青藤碱对PKC⁃α/NF⁃κB⁃p65通路的抑制作用及机制

目的：探讨过表达蛋白激酶C?α（protein kinase C?α,PKC?α）对HEK?293T细胞中核因子?κB?p65（nuclear factor?κB?p65,NF?κB?p65）磷酸化水平的影响,并检查青藤碱（sinomenine,SIN）对PKC?α/NF?κB?p65信号通路的抑制作用。方法：采用PCR技术扩增大鼠PKC?α基因蛋白质编码区（complete sequence coding,CDS）序列,将其插入到pIRES2?EGFP空载质粒中,构建野生型（wide type,WT）PKC?α过表达质粒（pIRES2?PKC?α?WT,PKC?αWT）;在PKC?αWT质粒的基础上,将PKC?α第25位丙氨酸（A）与368位赖氨酸（K）分别突变为谷氨酸（E）和精氨酸（R）,即构建持续活化（constitutively active,CA）突变型PKC?α过表达质粒（pIRES2?PKC?α?A25E,PKC?αCA）和显性负性（dominant negative,DN）突变型PKC?α过表达质粒（pIRES2?PKC?α?K368R,PKC?αDN）。本课题组前期构建的大鼠野生型NF?κB?p65过表达质粒（pIRES2?NF?κB?p65,p65WT）分别与上述各PKC?α过表达质粒共同转染HEK?293T细胞,免疫印迹法检测PKC?α、NF?κB?p65的表达及磷酸化水平。再将上述不同质粒转染HEK?293T细胞,46 h后予50 ng/mL SIN处理细胞2 h,再行免疫印迹实验分析SIN对PKC?α、NF?κB?p65磷酸化的影响。结果：菌液PCR及测序证实,上述PKC?α过表达质粒构建成功。在HEK?293T中过表达PKC?αWT或PKC?αCA可促进NF?κB?p65的磷酸化,且过表达PKC?αCA时尤为显著,而过表达PKC?αDN后NF?κB?p65的磷酸化无明显变化。SIN处理可抑制PKC?αWT、PKC?αCA和PKC?αDN转染组HEK?293T细胞中PKC?α的磷酸化,同时也能抑制过表达PKC?αWT上调的NF?κB?p65磷酸化修饰,但不影响过表达PKC?αCA和PKC?αDN对NF?κB?p65的磷酸化作用。结论：过表达PKC?α可促进HEK?293T细胞中NF?κB?p65的磷酸化,SIN处理HEK?293T细胞后可通过抑制PKC?α的磷酸化下调NF?κB?p65的磷酸化修饰。     

Chk2敲除可通过增强抗氧化能力改善由Bmi⁃1缺失所致的小鼠脑衰老表型

目的：探索细胞周期检测点激酶2（cell?cycle checkpoint kinase 2,Chk2）敲除是否能改善由B淋巴瘤Mo?MLV插入区1（B cell?specific MLV integration site?1,Bmi?1）缺失所致的小鼠脑衰老表型。方法：取2月龄Bmi?1基因敲除（Bmi?1-/-）小鼠、Chk2基因敲除（Chk2-/-）小鼠、Bmi?1和Chk2双敲（Bmi?1-/-Chk2-/-）小鼠以及同窝野生型（wild type,WT）小鼠脑组织,通过免疫组织化学染色检测不同组小鼠脑组织皮层、海马、下丘脑中NeuN、GFAP、Iba1、p16等指标的变化,通过Western blot检测不同组小鼠脑皮质中p16、SOD1、SOD2蛋白表达量的差异。结果：与同窝WT小鼠相比,Bmi?1?/?小鼠在上述脑区中NeuN、Iba1阳性细胞百分率明显减少,GFAP与p16的阳性细胞百分率明显增加,SOD1、SOD2蛋白表达量明显降低,p16蛋白表达量明显上升,而在Chk2-/-小鼠中NeuN、Iba1阳性细胞百分率则增加,GFAP与p16的阳性细胞百分率明显减少,SOD1、SOD2蛋白表达量明显上调,p16蛋白表达量明显下降;与Bmi?1-/-小鼠相比,Bmi?1-/-Chk2-/-小鼠在上述脑区中NeuN、Iba1阳性细胞百分率明显增加,GFAP与p16的阳性细胞百分率明显减少,SOD1和SOD2蛋白表达量明显上升,p16蛋白表达量明显下降。结论：Chk2敲除可通过增强抗氧化能力,从而改善由Bmi?1缺失所致的小鼠脑衰老表型。     

