α-硫辛酸对蓝光诱导损伤的ARPE-19细胞的保护作用

目的 研究α-硫辛酸(ALA)对蓝光诱导损伤的ARPE-19细胞的保护作用。方法 体外培养ARPE-19细胞,随机分为正常组(N组)、药物组(D组)、光照组(L组)、药物+光照组(D+L组)。倒置显微镜下观察ARPE-19细胞形态结构。CCK-8法检测各组ARPE-19细胞活性;流式细胞仪(Annexin V/PI双染色法)检测ARPE-19细胞凋亡率;倒置荧光显微镜检测ARPE-19细胞ROS水平;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测ARPE-19细胞核因子E2相关因子2(Nrf2)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)、NAD(P)H醌氧化还原酶1(NQO1)、血红素氧合酶-1(HO-1) mRNA表达水平;Western blot检测ARPE-19细胞天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、Nrf2、NQO1蛋白表达水平。结果 N组及D组细胞均呈贴壁生长,分布均匀,形态清晰,细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05)。与N组相比,L组细胞皱缩、变小、变圆,失去正常形态,部分细胞不能贴壁生长,细胞存活率降低,细胞凋亡率升高,ROS水平升高(均为P<0.05)...     

HXO-RB44细胞上清液对ARPE-19细胞内VEGF表达的影响

目的探讨HXO-RB44细胞上清液对人视网膜色素上皮（RPE）细胞系ARPE-19细胞内血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响及其相关机制。方法分别利用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基及MEM培养基对HXO-RB44细胞及ARPE-19细胞进行培养,在ARPE-19细胞内加入100μL HXO-RB44细胞上清液,分别干预0、4、8、12、24 h,利用RT-PCR、免疫荧光细胞化学、Western blot等方法,检测不同浓度的MLT干预后24 h ARPE-19细胞内VEGF mRNA及蛋白的表达情况。结果HXO-RB44细胞上清液加入后的不同时间点,VEGF mRNA的表达差异有统计学意义（F=195.072,P=0.000）。随着HXO-RB44细胞上清液作用时间的延长,ARPE-19细胞内VEGF mRNA表达逐渐增高（P〈0.01）。HXO-RB44细胞上清液加入后4、8、12、24 h,ARPE-19细胞内VEGF蛋白表达显著增加（F=160.687,P=0.000）,其表达与ARPE-19细胞内VEGF mRNA表达方式相同（P〈0.05）。随着HXO-RB44细胞上清液作用时间的延长,ARPE-19细胞内绿荧光蛋白强度逐渐增加。结论HXO-RB44细胞上清液能促进ARPE-19细胞内VEGF的表达。     

金雀异黄素对缺氧诱导的ARPE-19细胞中VEGF表达的影响

目的研究长期缺氧对体外培养的人ARPE-19细胞血管内皮生长因子(vascular endotheial growth factor,VEGF)表达的诱导作用,以及金雀异黄素(genistein,Gen)对其表达的影响和机理。方法使用半定量RT-PCR和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测ARPE-19细胞中VEGFmRNA和蛋白的表达,分析不同浓度Gen以及PD98059、TyrphostinA25对ARPE-19细胞缺氧24h诱导的VEGF表达的影响。结果(1)正常对照组有少量VEGF表达,缺氧24h可明显提高ARPE-19细胞VEGFmRNA和蛋白的表达,分别为(9.566±1.528)倍和(2.636±0.499)倍;(2)Gen(50μmol·L-1,100μmol·L-1,200μmol·L-1)与缺氧组对比,分别抑制缺氧组VEGFmRNA表达的55.03%、78.72%、90.69%,蛋白的表达量为(189.60±20.20)ng·L-1(117.70±21.97)ng·L-1、(49.70±13.17)ng·L-1,抑制作用呈浓度依赖性;(3)PD98059、TyrphostinA25也可抑制缺氧诱导的VEGFmRNA表达的67.24%和56.25%,蛋白表达量为(86.33±12.47)ng·L-1、(98.08±2.42)ng·L-1。结论Gen可抑制长期缺氧诱导的ARPE-19细胞VEGF表达,并可能是通过抑制p42/p44MAPK途径和HIF-1途径共同抑制VEGF的表达,提示Gen对视网膜新生血管的形成具有预防和潜在的治疗价值。     

