靶向CD19的CAR修饰的NK细胞对B细胞淋巴瘤的杀伤

目的:利用鼠杂交瘤技术筛选和制备治疗性CD19单克隆抗体,探讨以CD19 scFv序列构建CD19-CAR(pCD19-CAR)修饰的NK细胞对CD19+B细胞淋巴瘤细胞的杀伤作用.方法:用偶联多肽免疫小鼠制备CD19单克隆抗体,然后用基因测序法获得抗体的序列.分析抗体序列,并通过基因合成和分子克隆技术构建pCD19-CAR片段,然后将其克隆到慢病毒载体上,病毒包装制备后,转染NK-92MI细胞.最后,用流式细胞术检测不同的pCD9-CAR-NK-92MI细胞对CD19+细胞的杀伤率.结果:(1)成功筛出特异性强的CD19单克隆抗体-pCD19;(2)抗体检测结果显示CD19+的Ramos细胞的阳性率为84.3％,Raji为85.6％,与商业化抗体结果相似;(3)被pCD19-CAR修饰的CD19-CAR阳性率为28.72％的NK-92MI细胞对CD19+的Ramos和Raji细胞的杀伤效率明显高于未被修饰的NK-92MI细胞株对Ramos和Raji细胞的杀伤率[(47.1±1.7)％vs(24.7±6.2)％和(51.8±7.9)％vs(27.6±9.6)％,均P＜0.05];对CD19-细胞Jurkat,不论是未被pCD19-CAR修饰的NK-92MI或是被修饰的NK-92MI细胞,几乎都不存在特异性杀伤作用[(16.1±0.7)％vs(17.7±2.9)％,P＞0.05].结论:成功构建pCD19-CAR,被pCD19-CAR修饰的NK-92MI细胞能特异性的识别CD19抗原并杀伤CD19+B细胞淋巴瘤细胞.     

靶向CD33 的CAR修饰的NK92 细胞对CD33+急性髓系白血病细胞的杀伤作用

[摘要] 目的：根据抗CD33-scFv 序列构建CD33-CAR 修饰的NK92 细胞,探讨其对CD33+ 急性髓系白血病（acute myeloidleukemia,AML）细胞的杀伤作用。方法：通过基因合成以及分子克隆技术获得抗CD33-CAR片段,然后将其构建到慢病毒载体上,进行慢病毒包装,将得到的慢病毒转染NK92 细胞,用流式细胞术检测细胞转染效率并通过嘌呤霉素筛选得到稳定表达抗CD33-CAR的细胞系CD33-CAR-NK92,利用钙黄绿素释放法检测该细胞的杀伤作用,ELISA法检测细胞因子IFN-γ 分泌的变化。结果：成功构建pCDH-CD33-CAR 重组慢病毒质粒,慢病毒转导后约18.7%的NK92 细胞表达CD33-CAR（命名为CD33-CARNK92细胞）,嘌呤霉素筛选后表达CD33-CAR的NK92 细胞比例约86.3%。CD33-CAR-NK92 细胞对CD33+AML细胞MOLM-13的杀伤作用明显高于未被基因修饰的NK92 细胞（P<0.01）,而两者对CD33-肿瘤细胞JURKAT 的杀伤作用没有明显差异（P>0.05）。效靶比为2∶1 共培养6 h 后,经CD33-CAR修饰的NK92 细胞相比未被基因修饰的NK92 细胞IFN-γ 的分泌水平明显升高[ （190.97±11.52）vs（88.41±2.75）pg/ml, P<0.01]。结论：CD33-CAR-NK92 细胞能特异性识别CD33 抗原并杀伤CD33+AML细胞,其杀伤作用显著高于未被基因修饰的NK92 细胞,为进一步开展靶向CD33 的CAR-NK92 细胞治疗AML的临床转化奠定了实验基础。     

