DEPDC1稳定沉默CNE-1细胞株的构建与分析

目的：为了进一步探讨DEPDC1（DEP domain containing 1）在肿瘤发生发展中的作用。DEPDC1是近年发现的一个肿瘤相关基因,前期研究结果显示其在鼻咽癌细胞周期及癌变过程中具有作用。方法：利用qRT-PCR和免疫组织化学染色分别检测DEPDC1在18例新鲜样品和44例组织芯片肿瘤患者中的表达情况。人鼻咽癌细胞系CNE-1稳定沉默DEPDC1后,流式细胞检测细胞增殖并利用Transwell小室分析侵袭迁移情况。结果： DEPDC1在鼻咽癌组织中表达量（0.699±0.521）明显高于正常组织（0.408±0.183）,差异有统计学意义（P＜0.05）。DEPDC1稳定沉默后,CCK8检测结果表明 CNE-1细胞增殖速度减慢。流式细胞检测的结果显示,G1期细胞减少,G2/M期细胞增多,细胞周期进程受阻。划痕及Transwell实验结果表明,DEPDC1稳定沉默明显减弱了CNE-1细胞运动,侵袭及迁移能力（77.033±5.183 vs. 20.137±2.828, 107.336±5.033 vs. 26.326±1.414）,差异均有统计学意义（P＜0.05）。进一步定量qRT-PCR及Western blot检测发现,DEPDC1稳定沉默导致上皮细胞标志分子E-cad－herin（0.457±0.022）显著上调、而间质细胞标志分子Vimentin（0.780±0.063）、N-cadherin（0.780±0.063）以及EMT上游关键转录因子Twist1（0.710±0.034）下调（P＜0.05）。结论：本研究成功构建了DEPDC1稳定沉默细胞株,与前期siRNA介导的瞬时沉默相似的是,发现DEPDC1稳定沉默可抑制鼻咽癌细胞的增殖、侵袭迁移,并改变EMT关键分子的表达,为进一步探索DEPDC1在鼻咽癌中的作用机制奠定了基础。     

SIRT1基因沉默对鼻咽癌CNE-1细胞放射敏感性的影响

目的 探究SIRT1基因沉默对人鼻咽癌细胞CNE-1放射敏感性的影响,为鼻咽癌临床治疗提供新的思路.方法 通过Western blot检测鼻咽癌组织及鼻咽癌细胞中SIRT1蛋白的表达情况.通过脂质体转染SIRT1 siRNA至CNE-1细胞;利用CCK-8法和流式细胞术检测不同剂量(0、2、4、6、8 Gy)的X射线放...     

丙型肝炎病毒核心蛋白对肝癌细胞stat3通路及细胞周期蛋白cyclin D1的调控作用

[目的]探讨丙型肝炎病毒核心蛋白(HCVc)是否调控肝癌细胞中stat3通路及细胞周期蛋白cyclin D 1的表达,参与肝癌细胞的恶性生物学行为.[方法]将含HCVc基因的真核表达质粒pEGFP-N3-HCVc瞬时转染人肝癌细胞HepG2使HCVc过表达,用siRNA-HCVc敲除HepG2细胞中HCVc的表达,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,Western blot检测HCVc、总stat3(stat3)、磷酸化stat3(p-stat3)及cyclinD1蛋白的表达;流式细胞术及MTT法检测细胞周期变化及细胞增殖情况.[结果]Western blot结果显示,通过瞬时转染而过表达HCVc的HepG2细胞中,HCVc、p-stat3及cyclinD1的蛋白水平高于空白质粒转染组和未转染组;siRNA-HCVc敲除HCVc表达后,HCVc、p-stat3和cyclin D1蛋白的表达下调;酪氨酸磷酸化抑制剂AG490(JAK2特异性拮抗剂)处理可下调过表达HCVc的HepG2细胞中p-stat3和cyclin D1蛋白的表达.流式细胞术显示过表达HCVc可促进细胞向G2/M期进展.MTT法结果显示过表达HCVc使HepG2细胞增殖能力增加.[结论]HCVc可活化HepG2细胞中stat3通路,调控细胞周期蛋白cyclinD1的表达,促进细胞周期进展及细胞增殖,可能与肝癌的发展有关.     