硫辛酸烟酸二联体对丙烯醛损伤ARPE-19细胞的保护作用

目的 利用丙烯醛建立年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)的细胞损伤模型,并观察硫辛酸烟酸二联体对丙烯醛诱导ARPE-19细胞损伤的保护作用.方法 MTT比色法检测ARPE-19细胞的生长周期.将25μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1丙烯醛加入对数生长期的ARPE-19细胞中处理24 h,复制AMD细胞水平的损伤模型并确定其损伤浓度;预先加入50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、150 μmol·L-1硫辛酸烟酸二联体及150 μmol·L-1硫辛酸预处理对数生长期细胞24 h后,再加入已经确定细胞损伤模型的丙烯醛浓度处理24 h,前后两次处理后均用MTT比色法检测细胞活性,HE染色法检测细胞数量和形态改变.结果 ARPE-19细胞24 h内开始贴壁,4～5d细胞生长开始融合,第1-6天后生长分裂迅速进入对数生长期,6d后即开始随着时间延长活性显著下降.当丙烯醛浓度达到50 μmol·L-1时,ARPE-19细胞数量明显减少,细胞肿胀、坏死,胞浆收缩、细胞核聚集;而当硫辛酸烟酸二联体浓度达到100 μmol·L-1时即可以明显减少50 μmol·L-1丙烯醛诱导的ARPE-19细胞活性的降低,防止凋亡小体的形成.MTT结果显示:100 μmol·L-1硫辛酸烟酸二联体+丙烯醛处理组(50 μmol·L-1)抗凋亡效果优于100 μmol·L-1硫辛酸组,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 利用丙烯醛可以诱导ARPE-19细胞损伤来建立AMD细胞损伤的模型,硫辛酸烟酸二联体对丙烯醛诱导的ARPE-19细胞损伤具有保护作用.     

补肾养血明目方对丙烯醛致ARPE-19细胞氧化应激的干预作用

目的：利用丙烯醛建立ARPE-19细胞氧化应激模型,观察补肾养血明目方含药血清对丙烯醛诱导ARPE-19细胞氧化损伤的保护作用。
　　方法：制备SD 大鼠补肾养血明目方含药血清及空白血清,通过CCK-8检测不同浓度(2.5%,5%,10%,20%,40%)血清对细胞活性的影响,预先加入1.25%,2.5%,5%等不同浓度的含药血清处理24 h 后,将终浓度为75μmol/L的丙烯醛加入对数生长期的ARPE-19细胞中处理24h, CCK-8法检测含药血清对细胞活力的影响, DAPI染色观察细胞核形态。
　　结果：CCK-8结果示：低浓度(2.5%,5%)血清对细胞活性影响不大( P>0.05),高浓度(10%,20%,40%)血清降低细胞活性(P<0.05),补肾养血明目方含药血清中、高剂量组细胞活性较空白血清组有统计学意义(P<0.05);
　　结论：补肾养血明目方对丙烯醛诱导的ARPE-19细胞损伤有保护作用。     