靶向CD19 抗原的CAR-NK-92MI和CAR-CD19-T 细胞对套细胞淋巴瘤的体外杀伤

[摘要] 目的：探讨靶向CD19 抗原的CAR-NK-92MI和CAR-CD19-T 细胞对套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma,MCL）的体外杀伤作用。方法：利用近年来在B细胞急性淋巴细胞白血病（B-lineage acute lymphoblastic leukemia, B-ALL）临床试验中获得的成功嵌合抗原受体基因修饰的T（CAR-T 细胞）技术,针对MCL高表达CD19 抗原的情况,分别构建了靶向CD19 抗原的CAR-CD19-T和CAR-NK-92MI细胞,运用LDH释放法检测两者对MCL细胞的体外杀伤作用,另外通过流式细胞术对其杀伤作用进行了验证。结果：相对于对照,无论是CAR-NK-92MI细胞还是CAR-CD19-T 细胞,都对MCL细胞具有极高的杀伤能力（均P <0.01）,都对K562-CD19 细胞具有非常高的毒性（均P <0.01）,而对K562 细胞基本不起作用。CAR-NK-92MI细胞组MCL细胞的死亡率比对照组高30%~40%,CAR-CD19-T 细胞组MCL细胞的死亡率比对照组高40%~50%。结论：CAR-NK-92MI和CARCD19-T细胞在体外对MCL细胞具有强的特异性杀伤作用。     

嵌合抗原受体修饰的CD19-CAR-T的体外构建、扩增及初步功能鉴定

目的： 探索一种特异性靶向 CD19 分子的嵌合抗原受体修饰的 CD19-CAR-T 的构建方法,并明确其体外杀伤 靶细胞的效果。 方法： 运用分子克隆技术,将 PCR 获得的 CD19-CAR 片段构建到 pCDH-GFP 慢病毒载体上,利用包装 的慢病毒颗粒转染供者 CD3 + T 细胞,通过流式细胞术及 PCR鉴定转染效率,并通过 7-AAD染色鉴定扩增得到的CD19- CAR-T细胞体外杀伤CD19 + Ramos靶细胞的效果。 结果： 经慢病毒转染T细胞在体外培养 10 d 后,CD3 + T 扩增达（78.8± 23.2）倍, （58.3±5.4）%的 CD3 + T 细胞表达 GFP,CD19-CAR-T 体外杀伤 CD19 + Ramos 靶细胞在效靶比5∶1时效率为（57.4± 9.3）%。 结论： 本实验成功建立了一种有效的体外构建及扩增CD19-CAR-T的方法,且具有明显靶向性,为CD19 + B细胞肿瘤临 床治疗提供实验依据。     

靶向PSCA的CAR-NK-92细胞对宫颈癌的抗瘤作用

目的：构建并验证靶向前列腺干细胞抗原（prostate stem cell antigen,PSCA）的嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）修饰的NK-92细胞对宫颈癌的抗瘤活性。方法：构建PSCA靶向的CAR慢病毒表达载体,利用慢病毒感染法获得PSCA CAR-NK-92细胞。用流式细胞术及Western blotting实验检测宫颈癌细胞中PSCA的表达水平。通过体外效靶细胞共孵育实验以及体内裸鼠移植瘤模型中的治疗情况,验证PSCA CAR-NK-92细胞对宫颈癌Hela及MS751细胞杀伤能力及其裸鼠移植瘤生长的抑制能力。结果：成功构建 PSCA CAR-NK-92 细胞,PSCA 在宫颈癌细胞中高表达（均 P<0.01）。体外共孵育结果显示,PSCA CAR-NK-92细胞可以以剂量依赖的方式裂解PSCA+的宫颈癌细胞;体内抗肿瘤数据表明,PSCA CAR-NK-92细胞较转染空载体的NK-92细胞显著抑制宫颈癌移植瘤的生长（P<0.01）,并且可以有效地浸润肿瘤组织并高水平分泌TNF-α和IFN-（γ 均P<0.01）。结论：靶向PSCA的CAR-NK-92细胞在体内外都显示出了良好的对PSCA+肿瘤细胞的杀伤能力,有潜力成为一种针对宫颈癌的潜在治疗策略。     