DBC2基因诱导乳腺癌细胞周期G1期阻滞的机制

目的 研究肿瘤抑癌基因DBC2(deletion in breast cancer 2)抑制乳腺癌MDA-MB-435S细胞增殖的可能机制.方法 野生型DBC2基因的真核表达载体pEBG-DBC2瞬时转染MDA-MB-435S细胞72 h,RT-PCR方法证实DBC2基因的过表达;流式细胞术检测DBC2的瞬时过表达对MDA-MB-435S细胞周期的影响,Western blot检测DBC2的过表达对细胞周期蛋白Cyclin D1表达的作用.结果 DBC2基因在MDA-MB-435S细胞中瞬时转染72 h后,其mR-NA表达水平即可成倍增加,同时DBC2基因的过表达可诱导该乳腺癌细胞周期的G1期阻滞,并随着时间的延长出现细胞凋亡.结论 DBC2基因体外抑制乳腺癌细胞生长的功能,可能通过抑制Cyclin D1的表达并使细胞停滞于G1期,以及诱导细胞凋亡等机制实现.     

PCDH8基因表达对鼻咽癌细胞生物学效应的影响

目的 探讨PCDH8基因表达对鼻咽癌细胞株CNE-1生物学行为的影响.方法 采用脂质体介导质粒pcDNA3.1-PCDH8(实验组)与质粒pcDNA3.1(对照组)转染至鼻咽癌细胞株CNE-1,RT-PCR、Western blot检测转染后CNE-1细胞的PCDH8 mRNA及蛋白表达;通过CCK-8细胞生长曲线、流式细胞技术、Transwell侵袭实验及CCK-8细胞药物敏感实验,进一步对转染PCDH8基因质粒的细胞株CNE-1的增殖能力、生长周期、细胞侵袭能力及对化疗药物的敏感性进行了分析,并与转染对照质粒的细胞株进行比较.结果 RT-PCR、Western blot检测结果表明转染质粒pcDNA3.1-PCDH8的实验组细胞株中PCDH8 mRNA及蛋白成功表达并明显高于转染质粒pcDNA3.1的对照组细胞株.CCK-8细胞生长曲线结果表明实验组细胞株的生长速度明显低于对照组.流式细胞仪检测结果表明实验组细胞株G0/G1期较对照组增加,S期细胞较对照组减少;Transwell侵袭实验结果表明实验组细胞株侵袭能力明显低于对照组;CCK-8细胞药物敏感性实验结果表明PCDH8基因的高表达能显著提高鼻咽癌细胞株CNE-1对顺铂化疗药物的敏感性.结论 PCDH8基因的表达能降低鼻咽癌细胞的增殖、侵袭能力,延缓细胞分裂周期,提高对顺铂化疗药物的敏感性.     