金雀异黄素对缺氧诱导的人ARPE-19细胞内碱性成纤维细胞生长因子蛋白表达的影响

目的:研究低氧对体外培养的人ARPE-19细胞碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的诱导作用,以及金雀异黄素(genistein,Gen)对其表达的影响。方法:采用免疫荧光组织化学技术和激光共聚焦显微镜,以荧光比值来表示bFGF的表达,半定量分析低氧处理不同时间对体外培养的ARPE-19细胞bFGF蛋白表达的诱导作用,以及Gen对低氧诱导的bFGF表达的影响。结果:对照组有低水平bFGF蛋白的表达,随着低氧处理时间的延长,荧光比值在1h达到高峰。Gen(50,100,200μmol/L组)与二甲基亚砜(DM-SO)对照组相比,均可明显抑制低氧诱导的bFGF的表达,且这种抑制作用呈浓度依赖性。结论:Gen可抑制低氧诱导的ARPE-19细胞bFGF表达,提示Gen对视网膜新生血管的形成具有潜在的预防及治疗价值。     

金雀异黄素对缺氧诱导的人ARPE-19细胞内碱性成纤维细胞生长因子蛋白表达的影响

目的:研究低氧对体外培养的人ARPE-19细胞碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的诱导作用,以及金雀异黄素(genistein,Gen)对其表达的影响。方法:采用免疫荧光组织化学技术和激光共聚焦显微镜,以荧光比值来表示bFGF的表达,半定量分析低氧处理不同时间对体外培养的ARPE-19细胞bFGF蛋白表达的诱导作用,以及Gen对低氧诱导的bFGF表达的影响。结果:对照组有低水平bFGF蛋白的表达,随着低氧处理时间的延长,荧光比值在1h达到高峰。Gen(50,100,200μmol/L组)与二甲基亚砜(DMSO)对照组相比,均可明显抑制低氧诱导的bFGF的表达,且这种抑制作用呈浓度依赖性。结论:Gen可抑制低氧诱导的ARPE-19细胞bFGF表达,提示Gen对视网膜新生血管的形成具有潜在的预防及治疗价值。     

补肾养血明目方含药肠吸收液对ARPE-19细胞氧化损伤的保护作用

目的:探讨补肾养血明目方含药肠吸收液对氢醌(hydroquinone,HQ) 诱导的人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19) 氧化应激损伤的保护作用.方法:采用不同浓度HQ诱导体外培养ARPE-19 细胞氧化损伤,确定最佳造模浓度;制备补肾养血明目方含药肠吸收液.采用CCK-8法检测补肾养血明目方含药肠吸收液对ARPE-19细胞活力的影响,TUNEL技术观察其对细胞凋亡的保护作用,以及化学比色法检测细胞中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的活性.结果:当HQ浓度达到90滋mol/L以上时,ARPE-19 细胞活性明显降低.相较于模型组,预防给药时,浓度1%和2%补肾养血明目方含药肠吸收液对HQ损伤具有有显著保护作用(均P<0.01),0.5%和5%含药肠吸收液对HQ损伤有一定保护作用(均 P<0.05);治疗给药时,1%和2%含药肠吸收液对 HQ 损伤有一定保护作用(均 P<0郾05).与模型组相比,预防组的细胞凋亡率显著下降(P<0.01),治疗组的细胞凋亡率有一定下降(P<0.05).抗氧化酶检测结果显示与模型组相比,预防组和治疗组均能明显提高SOD和GSH-Px含量(均P<0.05),其中预防组的作用更为显著(P<0.01,P<0.05).结论:补肾养血明目方对HQ诱导的ARPE-19 细胞氧化损伤有保护作用,其作用机制可能与增加细胞内抗氧化酶的含量有关.     