Pellino1 SUMO修饰位点突变对TRAF6介导的NF⁃κB信号转导的影响

目的：研究Pellino1蛋白翻译后修饰——小泛素相关修饰物（small ubiquitin?related modifier,SUMO）修饰对肿瘤坏死因子受体相关分子?6（TNF receptor associated factor 6,TRAF6）介导的核因子κB（nuclear factor κB,NF?κB）信号转导的影响。方法：构建Pellino1 SUMO修饰位点突变的质粒,与TRAF6、泛素（ubiquitin,Ub）质粒共转染至HEK?293细胞中,荧光显微镜观察转染效率,免疫共沉淀的方法检测突变型Pellino1与TRAF6的相互结合作用;同时,检测Pellino1和TRAF6的泛素化修饰水平。采用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导炎症反应,分提胞浆胞核蛋白,Western blot检测核因子κB的抑制蛋白α（inhibitor of NF?κBα,IκBα）的磷酸化和NF?κB P65的核转位,分析Pellino1蛋白SUMO修饰突变对TRAF6介导的NF?κB信号通路的影响。结果：与野生型Pellino1相比,SUMO修饰突变型Pellino1不仅增加Pellino1的自身泛素化修饰水平,而且可增加其与TRAF6的相互结合作用,并增强TRAF6的泛素化修饰;LPS刺激可增加IκBα的磷酸化和NF?κB P65的核转位,转染使Pellino1 SUMO修饰突变高表达可明显增强LPS诱导的NF?κB信号激活。结论：Pellino1 SUMO修饰突变,可通过增加Pellino1的自身泛素化修饰及其与TRAF6的结合,增强TRAF6的泛素化,最终促进TRAF6介导的NF?κB信号通路的激活。     

兰索拉唑致皮肤炎症的机制研究

目的：通过体内实验和体外实验探索兰索拉唑诱发皮肤炎症的可能机制。方法：体内实验,小鼠连续灌胃给药6个月,通过HE染色和免疫组化评价小鼠皮肤组织损伤情况;体外实验,通过CCK?8测定10~200 μmol/L兰索拉唑孵育24 h和48 h后人永生化角质形成细胞（HaCaT）活力的变化,并用10、20、40 μmol/L的兰索拉唑分别孵育HaCaT 24 h、48 h,Western blot检测HaCaT中磷酸化核因子（NF）?κB蛋白（phospho?NF?κB p65,P?p65）的表达水平,同时检测细胞炎症因子白介素（interleukin,IL）?6、IL?1β的蛋白表达量。此外,兰索拉唑及NF?κB通路抑制剂吡咯烷二硫代甲酸铵（pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC）单独或联合孵育HaCaT 24 h、48 h后,检测HaCaT中P?p65、IL?6和IL?1β蛋白的表达情况。结果：体内实验结果显示,兰索拉唑可造成小鼠皮肤损伤;体外实验发现,兰索拉唑可降低细胞活力,增加P?p65蛋白的表达,介导NF?κB通路激活,进一步刺激炎症因子IL?6和IL?1β的表达。PDTC可抑制兰索拉唑介导的NF?κB通路的激活,减少炎症因子的表达。结论：兰索拉唑可以促进炎症因子表达继而诱发皮肤损伤,其机制可能与NF?κB信号通路的激活有关。     