circRNA-ITCH通过TET1基因抑制Wnt/β-catenin 信号通路对鼻咽癌细胞增殖和侵袭的影响

目的 观察环状RNA(circRNA)-ITCH在鼻咽癌组织和细胞系中的表达,探讨circRNA-ITCH对鼻咽癌细胞增殖和侵袭的影响及其分子机制。方法 qPCR分别检测circRNA-ITCH在49例鼻咽癌组织和鼻咽癌细胞系中的表达。选取circRNA-ITCH表达最低的细胞系,分别转染阴性质粒或过表达circRNA-ITCH的质粒,定义为对照组和实验组。CCK-8法和Transwell侵袭实验分别检测过表达circRNA-ITCH对细胞增殖和侵袭能力的影响。qPCR和Western blot法分别检测过表达circRNA-ITCH对10-11转位酶1(ten-eleven translocation1,TET1)基因和Wnt/β-catenin信号通路表达的影响。结果 circRNA-ITCH在鼻咽癌组织中表达水平明显低于癌旁组织(P<0.01)。circRNA-ITCH在鼻咽癌细胞系中表达水平明显低于人永生化鼻咽上皮细胞(P<0.05),在CNE-2Z细胞中的表达水平最低(P<0.01)。与对照组比较,实验组CNE-2Z细胞的增殖能力明显降低(P<0.05),细胞侵袭能力明显降低(P<0.01)。与对照组比较,实验组CNE-2Z细胞中TET1在mRNA和蛋白水平的表达明显增加(P<0.01),Wnt1、PLC、PKC和β-catenin蛋白表达明显降低,Wnt/β-catenin信号通路被抑制。结论 circRNA-ITCH在鼻咽癌组织及细胞系中表达降低,过表达circRNA-ITCH可明显抑制鼻咽癌CNE-2Z细胞的增殖和侵袭能力,其分子机制可能是促进TET1基因的表达,抑制Wnt/β-catenin信号通路。     

HMGB1对人鼻咽癌细胞株C666-1体外增殖的影响

目的观察高迁移率族蛋白1（HMGB1）对人鼻咽癌细胞株C666-1增殖的影响并探讨其可能的机制。方法用siRNA干扰
鼻咽癌细胞株C666-1 HMGB1基因,CCK-8检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期,Western blot检测cyclin D1,CDK6及相
关通路蛋白表达。用带GFP的HMGB1质粒转染鼻咽癌细胞株C666-1,EDU和CCK-8检测细胞增殖。结果干扰HMGB1的表
达后,细胞增殖明显减慢（P<0.001）;细胞周期分析显示处于G1期细胞比例增多（P<0.001）,S期细胞比例明显下降（P<0.001）;
Western blot结果显示cyclin D1、CDK6的表达下调,STAT3,P-STAT3的表达也下调。过表达HMGB1后,EDU显示处于S期细
胞比例增多（P<0.05）;CCK-8显示细胞增殖明显增快（P<0.001）。结论HMGB1促进人鼻咽癌细胞株C666-1的增殖,可能通过
STAT3信号通路上调cyclin D1、CDK6促进鼻咽癌细胞株C666-1由G1期进入S期从而调控其增殖。
     

PRMT1通过促进RRM2表达抑制鼻咽癌细胞凋亡

目的 探讨PRMT1能否通过促进RRM2抑制鼻咽癌细胞凋亡。方法 免疫组化和Western blot共同检测鼻咽癌和癌旁组织中PRMT1及RRM2的相对表达量;以人正常鼻黏膜上皮细胞系（HNEpC）作为对照,Western blot实验检测不同鼻咽癌细胞系中PRMT1和RRM2蛋白的相对表达量;对CNE-2细胞中PRMT1分别进行过表达和下调,过表达实验设阴性对照组（oe NC:CNE-2细胞中转染pcDNA3.1质粒）、过表达PRMT1组（oe PRMT1:CNE-2细胞中转染pcDNA3.1 PRMT1质粒）、下调实验设阴性对照组（si-NC:CNE-2细胞中转染NC无关序列）及PRMT1小干涉RNA组（si-PRMT1:CNE-2细胞中转染PRMT1小干涉RNA）,对CNE-2细胞中RRM2分别进行过表达和下调,过表达实验设阴性对照组（oe NC:CNE-2细胞中转染pcDNA3.1质粒）、过表达RRM2组（oe RRM2:CNE-2细胞中转染pcDNA3.1 RRM2质粒）、下调实验设阴性对照组（si-NC:CNE-2细胞中转染NC无关序列）及RRM2小干涉RNA组（si-RR...     