CD20 和CD19 双靶点CAR-T细胞对B淋巴细胞肿瘤的杀伤作用

目的：设计同时靶向B淋巴细胞表面CD20 和CD19 两个抗原蛋白的双特异嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）并制备BiCAR-T 细胞,检测其对B淋巴细胞肿瘤细胞的杀伤作用以及对免疫缺陷B-NSG 小鼠白血病模型的治疗效果。方法：构建基于鼠源CD19 和人源化CD20 scFv 的双靶点CAR分子,将CAR基因装载于慢病毒载体中,在293T细胞中包装慢病毒,感染健康人T 细胞制备BiCAR-T 细胞。构建表达CD19 和CD20 的K562-CD19-GFP、K562-CD20-GFP 以及表达Luciferase 的Nalm6-Luc-GFP 细胞作为靶细胞,将BiCAR-T 细胞与靶细胞共同孵育,检测其对靶细胞杀伤能力及释放IFN-γ 水平。使用Nalm6-Luc-GFP 细胞构建白血病小鼠模型,尾静脉注射BiCAR-T细胞,通过小动物成像方法观察BiCAR-T细胞对荷瘤小鼠的治疗作用。结果：健康人来源的BiCAR-T 细胞经7 d 培养后扩增良好,扩增倍数为20~50 倍,阳性率为10%~92%,显示成功制备BiCAR-T细胞。在效靶比为10∶1 时,BiCAR-T细胞对Nalm-6、K562-CD19-GFP 和K562-CD20-GFP 的杀伤率显著高于对照组细胞[ （76.7±7.4）% vs（8.7±2.4）%、（93.3±5.2）% vs（46.7±6.2）、（51.0±0.8）vs（30.7±0.5）%,均P<0.01];与对照组相比,与Nalm-6细胞共孵育后BiCAR-T 细胞分泌IFN- γ 量显著增加[（872.7±7.7）vs（101.0±5.3）pg/ml ,P<0.01]。动物实验表明,BiCAR-T细胞对B-NSG小鼠白血病模型治疗效果明显,注射BiCAR-T细胞后白血病细胞逐渐减少,第50 天时基本消失,小鼠全部存活至第70 天被安乐死;PBS和对照T细胞组小鼠分别在（19±3）和（20±1）d 全部死亡。结论：成功设计了表达CD19 和CD20 的双靶点CAR分子后成功制备了BiCAR-T 细胞,该细胞能够有效杀伤表达CD19 和/或CD20 的B淋巴细胞肿瘤细胞,与靶细胞共同孵育后能够分泌大量IFN-γ,对B-NSG免疫缺陷小鼠白血病模型具有明显的治疗效果。     

嵌合抗原受体修饰的NK-92MI细胞对 HER2 阳性乳腺癌细胞的杀伤

目的:探讨用特异性靶向HER2抗原的嵌合抗原受体(HER2-CAR)修饰的NK-92MI细胞对HER2阳性乳腺癌细胞的杀伤效率.方法:通过PCR获得HER2-CAR片段,运用常规分子克隆技术,将其构建到慢病毒载体上,利用包装的慢病毒颗粒对NK-92MI细胞进行转染;应用流式细胞术检测细胞转染效率以及转染前后NK-92MI的IFN-γ和颗粒酶分泌差异;使用7-AAD和流式细胞术体外检测HER2-CAR-NK92MI细胞对乳腺癌细胞的杀伤效率;构建小鼠乳腺癌原位肿瘤模型进行体内细胞毒性的检测.结果:用HER2-CAR修饰的NK-92MI细胞对HER2阳性乳腺癌肿瘤细胞MCF-7和T47D的杀伤效率明显高于未被基因修饰的NK-92MI细胞[分别为(62.4±1.3)％ vs (22.1±1.2)％和(50.0±1.9)％vs(16.9±0.6)％,P＜0.01];而两者对HER2阴性的乳腺癌细胞MDA-MB-468的杀伤效率没有明显差异[(13.6±1.4)％vs(12.7±0.8)％,P＞0.05].同时,经HER2-CAR修饰的NK-92MI细胞相比未被基因修饰的NK-92MI细胞,IFN-γ的分泌明显升高(P＜0.01).结论:经HER2-CAR修饰的NK-92MI细胞对HER2阳性乳腺癌细胞的杀伤效率明显提高,且具有特异性靶向,此为治疗乳腺癌等恶性肿瘤提供了临床依据.     