CDDO⁃Me对缺氧诱导的肺动脉外膜成纤维细胞活化的影响

目的：探索甲基巴多索隆（bardoxolone methyl,CDDO?Me）对缺氧诱导的人肺动脉外膜成纤维细胞（pulmonary artery adventitia fibroblast,PAAF）活化的影响及其相关机制。方法：体外培养人PAAF,随机分为常氧组（21%O2）、缺氧组（1%O2）、缺氧+ CDDO?Me组和常氧+CDDO?Me组。采用CCK?8法检测细胞活力;Transwell实验检测细胞迁移;DCFH?DA荧光探针检测细胞活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,ELISA试剂盒检测细胞内谷胱甘肽（glutathione,GSH）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）含量以及细胞上清液中转化生长因子（transforming growth factor,TGF）?β1、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）?α、白细胞介素（interleukin,IL）?1β表达水平;免疫荧光法观察细胞内α?平滑肌肌动蛋白（α?smooth muscle actin,α?SMA）表达以及核因子κB（nuclear factor kappa?B,NF?κB）p65核转位情况;Western blot检测细胞内α?SMA、Ⅰ型胶原蛋白、波形蛋白表达以及Smad3、p65磷酸化水平。结果：CDDO?Me（62.5、125.0、250.0、500.0 nmol/L）可以浓度依赖性地降低缺氧诱导的PAAF细胞活力的升高,并在250.0 nmol/L和500.0 nmol/L时具有显著抑制作用。CDDO?Me（500.0 nmol/L）可以抑制缺氧诱导的PAAF迁移以及肌成纤维细胞转化,恢复细胞形态,抑制缺氧诱导的PAAF中α?SMA、Ⅰ型胶原蛋白和波形蛋白表达水平的升高。在缺氧条件下,CDDO?Me（500.0 nmol/L）显著降低PAAF中ROS和MDA水平,升高GSH和SOD含量,提高细胞抗氧化应激能力。CDDO?Me（500.0 nmol/L）可以抑制缺氧诱导的PAAF中细胞因子TGF?β1的分泌,抑制TGF?β1/Smad3信号通路的激活。此外,CDDO?Me（500.0 nmol/L）还可以抑制缺氧诱导的PAAF中NF?κB（p65）的核转位及其磷酸化,并抑制其下游炎症因子TNF?α和IL?1β的表达。结论：CDDO?Me可以抑制缺氧诱导的PAAF增殖、迁移以及向肌成纤维细胞转化,提高PAAF抗氧化应激能力,并抑制TGF?β1/Smad3信号通路和NF?κB信号通路。     

TLR/NF⁃κB信号通路在甲基苯丙胺诱导的原代小胶质细胞炎性反应中的作用

目的：探讨Toll样受体（Toll like receptor,TLR）/核因子（nuclear factor,NF）?κB信号通路在甲基苯丙胺（methamphetamine,METH）引起原代小胶质细胞激活及炎性因子释放的作用。方法：分离培养原代小胶质细胞,免疫荧光法鉴定原代小胶质细胞纯度。细胞予METH（300 μmol/L）染毒0 min、15 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h和24 h,蛋白免疫印迹检测原代小胶质细胞的激活情况及其NF?κB通路激活情况,real?time PCR检测炎性因子［肿瘤坏死因子?α（tumor necrosis factor? α,TNF?α）、白介素?1β（interleukin?1β,IL?1β）、白介素?6（interleukin?6,IL?6）］和TLR1~9、11 mRNA的表达。结果：分离出的原代小胶质细胞纯度达到95%以上。METH暴露后原代小胶质细胞激活,其激活标志物IBA?1水平增高,NF?κB通路被激活,炎性因子（TNF?α、IL?1β、IL?6）和TLR2、4~5、7~9、11的mRNA水平明显升高,TLR1的mRNA水平明显降低,差异具有统计学意义（P < 0.05）。结论：METH可通过调节TLR/NF?κB信号通路激活原代小胶质细胞并促进其释放炎性因子,因而TLR可作为METH神经炎性反应干预的潜在靶点,具有一定的治疗意义。     

TNF⁃α预处理MC3T3⁃E1细胞后上调N⁃cadherin并影响骨髓血液生成

目的：研究肿瘤环死因子α（tumor necrosis factor α,TNF?α）处理小鼠前成骨细胞株MC3T3?E1对其血液生成能力的影响及可能机制。方法：Western blot方法检测TNF?α处理MC3T3?E1细胞后,N?cadherin、p?Erk1/2和p?Akt的表达水平;将TNF?α预处理的MC3T3?E1细胞作为饲养层细胞,联合造血生长因子SCF、TPO和Flt3?配体,体外扩增分选的小鼠Sca?1（+）细胞7 d后,检测粒?单系集落形成单位（CFU?GM）、红系形成单位（BFU?E）和前B淋系形成单位（CFU?pre?B）。并检测Erk抑制剂FR180204对MC3T3?E1细胞N?cadherin和p?Erk水平的影响。结果：MC3T3?E1细胞经TNF?α预处理后,N?cadherin和p?Erk的表达上调,p?Akt没有明显变化。饲养层细胞联合造血生长因子体外扩增Sca?1（+）细胞7 d,与对照组比较,TNF?α预处理组中的总CFU、BFU?E及CFU?GM数目下降（P < 0.05）,但CFU?pre?B数目明显升高（P < 0.05）。Erk抑制剂FR180204处理MC3T3?E1细胞可下调Erk的同时上调N?cadherin水平。结论：TNF?α可能通过影响骨髓微环境中造血支持细胞而间接影响血液生成和造血干细胞向各系列的分化;调节成骨细胞Erk1/2的磷酸化和N?cadherin的表达,可能是TNF?α影响骨髓血液生成的机制之一。     