VP3对鼻咽癌细胞CNE-2细胞株的体外杀伤效应

目的：体外实验观察VP3对鼻咽癌CNE-2细胞株的杀伤效应。方法：构建质粒表达载体pcDNA3．1（-）CMV．V3-His,KpnI／EcoR I酶切鉴定,测序分析VP3基因序列。脂质体法将pcDNA3．1（-）CMV．VP3-His和pcDNA3．1（-）-His分别瞬时转染鼻咽癌细胞CNE-2细胞株,Western印迹鉴定VP3基因的表达。四甲基偶氮唑盐（methylthiazoletetrazolium,MTT）法检测VP3对鼻咽癌细胞株CNE-2的杀伤效应。结果：酶切和测序分析证实重组质粒中包含完整的忡,基因的编码序列,Western印迹在转染细胞总蛋白中检测到该基因表达的16．03kD的蛋白。表达VP3基因的CNE-2细胞生长受到抑制,而不表达忡;基因的CNE-2细胞生长未受到抑制。结论：VP3可杀伤鼻咽癌细胞CNE-2细胞株。     

SPA-1通过Rap1信号通路参与疾病的发生和发展

SPA-1为一种小分子蛋白酶激活蛋白,目前在细胞及肿瘤中研究较多。在细胞中,SPA-1通过与不同的分子或者蛋白相互作用,影响Rap1三磷酸鸟苷酶活性,从而参与细胞功能的调节。在肿瘤方面,SPA-1在乳腺癌和白血病中的研究较多,大量临床研究发现SPA-1与乳腺癌有重要联系,而动物实验发现SPA-1与白血病有关,还发现SPA-1-/-的小鼠部分发生了狼疮样肾小球肾炎,猜测SPA-1在自身免疫疾病中起一定作用。但SPA-1在这些疾病中具体作用机制尚在进一步探索之中。     

Ksp-Gpx1-k1k1载体的构建及鉴定

目的 构建含有肾组织特异性启动子(Ksp-cadherin)的Gpx1与k1k1载体质粒,为下一步构建转基因动物、研究在动物模型体内表达和基因治疗提供基础.方法 以KLK1 cDNA、GPX1 cDNA、Ksp-cadherin BAC为模板,PCR扩增获得人源Gpx1、KLK1、Ksp-cadherin cDNA.PCR产物大小与预期结果一致,序列分析完全正确.选择多个相应酶切位点,分步将Ksp-cadherin、Gpx1、KLK1插入至pIRES-EGFP质粒中.构建pKSP-GPX1-IRES-KLK1重组质粒.应用酶切鉴定和序列分析方法验证所构建载体的正确性.结果 成功构建了含有Ksp-cadherin的GpX1与k1k1载体质粒.结论 该重组载体的构建为下一步构建转基因动物,研究其在哺乳动物肾组织内过表达及在移植肾缺血冉灌注损伤的基因治疗中的作用奠定了基础.     

Sp1和Egr-1对LCRG1基因启动子转录活性的调节研究

目的:目前LCRG1基因转录调控机制不清,现拟研究Sp1和Egr-1对人LCRG1基因启动子的转录调节. 方法:利用MatInspector软件分析LCRG1基因启动子区域内潜在的转录因子结合位点,Sp1、wtEgr-1、mtEgr-1真核表达质粒与LCRG1启动子重组质粒的共转染实验,分析其对LCRG1启动子活性的影响. 结果:生物信息学提示LCRG1基因启动子区域存在Sp1和Egr-1等位点,外源性突变型转录因子Egr-1能上调LCRG1基因启动子的活性.结论:突变型转录因子Egr-1可能参与该基因的表达调控.     

AP1对人CD226/PTA1启动子的调控作用

目的：确定血小板／T细胞活化抗原1(PTA1)基因的转录起始点,及激活蛋白1(AP1)对PTA1启动子的调控作用．方法：采用5’-RACE方法确定PTA1基因的转录起始点;将含AP1的真核表达载体和含有PTA1启动子的荧光素酶的报告基因载体共转染人肝癌细胞系HHCC,培养48h后检测其荧光素酶活性．结果：人PTA1基因的转录起始点定位于ATG上游229bp处,AP1可以显地增强PTA1启动子P1和P2的活性,转录因子etsl对AP1上调P1和P2活性有不同的调控作用．结论：PTA1的转录起始点位于ATG上游229bp处,AP1可能参与调控PTA1的表达．     

多发性内分泌腺瘤综合征1型1例报告

1 病例资料 女,65岁,因＂发作性晨起心悸、抽搐15＋年,再发1h＂入院.入院前15＋年,常于凌晨无明显诱因出现心悸、大汗,继发意识丧失、抽搐,每次持续2 h～3 h,可自行缓解,无明显饥饿感,发作间期正常,入院前1 h再发类似症状.发病后体重增加约15 kg.无类似家族史.     