不同抗原表位CART-30细胞对经典型霍奇金淋巴瘤细胞株的杀伤作用及优化研究

背景与目的 CD30-CART细胞现已应用于复发/难治性CD30阳性的经典霍奇金淋巴瘤（classical hodgkin lymphoma,cHL）患者中并取得一定疗效,但其疗效仍待进一步提高,本研究选择不同抗原表位的两种单克隆抗体Ki-4和Ber-H2,优化性构建不同CAR基因片段载体,探讨两种CART细胞对CD30阳性的cHL细胞L428的杀伤作用及其作用机制。方法 构建携带不同抗原表位的CD30-CAR基因片段的慢病毒载体,通过流式细胞检测技术比较两种不同抗原表位CART-30细胞对cHL细胞的杀伤作用,采用蛋白质免疫印迹法（western blotting,WB）分析不同抗原表位的CART-30细胞对cHL细胞NF-κB通路的调控作用。结果 成功构建了不同抗原表位的CD30-CART细胞,平均阳性率为65.7%。Ki-4组效靶比为1∶1时,杀伤效率平均值为（35.15±4.13）%(n=6);效靶比为10∶1时,杀伤效率的平均值为（66.99±4.36）%(n=6)。Ber-H2组效靶比为1∶1时,杀伤效率的平均值为（31.95±3.11）%(n=6);效靶比为10∶1时,杀...     

CD7纳米抗体衍生的CAR-T细胞对CD7阳性急性髓系白血病细胞的杀 伤活性

目的：针对CD7阳性的急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）细胞开发一种新型的CD7嵌合抗原受体修饰 的T细胞（CD7-CAR-T）,观察其对CD7阳性AML细胞的杀伤作用。方法：基于CD7纳米抗体序列、CD28和4-1BB共刺激域序 列构建CD7-CAR慢病毒载体,包装病毒颗粒并与CD7蛋白阻断剂（protein expression blocker,PEBL）慢病毒共感染人T细胞, 制 备CD7-CAR-T;应用实时无标记动态细胞分析技术（real time cellular analysis,RTCA）验证CD7-CAR-T对CD7过表达的293T细 胞的特异性杀伤能力,流式细胞术检测CD7-CAR-T对CD7高、中、低表达的AML细胞（KG-1、HEL、Kasumi-1细胞）的增殖和细 胞因子分泌的影响。结果：成功构建CD7-CAR-T 细胞并阻断其表面 CD7 的表达,与 T 细胞相比,CD7-CAR-T 细胞可以抑 制 CD7-293T 细胞的增殖并促进其分泌 TNF、Granzyme B 和 INF-γ,可显著促进 CD7 阳性的 KG-1 细胞和 HEL细胞的凋亡 （t=147.1、 P＜0.01; t=23.57、 P＜0.01）和细胞 因 子 分 泌（P＜0.05 或 P＜0.01）,而对低表达 CD7 的 Kasumi-1 细胞无显著影响 （t=0.7058、 P＞0.05）。结论： CD7-CAR-T细胞能够特异性杀伤CD7阳性的AML细胞。     