NF⁃κB p65调控IRF⁃8基因启动子活性及其启动子结合元件的初步鉴定

目的：探讨大鼠核因子?κB（nuclear factor?κB,NF?κB）p65亚基在细胞内过表达和其活性变化对干扰素调节因子?8（interferon regulatory factor?8,IRF?8）基因启动的影响,并初步筛查IRF?8启动子上可能的p65结合元件。方法：采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术扩增大鼠p65基因蛋白编码区（complete sequence coding,CDS）序列,将其插入到空载pIRES2?EGFP质粒中,构建大鼠野生型（wild type,WT）p65过表达质粒（pIRES2?p65 WT）。在此基础上,将p65第535位丝氨酸（serine,S）突变为天冬氨酸（aspartic,D）或丙氨酸（alanine,A）,分别构建p65持续活化突变型质粒（pIRES2?p65 S535D）和p65显性负性突变型质粒（pIRES2?p65 S535A）。之后应用生物信息学软件预测IRF?8基因启动子区p65的结合元件,并据此构建IRF?8启动子全长（full?length,FL）和3个截短的荧光素酶报告质粒,即pGL3?IRF?8?FL（-1 892 ~ +174 nt）、pGL3?IRF?8?1（-1 360 ~ +174 nt）、pGL3?IRF?8?2（-752 ~ +174 nt）和pGL3?IRF?8?3（-68 ~ +174 nt）。将上述质粒行不同组合共转染人胚肾293T（human embryonic kidney 293T,HEK?293T）细胞,Western blot和荧光素酶实验分别检查p65的表达和IRF?8的启动子活性,并分析IRF?8启动子区可能的p65结合元件。结果：菌液PCR及测序证实上述质粒构建成功。分别将pIRES2?p65 WT、pIRES2?p65 S535D、pIRES2?p65 S535A和pGL3?IRF?8?FL共转染HEK?293T,发现过表达pIRES2?p65 WT或pIRES2?p65 S535D均可明显增加IRF?8启动子活性,且以pIRES2?p65 S535D更为显著;而过表达pIRES2?p65 S535A后,IRF?8启动子活性无明显变化。将pGL3?IRF?8?FL、pGL3?IRF?8?1~3和pIRES2?p65 S535D共转染HEK?293T后发现,pGL3?IRF?8?3的启动子活性显著低于pGL3?IRF?8?FL、pGL3?IRF?8?1和pGL3?IRF?8?2,提示大鼠IRF?8启动子-752~68 nt区域可能存在p65结合元件。结论：在HEK?293T细胞内过表达野生型或持续活化突变型p65可显著促进IRF?8基因的启动,且p65与IRF?8启动子的结合元件可能位于-752~-68 nt部位。     

乌司他丁对宫内窘迫致胎鼠急性肺损伤的影响

目的：探讨乌司他丁对宫内窘迫致胎鼠急性肺损伤的影响,以期为临床上治疗宫内窘迫致新生儿呼吸窘迫综合征提供新的治疗方案。方法：健康孕20 d的SD大鼠16只,采用随机数字表法分为4组,每只孕大鼠取5只活胎鼠（n=20）,分为对照组（C组）、乌司他丁对照组（S组）、宫内窘迫组（A组）、乌司他丁治疗组（U组）。C组与S组为假手术组,A组和U组建立宫内窘迫模型,S组和U组在手术前30 min经孕大鼠股静脉注射乌司他丁50 000 U/kg。取胎鼠收集外周血行血气分析,测定胎鼠肺湿/干质量比值（W/D）,HE染色观察胎鼠肺组织病理改变;Western blot方法测定肺组织NF?κB p65蛋白表达水平;ELISA方法测定肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）?α及白细胞介素（interleukin,IL）?6含量。结果：C组与S组胎鼠血气分析、W/D值、肺组织形态、NF?κB p65蛋白表达水平、TNF?α及IL?6含量差异均无统计学意义（P > 0.05）;与C组相比,A组CO2分压（PCO2）、乳酸（Lac）含量明显增高,pH、氧分压（PO2）降低,W/D值增大,NF?κB p65蛋白表达水平增高,TNF?α及IL?6含量增多（P＜0.05）,肺组织明显水肿充血;与A组相比,U组PCO2、Lac含量明显降低,pH、PO2增高,W/D值、NF?κB p65蛋白表达水平、TNF?α及IL?6含量降低（P＜0.05）,肺组织水肿充血情况明显好转。结论：乌司他丁可降低胎鼠肺组织中NF?κB的细胞信号转导,减少TNF?α和IL?6等炎症因子的合成,抑制炎症反应,提高胎鼠血氧分压,减轻宫内窘迫造成的胎鼠急性肺损伤。     

