/L,PA1103(1.69±0.26)μmol/L,PA1104(1.17±0.49)μmol/L,PA1105(0.08±0.02)μmol/L,PA1106(0.001 9±0.000 7)μmol/L。结论新型酪氨酸激酶抑制剂对hERG钾通道有较强烈的阻断作用,建议结合临床使用剂量与血药浓度进行安全性评估。     

HEK293细胞中细丝蛋白-C对α_(1A)-肾上腺素受体介导细胞外信号调节激酶磷酸化作用的影响

目的　寻找与α1A 肾上腺素受体 (α1A AR)相互作用的胞浆内非G蛋白 ,研究蛋白对受体信号转导的影响。方法　应用酵母双杂交技术 ,以人α1A AR胞浆内C末端 (α1A AR CT)为诱饵 ,筛选人脑cDNA文库 ,用 5 溴 4 氯 3 吲哚半乳糖苷 (X Gal)定性分析及邻硝基苯基 β D 半乳糖苷 (ONPG)定量分析对筛选出的阳性克隆细丝蛋白 C(FLNC)进行确证。采用脂质体转染及蛋白免疫印迹技术探讨人胚胎肾 2 93(HEK2 93)细胞中FLNC对α1A AR信号转导通路的影响。结果　①缺陷培养基筛选出FLNC的C末端部分片段可以与α1A AR CT在酵母中结合。②X Gal定性分析中 ,FLNC与α1A AR CT的共转子菌落 6h即呈现蓝色 ,而对照菌落颜色无变化 ;经ONPG定量分析发现 ,FLNC与α1A AR CT的共转子中 β 半乳糖苷酶的活性大约是对照的 2～ 3倍(P <0 .0 1)。③编码FLNC的C末端片段的质粒瞬时转染于稳定表达全长α1A AR的HEK2 93细胞中 ,可以明显增强去氧肾上腺素 ( 10 μmol·L- 1,30min)激动α1A AR介导的细胞外信号调节激酶 (ERK1/ 2 )磷酸化作用。结论　FLNC的C末端部分片段可以与α1A AR CT在酵母中结合 ,并且增强HEK2 93细胞中α1A AR介导ERK1/ 2磷酸化的作用     

Expression of receptor for advanced glycosylation end products(AGEP)and inhibition of AGEP-induced cytosolic calcium elevationbydiltiazeminculturedrataorticsmoothmusclecels

目的：探讨培养的主动脉平滑肌细胞（ＡＳＭＣ）上是否表达糖基化终产物（ＡＧＥＰ）高亲性受体和地尔硫对ＡＧＥＰ升高胞浆游离钙的抑制．方法：用放射配基结合方法研究ＡＳＭＣ与ＡＧＥＰ的相互作用；用钙离子荧光指示剂Ｆｕｒａ２ＡＭ测定ＡＳＭＣ胞浆游离钙．结果：ＡＳＭＣ上有ＡＧＥＰ高亲和性受体表达，其解离常数为６５３±１５ｎｍｏｌ·Ｌ－１，最大结合容量１５７±００４ｎｍｏｌ／ｇ细胞蛋白；通过该受体介导，平滑肌细胞可内化、代谢ＡＧＥＰ．ＡＧＥＰ使胞浆游离钙呈浓度依赖性升高；地尔硫呈时间、浓度依赖性抑制此效应．结论：大鼠ＡＳＭＣ上有ＡＧＥＰ高亲和性受体表达；地尔硫可抑制ＡＧＥＰ介导的胞浆游离钙升高．     

丝氨酸331是蛋白激酶C诱导血栓素α受体磷酰化

目的：检测人类血栓素α受体（TPα）C端丝氨酸／苏氨酸残基的各种丙氨酸诱变体作为PKC底物的能力,以确定被PKC磷酰化和脱敏的特异的丝氨酸／苏氨酸残基。方法：为了易于鉴定被磷酰化的细胞内区段,使用甘胱甘肽S－转移酶（GST）－细胞内区段融合蛋白作纯作的PKC底物,然后突变磷酰化蛋白的cDNA,以找出TPα被PKC磷酰化的主要部位,并将有组氨酸尾野生型或诱变型血栓素受体α稳定地转移到人类胚胎肾（EK）293细胞,以研究该受体的磷酰化和脱敏。结果：仅C－端能充当纯化PKC底物。丝氨酸－331 （mP4)被显示强的磷酰化,丝氨酸－324（mP1)则轻微磷酰化,丝氨酸－329（mP3)则微弱磷酰化,而其它丝氨酸／苏氨酸残基没被发现磷酰化。佛波醇－12－肉豆蔻酸酯－13－乙酸盐（PMA）诱导表达野生型TPα的HEK 293细胞磷酰化。然而不能显示触发表达丝氨酸331丙氨酸诱变受体的HEK 293受体磷酰化。用PMA预处理表达野生型受体的HEK 293细胞能抑制I－BOP诱导Ca^2 释放。然而用PMA预处理表达诱变受体的细胞不能中止I－BOP抑制Ca^2 释放。结论：丝氨酸331是TPα磷酰化和脱敏的主要和关键部位。     

虎杖苷对VSMC内钙信号的调节机制初探

目的　观察虎杖苷对大鼠主动脉平滑肌细胞(VSMC)内游离钙浓度的变化 ,以探讨虎杖苷对血管平滑肌细胞的调节机制。方法　用荧光染料Fluo 3 AM标记细胞 ,在粘附式细胞仪上测定细胞内游离钙的变化。结果　给予虎杖苷 5min后 ,VSMC内游离钙浓度升高。当虎杖苷加入前 10min用河豚毒素和优降糖分别预处理后 ,其VSMC内游离钙都不再明显升高 ;而给予普萘洛尔、甲氰咪胍及亚甲蓝分别预处理时 ,细胞内钙浓度反而升得更高 ,与单纯虎杖苷作用相比差异都有显著性。结论　虎杖苷可增加细胞内游离钙浓度 ,其作用可能与钠、钾通道开放有关 ,并且受 β肾上腺素能受体、H2 受体系统及鸟苷酸环化酶系统的反向调节。     

白介素-1受体相关激酶-2的反义寡脱氧核苷酸体外抑制白介素-1诱导的核因子-кB活化(英文)

目的:研究白介素-1受体相关激酶-2的反义寡脱氧核苷酸对核因子-кB的抑制作用。方法:脂质体介导反义白介素-1受体相关激酶-2寡脱氧核苷酸转染人胚肾293细胞。夹心酶联免疫吸附测定法检测核因子-кB的含量。结果:(1)白介素-1刺激人胚肾293细胞时,核因子-кB含量明显上升(上升幅度518.5％±2.1％)。(2)白介素-1受体相关激酶-2的反义寡脱氧核苷酸呈浓度(1-8μg)和时间(5-24h)依赖性地抑制白介素-1的作用。反义寡脱氧核苷酸4μg与细胞孵育8h,约70.7％±1.0％的NF-кB活性被抑制。吸光度由对照的0.834±0.01下降到0.244±0.008。结论:白介素-1受体相关激酶-2的反义寡脱氧核苷酸抑制白介素-1诱导的核因子-кB活化。