甲型H1N1流感病案的管理

目的保护好甲型H1N1流感病案,为进行医学研究和攻关提供重要参考依据。方法针对甲型H1N1病毒流行病学特点,结合SARS病案的管理经验,甲型H1N1流感病案应实行病案消毒,设身专人管理,专柜存放,病案整份复印,作为特存病案严格规范对甲型H1N1流感病案的借阅制度。结论病案管理人员要最大限度地保护病案的完整性,维护其原貌,保障和提高病案的使用价值。     

不孕妇女支原体感染及相关因素分析

目的 探讨女性不孕症与生殖道支原体感染的关系.方法 选择300例生育期不孕妇女分为原发性不孕症135例和继发性不孕症165例,观察支原体感染的检出情况、支原体感染与宫颈糜烂的关系和危险因素1ogistic逐步回归的分析结果.结果 原发性不孕组和继发性不孕组UU、MH及混合感染率均明显高于对照组,差异有统计学意义(χ2=4.12,P<0.01);宫颈糜烂患者支原体感染阳性率58.04%,明显高于宫颈光滑患者12.3%(χ2=3.99,P<0.01);1ogistic回归模型分析发现,继发性不孕的主要危险因素有人流、盆腔炎、输卵管病变、月经不调、子宫内膜异位症(简称E M7)、早年性交、支原体感染(宫颈分泌物U U+).结论 不孕妇女支原体感染率很高,且与宫颈糜烂密切相关.减少人流率,防治感染是降低继发性不孕的重要措施.     

气相色谱法测定作业场所空气中1，1-二氯-1-氟乙烷

目的建立工作场所中1，1-二氯-1-氟乙烷的分析方法。方法用活性炭管采样，二硫化碳解吸，HP—FFAP，25m×0．2mm×0．33μm石英弹性毛细管柱分离，火焰离子化检测器检测空气中的1，1-二氯-1-氟乙烷，标准曲线法定量。结果1，1-二氯-1-氟乙烷浓度在61．8—3090μg／ml范围内呈线性关系，回归方程为A=0．227089C＋0．781703，相关系数r=0．99999；方法检出限为1．4μg/ml。以750ml的采样量计算对应于空气中的浓度为1.9mg／m^3。溶液和空气中的定量检出限分别为4．8μg／ml和6．4mg／m^3。碳管的解吸效率范围为98．7％～102．3％，重复测定和平行测定的相对标准偏差（P,SD）均小于2．0％。结论建立的方法灵敏、准确，可以应用于工作场所空气中1，1-二氯-1-氟乙烷的测定。     

谷胱苷肽转硫酶GSTM1、GSTT1和GSTP1基因多态性与江苏人群直肠癌易感性的关系

目的:探讨谷胱苷肽转硫酶M1、T1、P1(GSTM1、GSTT1和GSTP1)基因多态性和吸烟饮酒习惯与直肠癌易感性的关系.方法:以直肠癌患者210例,人群对照439例为研究对象,调查研究对象的生活习惯,以多重PCR技术检测GSTM1和GSTT1基因缺失,PCR-RFLP技术检测GSTP1基因单核苷酸多态(第105密码子A→G).结果:GSTM1和GSTT1基因缺失频率在病例组和对照组差异无显著性;GSTP1 A/A、A/G和G/G基因型频率分布在病例组和对照组差异无显著性;与GSTP1 A/A基因型携带者相比,G/G基因型者发生直肠癌的危险性无显著升高,调整OR值为1.11(95%CI:0.77～1.60).结论:GSTM1、GSTT1和GSTP1基因多态性与直肠癌易感性无关.