IL⁃17A对小鼠实验性牙周炎骨破坏作用研究

目的：通过构建白介素?17A（interleukin?17A,IL?17A）基因敲除小鼠实验性牙周炎模型,初探IL?17A参与调控牙周炎骨破坏的机制。方法：选用雄性IL?17A基因敲除（knock out,KO）的C57BL/6小鼠和相同基因背景的野生型（wild type,WT）C57BL/6小鼠,通过结扎和喂菌诱导小鼠实验性牙周炎,WT小鼠及KO小鼠均分为正常对照组和牙周炎组。确认结扎4周后处死小鼠收集上颌骨,进行Micro?CT断层成像、HE染色、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate?resistant acid phosphatase,TRAP）染色、免疫组化和组织病理学分析。结果：在喂菌和结扎诱导的小鼠实验性牙周炎模型中,在Micro?CT的三维重建及近远中向截面上,KO小鼠较WT小鼠牙槽骨吸收减少,KO小鼠上颌第二磨牙牙槽嵴顶到釉牙骨质界的近中线性距离为（0.51 ± 0.11）mm,远中为（0.45 ± 0.04）mm,显著低于WT小鼠的近中（0.61 ± 0.09）mm和远中（0.65 ± 0.08）mm（P < 0.05）;KO小鼠骨体积分数比为41.88 ± 1.82,显著高于WT小鼠的36.55 ± 2.08（P < 0.05）;KO小鼠骨密度为84.39 ± 2.11,显著高于WT小鼠的76.90 ± 2.55（P < 0.05）;HE染色中可见牙槽骨吸收减少;TRAP染色中可见TRAP染色阳性细胞减少;免疫组化结果显示牙周组织核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor κB ligand,RANKL）的表达降低。结论：牙周炎中IL?17A可能有促进牙周炎发生发展及促进牙槽骨吸收的作用。     

α硫辛酸后处理对脓毒症大鼠急性肾损伤的影响及机制

目的：探讨α硫辛酸（ALA）后处理对脓毒症大鼠急性肾损伤的影响及其可能机制。方法32只雄性SD大鼠随机分成4组：正常对照组（A组）、ALA后处理对照组（B组）、脓毒症组（C组）和脓毒症联合ALA后处理组（D组）。A、B 2组均行假手术,C、D 2组行盲肠结扎穿孔术（CLP）复制脓毒症模型。B、D 2组大鼠术后立即给予ALA 200 mg/kg灌胃。24 h后检测大鼠血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）、肿瘤坏死因子α（TNF?α）、白细胞介素6（IL?6?）及白细胞介素1β（IL?1β）水平,肾组织行PAS染色观察病理学改变,免疫印迹法测定NF?κB相关蛋白表达。结果脓毒症可以诱发肾脏病理学改变,与A组相比,C组SCr和BUN含量分别增加了178%和66%（P<0.01）,TNF?α、IL?6及IL?1β水平分别增加55%、114%和110%（P<0.01）;同时NF?κB p65的磷酸化水平（144%）和细胞核内的表达（102%）显著增加（P<0.01）,并IκBα的表达下降61%（P<0.01）。早期给予ALA可以明显改善上述变化,与C组相比,D组SCr和BUN含量分别下降了48%和26%（P<0.05）,TNF?α、IL?6及IL?1β水平分别降低25%、37%和40%（P<0.05）;同时NF?κB p65的磷酸化水平和细胞核内的表达显著减少41%和49%（P<0.05）,IκBα的相对表达水平增加103%（P<0.05）。结论 ALA抑制NF?κB的活化,从而改善脓毒症相关急性肾损伤。     

