放射抗拒性食管癌细胞系的建立及基因表达差异分析

目的观察食管癌细胞经射线反复照射后放射敏感性的变化，应用基因芯片技术分析放射抗拒性食管癌细胞基因表达变化。方法食管鳞状细胞癌细胞株TE13经反复γ射线照射（累积剂量120Cy），逐步筛选出具有放射抗拒性的细胞TE13R120。相差显微镜下观察TE13及TE13R120的形态学差异；应用细胞克隆形成实验，验证TE13及TE13R120两种细胞的不同放射敏感性，用流式细胞术检测它们的细胞周期分布特征；基因芯片分析两种细胞基因表达差异。结果TE13R120的细胞群体倍增时间为39．93h，长于亲代TE13（33．94h）。TE13及TE13R120的放射敏感性明显不同（仇值分别为1．63和2．85Gy，SF2值分别为0．55和0．64，Dq值分别为1．38和1．15Gy，n值分别为2．33和1．49）。两种细胞经4Gy放射线照射后，出现不同的细胞周期分布改变，12～48h TE13R120细胞周期变化不明显，而其亲代细胞TE13发生明显G1期阻滞。应用DNA芯片对2159个基因进行了筛选，TE13R120与TE13相比，上调基因96个，下调基因80个。结论新的食管癌细胞系TE13R120比其亲本对射线更加抗拒，并且在基因水平上发生明显变化。4Gy照射后12～48hTE13R120细胞周期变化不明显，而其亲代细胞TE13发生明显G1期阻滞。     

机体的内在放射敏感性与放射治疗

放射治疗是目前临床卜常用的医疗手段。决定放射治疗效果的因素很多，但靶组织的放射敏感性是其中关键的因素之一，尤其是肿瘤组织与正常组织间的放射敏感性差异更具有重要意义“’。研究患者对放射治疗的敏感性对于实施放射治疗，以期达到最佳效果，更具临床实用价值。本文就临床工作中涉及最多的细胞或组织的放射敏感性及其在放射治疗巾的预测作用作一综述。1组织或细胞的放射敏感性测定方法以实验手段测定组织或细胞的放射敏感性是继放射治疗学后出现的新的研究领域，其H的在于应用正常或肿瘤组织细胞进行体外放射敏感性试验，为判断、…     

p16基因与肿瘤放射敏感性关系的研究进展

放射治疗是肿瘤治疗的主要手段之一,而肿瘤细胞的放射敏感性是决定放疗疗效的关键因素之一,大量的研究表明细胞周期调控是影响细胞辐射敏感性的重要因素之一,p16基因与细胞周期调控有关,人类75％的癌细胞株有p16基因的缺失或突变,其低表达与肿瘤细胞增殖、辐射抵抗密切相关。随着分子生物学技术的发展,对癌基因和抑癌基因研究日益深入,为从基因水平上治疗肿瘤和增加放射敏感性提供了新的希望。现将p16基因其在肿瘤放射敏感性方面的研究进展综述如下。     

鼻咽癌细胞系放射敏感性的异质性

鼻咽癌多发于我国南方 ,放射治疗为首选治疗手段。鼻咽癌患者放射治疗后 5年生存率为 34%～ 5 3% ,多数死于局部复发和 或远处转移。肿瘤细胞群中存在放射敏感性差的亚群是复发和转移的主要原因 ,更有效的治疗方案的设计应针对这些放射抵抗的细胞。本室已从鼻咽癌细胞系ＣＮＥ 2Ｚ中分离出 2 5个单克隆株 ,这些克隆株在倍增时间、细胞分裂指数、成瘤率、体外侵袭能力、转移能力和途径等方面存在异质性[1 ] 。为分离出放射敏感性不同的细胞亚系并研究产生放射抵抗的机理 ,本实验对这 2 5个克隆株中生物学特性差异较大的 10个克隆作进一步研究…     

西妥昔单抗对人食管癌放射抗拒性细胞株KYSE-150R放射敏感性的研究

目的 观察西妥昔单抗(C225)对人食管鳞癌放射抗拒性细胞株KYSE-150R的影响。方法 分次照射建立人食管鳞癌放射抗拒性细胞株KYSE-150R;相差显微镜下观察细胞的形态学差异;G显带法进行染色体分析;克隆形成实验验证KYSE-150和KYSE-150R细胞的不同放射敏感性;采用不同浓度的C225处理KYSE-150R细胞,研究对KYSE-150R细胞放射敏感性的影响。结果 KYSE-150R细胞的群体倍增时间为(25.9±0.6)h,长于亲代细胞的KYSE-150(23.6±0.2) h(t=6.6,P＜0.01);KYSE-150R细胞的染色体数目由69.3±1.9 增加到73.7±1.2(t=-8.83,P<0.01),并且观察到有染色体畸变;KYSE-150R细胞SF₂、D₀、D_q及N 值均高于KYSE-150细胞, 加入5 μg/ml的C225后,其SF₂、D₀、D_q、N与单纯照射组KYSE-150R细胞相比有显著降低;加入C225后KYSE-150R细胞G₀/G₁、G₂/M期比例增加,S期比例减少(t=-4.478~4.308, P<0.05)。结论 C225对人食管鳞癌放射抗拒性细胞株KYSE-150R有放射增敏作用。     