Lenti-TK介导间充质干细胞对鼻咽癌CD133+干细胞的靶向迁移及杀伤作用

目的： 观察慢病毒-胸苷激酶（lentivirus-thymidine kinase,Lenti-TK)/间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC）对鼻咽癌CD133+干细胞的靶向迁移及杀伤作用。 方法： 构建包含TK基因的重组慢病毒表达载体Lenti-TK,感染MSC后得到Lenti-TK-MSC,RT-PCR及Western blotting检测Lenti-TK-MSC中HA-TK的表达。免疫磁珠法从鼻咽癌5-8F细胞中分选CD133+细胞;Transwell小室迁移实验检测Lenti-TK-MSC对CD133+5-8F细胞的趋向性;Lenti-TK-MSC联合更昔洛韦（ganciclovir,Lenti-TK-MSC/GCV）与CD133+5-8F细胞共培养,CCK-8试剂盒检测其对细胞的杀伤作用和旁观者效应。 结果： 成功构建重组慢病毒载体Lenti-TK,其滴度为1×108UT/ml,Lenti-TK（MOI=50）感染MSC 72 h时,感染效率达（95.1±01）%。Lenti-TK-MSC迁移至CD133+5-8F细胞组的细胞数明显多于CD133-5-8F细胞组、未分选5-8F细胞组\[（83.0±8.7） vs （29.6±53）、（38.3±5.2）,P=0.000\]。Lenti-TK-MSC/GCV处理组与单独GCV处理组、Lenti-TK-MSC/GCV条件培养液（即Lenti-TK-MSC加入1 mg/L GCV培养48 h的培养上清）处理组相比,CD133+5-8F细胞的存活率明显降低\[（37.2±2.3）% vs （98.5±3.1）%、（83.8±34）%,P=0.000\]。Lenti-TK-MSC数量达到混合细胞总数（Lenti-TK-MSC和CD133+5-8F细胞)的20%时,CD133+5-8F细胞存活率为（68.2±2.3）%,表现出明显的旁观者杀伤效应。 结论： Lenti-TK感染后MSC对鼻咽癌CD133+5-8F细胞具有靶向迁移及杀伤作用。     

A novel strategy inducing autophagic cell death in Burkitt's lymphoma cells with anti-CD19-targeted liposomal rapamycin

Relapsed or refractory Burkitt''s lymphoma often has a poor prognosis in spite of intensive chemotherapy that induces apoptotic and/or necrotic death of lymphoma cells. Rapamycin (Rap) brings about autophagy, and could be another treatment. Further, anti-CD19-targeted liposomal delivery may enable Rap to kill lymphoma cells specifically. Rap was encapsulated by anionic liposome and conjugated with anti-CD19 antibody (CD19-GL-Rap) or anti-CD2 antibody (CD2-GL-Rap) as a control. A fluorescent probe Cy5.5 was also liposomized in the same way (CD19 or CD2-GL-Cy5.5) to examine the efficacy of anti-CD19-targeted liposomal delivery into CD19-positive Burkitt''s lymphoma cell line, SKW6.4. CD19-GL-Cy5.5 was more effectively uptaken into SKW6.4 cells than CD2-GL-Cy5.5 in vitro. When the cells were inoculated subcutaneously into nonobese diabetic/severe combined immunodeficiency mice, intravenously administered CD19-GL-Cy5.5 made the subcutaneous tumor fluorescent, while CD2-GL-Cy5.5 did not. Further, CD19-GL-Rap had a greater cytocidal effect on not only SKW6.4 cells but also Burkitt''s lymphoma cells derived from patients than CD2-GL-Rap in vitro. The specific toxicity of CD19-GL-Rap was cancelled by neutralizing anti-CD19 antibody. The survival period of mice treated with intravenous CD19-GL-Rap was significantly longer than that of mice treated with CD2-GL-Rap after intraperitoneal inoculation of SKW6.4 cells. Anti-CD19-targeted liposomal Rap could be a promising lymphoma cell-specific treatment inducing autophagic cell death.     

CD19和CD22双靶点CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用

目的：设计并制备一种分别靶向B细胞表面抗原CD19和CD22的CAR-T细胞,检测其对肿瘤细胞的体内外杀伤效果。方法：将含有人源化CD19 Sc Fv的二代CAR分子和带有CD3ε链作为共刺激结构域的CD22 Sc Fv CAR分子以P2A自剪切肽连接,序列连接于慢病毒载体p LTR-CMV-MCS中,以HEK-293T细胞包装相应的慢病毒载体,感染健康志愿者提供的T细胞制备CAR-19-22-T细胞,同时以相同二代结构分别构建单靶向CAR-T细胞作为参照。构建表达荧光素酶、CD19和/或CD22的前列腺癌3M细胞（靶细胞）。将各种CAR-T细胞与靶细胞共同培养,采用荧光素酶化学发光法和ELISA法检测其对靶细胞的杀伤能力和细胞因子的分泌水平。通过尾静脉注射Raji-Luc细胞构建NOD-SCID免疫缺陷小鼠白血病模型,分别注射各组CAR-T细胞进行治疗并评估其疗效。结果：培养7 d的CAR-19-22-T细胞的CAR-19表达率为13.7%,CAR-22表达率为14.3%。CAR-19-22-T细胞在10∶1效靶比时,对3M-CD19-Luc、3M-CD22-Luc和3M-CD19-...     