丹参酮ⅡA磺酸钠对LPS引起的HUVEC功能异常和凋亡调控作用的研究

目的：研究丹参酮ⅡA磺酸钠（sodium tanshinone ⅡA sulphonate,STS）对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）引起的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）功能异常和凋亡的调控作用。方法：将第6~8代处于对数生长期的HUVEC按如下分组给予处理：DMEM组、LPS（1.0 μg/mL）处理组、高浓度（50.0 μg/mL）STS预处理组、中浓度（25.0 μg/mL）STS预处理组和低浓度（12.5 μg/mL）STS预处理组。其中,各STS预处理组均先以对应浓度的STS预处理HUVEC 2 h,再加入1 μg/mL LPS进行刺激。处理24 h后,CCK?8 法测定细胞活力;流式细胞术检测细胞增殖;ELISA 法检测细胞培养上清中炎症因子白介素1β（interleukin?1β,IL?1β）的蛋白浓度;Western blot法检测细胞裂解液中IL?1β和凋亡相关分子cleaved caspase?9和cleaved caspase?3的表达,以及细胞核蛋白中核因子κB?p65（nuclear factor?κB?p65,NF?κB?p65）的水平。此外,划痕实验检测HUVEC的迁移能力;光镜观察细胞形态变化;DAPI染色显示细胞核染色质的改变;Annexin V/PI双染法检测HUVEC的凋亡情况。结果：与DMEM相比,LPS处理导致HUVEC活力和迁移能力减低,但促进其增殖;IL?1β和NF?κB p65蛋白水平升高;cleaved caspase?3和cleaved caspase?9表达增高并伴有凋亡水平提高（P＜0.05）。STS预处理能够以浓度依赖的方式部分或完全逆转LPS引起的上述现象（P＜0.05）。结论：STS能够通过浓度依赖的方式抑制LPS引起的HUVEC功能异常和凋亡,对血管内皮起到保护作用。     

IL⁃1β和TNF⁃α通过骨髓MSCs降低多西环素对骨髓瘤细胞株H929的细胞毒性作用

目的：骨髓来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）在骨髓微环境中参与骨髓瘤细胞的耐药性。本研究旨在通过体外实验,研究经细胞因子预处理的骨髓MSCs在与人骨髓瘤细胞株H929共培养条件下,是否影响多西环素（doxycycline,DOX）对骨髓瘤细胞株的细胞毒性作用,并初步探讨其可能的作用机制。方法：经白细胞介素（interleudin,IL）?1β或肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）?ɑ预处理的人骨髓MSCs,与H929细胞共培养,并以DOX处理细胞,分别采用CCK8法和流式细胞术（FCM）,检测DOX对H929细胞增殖和凋亡的影响;采用FCM和实时荧光定量PCR（RT?qPCR）法检测IL?1β或TNF?α处理后,骨髓MSCs中血管细胞黏附分子（VCAM?1）表达;Western blot法检测在DOX存在时,不同处理的骨髓MSCs作为共培养饲养层细胞的条件下,H929细胞p?Erk1/2的变化。结果：DOX可抑制骨髓瘤细胞株H929的增殖并诱导其凋亡。人骨髓MSCs与H929共培养可以减少DOX对H929的细胞毒性作用,而经IL?1β或TNF?α预处理的人骨髓MSCs再与H929共培养,则可以进一步降低DOX的细胞毒性作用。人骨髓MSCs经IL?1β或TNF?α处理后,其VCAM?1 mRNA转录水平和蛋白表达水平均升高。经预处理的骨髓MSCs与H929共培养后,可以降低DOX对骨髓瘤细胞株p?Erk1/2的下调作用。结论：DOX在体外对骨髓瘤细胞株表现出剂量和时间依赖性的细胞毒性作用;而IL?1β和TNF?α可通过骨髓MSCs来间接拮抗DOX对H929的细胞毒性作用;IL?1β和TNF?α的这一作用机制可能与上调骨髓MSCs的VCAM?1表达与上调p?Erk1/2有关。     

TIR/BB环拟似物AS⁃1对小鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用研究

目的：研究TIR/BB环拟似物AS?1对小鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制。方法：雄性C57BL/6小鼠随机分成4组：假手术组(sham)、肾缺血再灌注组(RIR)、AS?1+肾缺血再灌注组(AS?1+RIR)、溶剂+肾缺血再灌注组(溶剂+RIR)。采用夹闭双侧肾动、静脉45 min，再灌注24 h的方法构建肾缺血再灌注损伤模型。AS?1+RIR组与溶剂+RIR组在术前30 min按剂量50 mg/kg 分别腹腔注射AS?1和溶剂，再灌注24 h后检测肾功能参数、血清炎症因子、凋亡指标及磷酸化NF?κB p65(p? p65)表达水平。结果：与假手术组比较，缺血再灌注组血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、TNF?α、IL?6、p?p65、Cleaved caspase3及 Bax的表达水平均明显提高(P ＜ 0.01)，肾间质CD68+ 和MPO炎症细胞浸润增多，Bcl?2的表达量明显降低(P ＜ 0.01)，Bcl?2/Bax 的比值也降低。给予AS?1处理后可以使Scr、BUN、TNF?α、IL?6、p?p65、Cleaved caspase3、及Bax的水平明显降低(P＜0.01)， CD68+ 和MPO炎症细胞浸润减少；Bcl?2的表达量升高(P ＜ 0.01)，Bcl?2/Bax的比值也升高。结论：TIR/BB环拟似物AS?1对小鼠肾缺血再灌注损伤有保护作用，其机制可能与其抑制NF?κB信号通路的活化，产生抗炎作用和抗凋亡作用有关。     