槲皮素磷脂复合物激活Nrf2信号通道增强对氧化损伤ARPE-19细胞的保护作用

目的　研究槲皮素磷脂复合物对叔丁基氢过氧化物（ｔｅｒｔ-ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ,ｔ-ＢＨＰ）诱导ＡＲＰＥ-１９细胞氧化损伤的保护作用及相关机制。方法　采用溶剂法制备槲皮素磷脂复合物,并测定磷脂复合物在水和氯仿中的溶解度。实验细胞分组:溶媒对照组、模型对照组、槲皮素及其磷脂复合物组（含４００μｍｏｌ·Ｌ－１、２００μｍｏｌ·Ｌ－１和１００μｍｏｌ·Ｌ－１三个浓度）。ＭＴＴ法检测细胞活力,ＡｎｎｅｘｉｎＶ-ＦＩＴＣ／ＰＩ法检测细胞凋亡,酶标仪检测细胞内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性及丙二醛、总抗氧化能力水平,荧光素ＤＣＦＨ-ＤＡ探针法测定细胞内活性氧含量,ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ、ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测细胞核因子Ｅ２相关因子２（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｅｒｙｔｈｒｏｉｄ２-ｒｅｌａｔｅｄｆａｃｔｏｒ２,Ｎｒｆ２）、血红素加氧酶-１、醌氧化还原酶-１和谷氨酸半胱氨酸连接酶的表达水平。结果　形成磷脂复合物后槲皮素在水和氯仿中的溶解度分别为（３８．３６±２．９１）μｇ·ｍＬ－１、（１３５１．２７±２８．１２）μｇ·ｍＬ－１,较单体显著提高;浓度为４００μｍｏｌ·Ｌ－１、２００μｍｏｌ·Ｌ－１和１００μｍｏｌ·Ｌ－１的槲皮素及其磷脂复合物对氧化损伤ＡＲＰＥ-１９细胞有保护作用,而且高、中浓度的槲皮素磷脂复合物的作用优于单体;浓度为２００μｍｏｌ·Ｌ－１的槲皮素及其磷脂复合物均能降低氧化损伤ＡＲＰＥ-１９细胞的凋亡率,槲皮素磷脂复合物作用明显优于单体;槲皮素磷脂复合物能显著提高细胞内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性,降低细胞内活性氧、丙二醛水平,槲皮素单体则不能,但槲皮素及其磷脂复合物能提高细胞内总抗氧化能力;槲皮素及其磷脂复合物能诱导Ｎｒｆ２核转位,激活Ｎｒｆ２通道,上调血红素加氧酶-１、醌氧化还原酶-１和谷氨酸半胱氨酸连接酶的表达。结论　槲皮素形成磷脂复合物后,水溶性、脂溶性提高,对氧化损伤ＡＲＰＥ-１９细胞的保护作用比单体强,其作用机制与激活Ｎｒｆ２信号通路,上调下游Ⅱ相代谢酶和抗氧化酶的表达有关。     

黄芪含药血清对氯化钴诱导ARPE-19细胞缺氧损伤的保护作用

目的：研究黄芪含药血清对氯化钴(CoCl₂)诱导人视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞缺氧损伤的保护作用,从而探讨黄芪是否通过抗氧化应激来改善糖尿病视网膜病变(DR)。

方法：建立CoCl₂诱导ARPE-19细胞缺氧模型,并分为以下5组：正常组(细胞正常培养,不加任何处理)、缺氧模型组(200μmol/L CoCl₂)、空白血清组(200μmol/L CoCl₂+空白血清)、低剂量含药血清组(200μmol/L CoCl₂+10%含药血清)、高剂量含药血清组(200μmol/L CoCl₂+20%含药血清)。CCK-8检测细胞活性; 试剂盒检测细胞上清液中还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)水平; ELISA检测细胞培养基中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)的含量; 实时荧光定量PCR(qPCR)检测VEGF、HIF-1α和脯氨酰羟化酶-2(PHD-2)的mRNA水平; Western Blot法检测VEGF、HIF-1α和PHD-2的表达情况。

结果：采用200μmol/L的CoCl₂浓度可成功建立ARPE-19细胞缺氧模型。低剂量和高剂量黄芪含药血清可抑制缺氧诱导的ARPE-19细胞增殖(P<0.05),升高ARPE-19细胞缺氧损伤中GSH水平,降低MDA含量(P<0.05)。低剂量和高剂量黄芪含药血清可抑制ARPE-19细胞缺氧损伤上清液中HIF-1α和VEGF的表达(P<0.05),以及ARPE-19细胞中VEGF、HIF-1α、PHD-2的mRNA表达和蛋白表达(P<0.05)。