Monitoring of intracerebellarly-administered natural killer cells with fluorine-19 MRI

Journal of Neuro-Oncology - Medulloblastoma (MB) is the most common malignant brain tumor in children. Recent studies have shown the ability of natural killer (NK) cells to lyse MB cell lines in...     

高表达GRIM-19诱导结肠癌SW480细胞凋亡

目的：研究干扰素/维甲酸诱导死亡基因（retinoidinterferoninduced mortality,GRIM19）对结肠癌SW480细胞凋亡的影响。方法：构建GRIM19真核表达载体（pCMVFlagGRIM19）,转染入SW480细胞中,Western blotting检测GRIM19及凋亡相关蛋白Balxl的表达,采用AnnexinV/PI和线粒体膜电位JC-1染色检测SW480细胞的凋亡。结果：成功构建pCMVFlagGRIM19真核表达载体。pCMV-Flag-GRIM-19质粒转染SW480细胞后,GRIM19的表达上调,凋亡抑制蛋白Bclxl的表达则下调。转染空质粒pCMVFlag组SW480细胞凋亡率为（7.7±1.39）%,转染pCMV-Flag-GRIM-19质粒后SW480细胞凋亡率为（15.0±2.52）%（P<0.05）。线粒体膜电位检测显示转染空质粒pCMVFlag组SW480细胞膜电位降低细胞为（7.5±2.09）%,而转染pCMVFlagGRIM19后细胞线粒体膜电位降低细胞为（17.5±3.07）%（P<0.05）。结论：GRIM-19体外转染可有效诱导结肠癌SW480细胞凋亡。     

苦参碱衍生物M19对于肿瘤细胞转移的抑制作用

目的:探讨苦参碱衍生物M19对于肝细胞癌和黑色素瘤细胞转移的抑制作用。方法:肝癌细胞Hep3B、MHCC-LM3和黑色素瘤细胞B16F10经M19处理后,检测肿瘤细胞体外迁移能力。建立C57BL/6小鼠黑色素瘤B16F10和裸鼠肝细胞癌MHCC-LM3转移模型,经M19体内给药后,观察肿瘤细胞肝、肺转移情况。结果:M19能浓度依赖性地抑制肝癌细胞和黑色素瘤细胞迁移。M19体内给药使B16F10细胞在小鼠肺的转移减少,且还能抑制MHCC-LM3细胞在裸鼠肺和肝的转移。结论:M19能在体内外抑制肝细胞癌和黑色素瘤细胞的转移。     

T cell-recruiting triplebody 19-3-19 mediates serial lysis of malignant B-lymphoid cells by a single T cell

Triplebody 19-3-19, an antibody-derived protein, carries three single chain fragment variable domains in tandem in a single polypeptide chain. 19-3-19 binds CD19-bearing lymphoid cells via its two distal domains and primary T cells via its CD3-targeting central domain in an antigen-specific manner. Here, malignant B-lymphoid cell lines and primary cells from patients with B cell malignancies were used as targets in cytotoxicity tests with pre-stimulated allogeneic T cells as effectors. 19-3-19 mediated up to 95% specific lysis of CD19-positive tumor cells and, at picomolar EC₅₀ doses, had similar cytolytic potency as the clinically successful agent Blinatumomab^TM. 19-3-19 activated resting T cells from healthy unrelated donors and mediated specific lysis of both autologous and allogeneic CD19-positive cells. 19-3-19 led to the elimination of 70% of CD19-positive target cells even with resting T cells as effectors at an effector-to-target cell ratio of 1 : 10. The molecule is therefore capable of mediating serial lysis of target cells by a single T cell. These results highlight that central domains capable of engaging different immune effectors can be incorporated into the triplebody format to provide more individualized therapy tailored to a patient’s specific immune status.