NF-κB/IκB信号通路介导血管紧张素Ⅱ诱导的系膜细胞促炎性细胞因子表达

目的：探讨核因子—κB(NF—κB)／IκB信号通路在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的肾小球系膜细胞促炎性细胞因子表达中的作用。方法：应用核酸酶保护法检测系膜细胞肿瘤坏死因子α(TNF—α)、IL-1α和IL-1β mRNA表达；应用凝胶电泳迁移率和Western blot检测肾小球系膜细胞中NF—κB活化、p65亚基核转位以及IκBα和IκBβ的降解。结果：正常培养状态下，系膜细胞可组成型表达TNF—α和IL—1β，而不表达IL-1αmRNA，AngⅡ刺激后促炎性细胞因子表达显著上调，NF—κB特异性抑制剂2-硫代氨基甲酸吡咯烷显著抑制AngⅡ诱导的促炎性细胞因子基因表达；AngⅡ诱导系膜细胞NF—κB活化，p65核转位及胞质内IκBα和IκBα的降解。结论：AngⅡ诱导肾小球系膜细胞中促炎性细胞因子表达可能通过NF—κB／IκB信号转导通路来实现。     

活性维生素D3对脓毒血症小鼠急性肝损伤的保护作用及机制

目的：探讨活性维生素D3（vitamin D3,Vit D3）对内毒素（lipopolysaccharide,LPS）诱导小鼠急性肝损伤的保护作用及机制。方法：将40只雄性C57BL/6小鼠随机分成4组：对照组、Vit D3组、模型组（LPS组）和治疗组（LPS+ Vit D3组）,每组10只。模型组和治疗组给予15 mg/kg LPS腹腔注射建立脓毒血症小鼠急性肝损伤模型。Vit D3组和治疗组小鼠在注射LPS后即刻（0 h）、8 h、16 h,给予Vit D3（2.5 μg/kg）灌胃,对照组和模型组给予等体积生理盐水灌胃。24 h后水合氯醛麻醉处死小鼠,收集小鼠的血液和肝脏用于后续实验。结果：与模型组比较,Vit D3可降低血清和肝脏丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）水平,提高肝组织抗氧化酶活性,减轻肝脏病理改变。与模型组相比,Vit D3降低了血清中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor?α,TNF?α）和白细胞介素?1（interleukin?1,IL?1）的水平。此外,与模型组相比,Vit D3下调了肝组织中IL?1β、TNF?α、NF?κB p65 和 NF?κB p50的表达,上调了肝组织中核因子E2相关因子2（nuclear factor?erythroid 2p45?relatec factor 2,Nrf2）、血红素加氧酶?1（heme oxygenase?1,HO?1）和维生素D受体（vitamin D receptor,VDR）的表达。结论：Vit D3对LPS诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用,这一效果可能部分是VDR通路抑制氧化应激和炎症所致。     

抑制巨噬细胞产生促炎性因子对异位内膜孕酮反应的影响

目的：探讨抑制巨噬细胞产生促炎性细胞因子对子宫内膜异位症孕酮拮抗的影响。方法：原代培养15例异位子宫内膜基质细胞（endometrial stromal cells,ESCs）,趋化实验检测异位ESCs表达的趋化因子配体12（CXCL12）对巨噬细胞的趋化能力。脂质体法介导核因子（nuclear factor,NF）?κB诱捕寡核苷酸（oligonucleotide,ODNs）转染巨噬细胞后再用100 ng/mL脂多糖刺激培养巨噬细胞,电泳迁移率分析（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）法检测脂多糖刺激条件下巨噬细胞中NF?κB的活化水平,ELISA检测巨噬细胞白介素?1β（interleukin?1β,IL?1β）和肿瘤坏死因子?α（tumor necrosis factor α,TNF?α）表达水平的变化。建立异位ESCs和巨噬细胞的共培养系统,检测通过NF?κB诱捕ODNs抑制巨噬细胞表达促炎性细胞因子对异位ESCs蜕膜化的影响。结果：异位ESCs分泌的CXCL12对巨噬细胞具有趋化作用。NF?κB诱捕ODNs能显著抑制脂多糖诱导的巨噬细胞表达促炎性细胞因子。在巨噬细胞和异位ESCs的共培养系统中,NF?κB诱捕ODNs能通过抑制巨噬细胞产生促炎性因子提高异位ESCs对孕酮的反应。结论：通过NF?κB诱捕ODNs抑制巨噬细胞产生促炎性细胞因子有可能是减轻内异症炎症反应和改善孕酮抵抗的一种方法。     