结论：低剂量和高剂量黄芪含药血清通过抗氧化作用减轻CoCl₂诱导ARPE-19细胞缺氧损伤。     

Induction of interleukin-8 gene expression and protein secretion by C-reactive protein in ARPE-19 cells

C-reactive protein (CRP) is an acute phase reactant and its level rises rapidly during inflammation. Recent studies have suggested the potential involvement of CRP in the pathogenesis of age-related macular degeneration (AMD). To delineate the functional roles of CRP in inflammatory response by the ocular posterior segments, the effects of CRP on ARPE-19, an immortalized human retinal pigment epithelia (hRPE) cell line, were investigated in the present study. Treatment of ARPE-19 cells with CRP resulted in enhanced NF-kB nuclear translocation and dose-dependent transient induction of IL-8 mRNA synthesis and protein secretion. Stimulated expression of VEGF, but not MCP-1 by CRP was also observed. The induced IL-8 expression was transient and peaked at 12 h post stimulation. In the presence of inhibitors for NF-kB, p38, MEK and JNK, the CRP-induced IL-8 production was abolished by 99.5 ± 2.3, 97.8 ± 2.1, 55.3 ± 2.5 and 37.3 ± 1.3%, respectively. Neutralization of Fc gamma receptors by anti-CD32 and CD64 antibodies produced 39.9 ± 1.6 and 59.5 ± 2.6% reduction, respectively, of CRP-stimulated IL-8 secretion, whereas that by anti-CD16 antibody had no effect. This study suggests that the pro-inflammatory effects of CRP in ARPE-19 cells may contribute to the inflammatory retinal diseases by induction of pro-inflammatory cytokines such as IL-8. This induction is mediated by NF-kB and multiple MAPK pathways through Fc gamma receptors.     

Antioxidant activity of naringenin on various oxidants induced damages in ARPE-19 cells and HUVEC

AIM: To evaluate the antioxidant activity of naringenin in human retinal pigment epithelium(ARPE-19) cells and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). METHODS: MTT assay was used to measure the viability and proliferation of ARPE-19 cells and HUVEC. RESULTS: Three and 10mg/L naringenin significantly increased the proliferation of ARPE-19 cells by 10.8% and 11.4%, respectively. Ten mg/L naringenin increased hypoxia-, 0.3mmol/L NaN₃^-, and 200umol/L H₂O₂ -induced damage of ARPE-19 cells by 55.2%, 69.2%, and 50.3%, respectively. One mg/L naringenin increased the viability of 50umol/L t-BHP-, and 30mg/L NaIO₃-treated ARPE-19 cells by 20.2% and 30.4% , respectively. Thirty mg/L naringenin also increased the proliferation of 50umol/L t-BHP-treated ARPE- 19 cells by 32.2%, and 1mg/L naringenin increased the proliferation of 30, 100 and 300mg/L NaIO₃-treated ARPE-19 cells by 30.3% , 10.3% and 18.5% , respectively. The reduction of HUVEC was 23.9%, 70.4% and 77.9% in the 3, 10 and 30mg/L naringenin-treated groups, respectively. Furthermore, 1 and 3mg/L naringenin increased hypoxiainduced damage in HUVEC by 10.7% and 13.1% , and 300mg/L NaIO₃-induced damage in HUVEC by 41.2% and 37.7%. Three mg/L naringenin increased 200 and 400umol/L H2O2-in-jured HUVEC by 20.1%and 21.5%, respectively. CONCLUSION: Naringenin increases the proliferation of ARPE-19 cells and inhibits the growth of HUVEC, and has potent antioxidant activity in ARPE-19 cells and HUVEC.     