白藜芦醇对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞NO和炎性因子生成的调控

目的探讨白藜芦醇（Res）对内毒素（LPS）诱导小鼠腹腔巨噬细胞核因子-κB（NF—κB）活化及炎性细胞因子（TNF—α、IL—1β、IL-6）基因表达的调节，为Res的临床运用提供理论依据。方法分别用LPS或Res＋LPS处理体外培养的小鼠巨噬细胞，采用电子顺磁共振（EPR）自旋捕集技术直接检测巨噬细胞产生的NO，电泳迁移率改变分析法（EMSA）检测细胞中NF—κB活性，逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）和酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞中TNF—α、IL—1β、IL-6 mRNA和蛋白的表达。结果表明LPS组NO含量、NF—κB活性和TNF—α、IL-1β、IL-6含量在刺激后2—12h明显高于正常对照组（P〈0．01），而Res＋LPS组NO含量、NF—κB活性和TNF—α、IL-1β、IL-6含量均显著低于LPS组（P〈0．01）。结论提示LPS可诱导巨噬细胞NF—KB活化，导致TNF-α、IL-1β、IL-6基因表达增强，而Res能抑制NF—κB活化而调节TNF—α、IL-1β、IL-6基因的表达。     

原花青素对LPS/ATP诱导的NLRP3炎症小体激活及NF⁃κBp65磷酸化的抑制作用

目的：研究原花青素对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）与腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate,ATP）联合诱导的小鼠小胶质细胞BV2 NOD样受体蛋白3（nucleotide?binding oligomerization domain?like receptor protein 3,NLRP3）炎症小体激活及核因子（nuclear factor,NF）?κBp65磷酸化的抑制作用。方法：以1.0 μg/mL LPS、2.5 μmol/L ATP诱导BV2细胞炎症损伤模型,用不同浓度原花青素（0.1、1.0、2.5、5.0 μg/mL）干预细胞。采用噻唑蓝（thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT）法检测细胞存活率;比色法检测一氧化氮（nitric oxide,NO）释放水平;微量酶标法测乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）活力;ELISA法检测白细胞介素（interleukin,IL）?1β、IL?18的分泌水平;Western blot法检测NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis?associated speck?like protein containing a CARD,ASC）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）?1、pro?caspase?1、p?NF?κBp65、NF?κBp65蛋白表达水平。结果：不同浓度的原花青素对BV2细胞存活率的影响与对照组相比差异无统计学意义（P > 0.05）。与对照组相比,LPS/ATP诱导可增加BV2细胞NO、IL?1β、IL?18水平以及LDH活力（P < 0.05）,增加NLRP3、ASC、pro?caspase?1、caspase?1、     

人支气管上皮细胞表达的斯钙素⁃1在上皮间充质转化中的作用研究

目的：明确斯钙素?1（stanniocalcin?1,STC1）对支气管上皮间充质转化（epithelial?mesenchymal transition,EMT）的影响,以及香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract,CSE）对支气管上皮细胞STC1表达调控的效应,探讨STC1在慢性阻塞性肺疾病气道EMT中的可能作用。方法：采用转化生长因子β（transforming growth factor β,TGF?β）处理人支气管上皮（16HBE）细胞72 h诱导EMT模型：外源加入STC1重组蛋白（rhSTC1）,Western blot及免疫荧光法检测EMT标志物E?钙黏蛋白（E?cadherin）和α?平滑肌动蛋白（α?SMA）表达。采用CSE刺激16HBE细胞24 h：实时定量PCR及Western blot检测STC1 mRNA和蛋白表达差异,外源加入NF?κB抑制剂JSH23,Western blot检测STC1表达差异。结果：TGF?β可诱导16HBE细胞由典型的多边铺路石样变为长梭形,上皮细胞标志物E?cadherin表达下降,间质细胞标志物α?SMA表达增加,rhSTC1可逆转上述改变。CSE可刺激16HBE细胞STC1表达增高,且呈浓度依赖性增加,外源加入NF?κB抑制剂JSH23可抑制上述效应。结论：STC1在慢性阻塞性肺疾病形成过程中,是抑制气道EMT的保护性因素。CSE局部刺激支气管上皮细胞,通过NF?κB信号导致STC1反应性增加可能是其主要来源之一。