柚皮素对ARPE-19和HUVEC细胞的抗氧化作用

目的：研究柚皮素对人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的抗氧化作用。 方法：采用MTT的方法检测ARPE-19和HUVEC细胞的生存率及增殖率。 结果：3，10mg／L柚皮素能显著增加ARPE-19细胞的增殖率达10．8％和11．4％。10mg／L柚皮素能提高ARPE-19细胞在缺氧，0．3mmol／LNaN，及200μmol／L，H2O2条件下的生存率分别为55．2％，69．2％及50．3％。1mg／L柚皮素能提高ARPE-19细胞在50μmol／L t-BHP和30mg／LNaIO3条件下的生存率达20．2％和30．4％。30mg／L柚皮素能够促进ARPE-19细胞在50μmol／L t-BHP条件下的增殖率达32．2％，而1mg／L柚皮素可以提高30，100，300mg／LNaIO3处理的ARPE-19细胞的增殖率达30．3％，10．3％及18．5％。3，10及30mg／L柚皮素抑制HUVEC的增殖率分别为23．9％，70．4％及77．9％。1，3mg／L柚皮素能提高HUVEC细胞在缺氧条件下的生存率达10．7％和13．1％，以及提高在300mg／LNaIO3条件下的生存率达41．2％和37．7％。3mg／L柚皮素能提高HUVEC细胞在200，400μmol／L H2O2条件下的生存率达20．1％和21．5％． 结论：柚皮素能够促进ARPE-19细胞的增殖率，抑制HU-VEC生长，同时对这两种细胞均有抗氧化作用。因此，柚臾素是治疗老年黄斑变性的很有前景的候选药物。     

蓝光对人视网膜色素上皮细胞增殖的影响和机制研究

目的:研究蓝光对人视网膜色素上皮细胞增殖能力的影响,并初步探讨其可能机制.方法:利用35W白色冷光灯加用蓝色滤光片建立蓝光损伤体外培养的RPE细胞模型,蓝光控制波长在470~520nm,光照强度控制为2000Lx左右,光照时间控制为24~96h,利用CCK-8法检测RPE细胞的增殖能力,利用real-time PCR技术检测RPE细胞中miR-103的含量.结果:与对照组相比,蓝光照射组的RPE细胞的增殖能力减弱;蓝光照射组的RPE细胞内的miR-103含量较对照组增加;miR-103过表达时,RPE细胞的增殖能力减退,降低miR-103的表达时,细胞增殖能力增强;降低miR-103的表达能够减弱蓝光对RPE细胞增殖的抑制作用.结论:蓝光通过上调miR-103抑制RPE细胞的增殖,miR-103可能成为治疗年龄相关性黄斑变性等视网膜变性疾病治疗的新靶点.     

Effects of astaxanthin on antioxidant parameters in ARPE-19 cells on oxidative stress model

AIM: To observe the protective effect of astaxanthin (AST) against hydroquinone (HQ) mediated cell death in the apoptotic cascade and evaluate intracellular Ca2+ release, caspase-3, and -9 activation, reactive oxygen species (ROS) production in ARPE-19 cells. METHODS: We cultured ARPE-19 cells in special mediums and performed MTT tests to determine protective effect of AST, before exposing the cells to HQ in an incubator. We analyzed intracellular Ca2+ release experiments, mitochondrial membrane depolarization, glutathione (GSH), glutathione peroxidase (GSH-Px) and ROS experiments, and apoptosis assay. RESULTS: ROS production ranges depend on the amount of cell death. We computed the correlation between ROS ranges and cell death by 20,70-dichlorofluorescein fluorescence, and Ca2+ levels by Fura-2-AM. HQ-induced cell death found out to rise ranges of caspase-3 and -9, and mitochondrial depolarization. These three steps were delayed by AST management. CONCLUSION: ARPE-19 cells are avoided from HQ-induced ROS production and caspase-3 and -9 activation by AST. AST may limit the range of caspase synthesis, Ca2+ release and excess production of ROS with antiapoptotic effect. This study proposes a new therapeutic approach for the treatment of age-related macular degeneration.