乏氧诱导的A549细胞外泌体特征及其对放射抗拒性的影响

目的 收集乏氧和常氧条件下人肺腺癌A549细胞产生的外泌体,观察常氧下A549细胞与外泌体共培养后对X射线敏感性及侵袭性的变化。方法 分别在乏氧（1% O₂）和常氧条件下（21% O₂）培养A549细胞,超高速离心法收集在细胞分泌的常氧外泌体（N-EXO）和乏氧外泌体（H-EXO）。NanoSight检测外泌体数量,扫描电镜观察外泌体的外观和大小。蛋白印迹检测外泌体蛋白CD63。CCK8检测细胞对X射线的耐受性。荧光显微镜观察A549细胞对PKH67标记的外泌体的摄取。细胞划痕实验和Transwell实验观察加入不同的外泌体后细胞侵袭和侵袭性变化,ELISA方法检测细胞上清液中基质金属蛋白酶2（MMP2）和基质金属蛋白酶9（MMP9）的表达变化。细胞克隆形成实验观察二种外泌体对细胞放射抵抗性的改变。结果 每ml细胞培养液中H-EXO的数量增多。H-EXO和N-EXO均呈现出典型的环饼状,H-EXO直径变小,粒径分布在30~200 nm,小于N-EXO的粒径（50~220 nm）。H-EXO和N-EXO的CD63表达无明显差别。乏氧条件培养的A549细胞接受2 Gy X射线后,细胞的增殖水平在4和6 d时远高于常氧条件下的细胞。PKH67绿色荧光标记的外泌体分布在细胞内部。12、24、48 h后,H-EXO组细胞划痕宽度远小于N-EXO组（t=2.96、6.76、3.35,P<0.05）。H-EXO组细胞穿膜细数量大于N-EXO组和对照组（t=4.84、7.88,P<0.01）。H-EXO组上清液中MMP2（t=4.70、3.21,P<0.05）和MMP9（t=5.61、3.76,P<0.05）表达水平较对照组和N-EXO组均明显增高。对照组、N-EXO和H-EXO的D₀值分别为2.614、2.552、4.850。H-EXO较N-EXO可以明显增强A549细胞的放射抵抗性。结论 乏氧条件下,A549细胞释放的外泌体数量增多、粒径变小,乏氧外泌体可以促进常氧细胞的侵袭性,并且能够增强细胞对X射线的耐受性。     

西妥昔单抗对人食管癌放射抗拒性细胞株KYSE-150R放射敏感性的研究

Objective To determine the effect of cetuximab(C225)on the radioresistant human esophageal squamous carcinoma eell line KYSE-150R.Methods A radioresistant human esophageal squamous carcinoma cell line KYSE-150R was established by fractionated irradiation.Morphological changes from KYSE-150 to KYSE-150R were observed by phase-contrast microscopy.Karyotype analysis was performed by G-banding.The radiosensitivities were analyzed by colony formation assays.Results The population doubling time of KYSE-150 and KYSE-150R were(23.6±0.2)h and(25.9±0.6)h (t=6.6,P<0.01),respectively.The chromosome number of KYSE-150R was increased and chromosome aberrations were observed from(69.3±1.9)h to(73.7±1.2)h(t=-8.83,P<0.01).The SF2,D0,Dq and N values of KYSE-150R were all higher than those of KYSE-150.After 5μg/ml of C225 added,the SF2,D0,Dq and N values were significantly decreased as compared to the control.After C225 treatment,the G0/G1 and G2/M phase cells were increased,while S-phase cells decreased(t=-4.478-4.308,P<0.05).Conclusion Cetuximab can enhance the radiosensitivity of radioresistant human esophageal squamous carcinoma cell line KYSE-150R.     

西妥昔单抗对人食管癌放射抗拒性细胞株KYSE-150R放射敏感性的研究

Objective To determine the effect of cetuximab(C225)on the radioresistant human esophageal squamous carcinoma eell line KYSE-150R.Methods A radioresistant human esophageal squamous carcinoma cell line KYSE-150R was established by fractionated irradiation.Morphological changes from KYSE-150 to KYSE-150R were observed by phase-contrast microscopy.Karyotype analysis was performed by G-banding.The radiosensitivities were analyzed by colony formation assays.Results The population doubling time of KYSE-150 and KYSE-150R were(23.6±0.2)h and(25.9±0.6)h (t=6.6,P<0.01),respectively.The chromosome number of KYSE-150R was increased and chromosome aberrations were observed from(69.3±1.9)h to(73.7±1.2)h(t=-8.83,P<0.01).The SF2,D0,Dq and N values of KYSE-150R were all higher than those of KYSE-150.After 5μg/ml of C225 added,the SF2,D0,Dq and N values were significantly decreased as compared to the control.After C225 treatment,the G0/G1 and G2/M phase cells were increased,while S-phase cells decreased(t=-4.478-4.308,P<0.05).Conclusion Cetuximab can enhance the radiosensitivity of radioresistant human esophageal squamous carcinoma cell line KYSE-150R.     

放射肿瘤学：抗癌基因与放射敏感性关系研究进展

提高肿瘤放射敏感性是放射治疗的关键。从总体角度，细胞水平研究肿瘤放射敏感性未能给临床提供足够的信息。抗癌基因，特别是Ｐ＾５３及其相关基因与放射敏感性关系的研究为提高放射治疗效果提供了新的思路和方法。     

中性单细胞电泳检测肿瘤细胞放射敏感性

目的　探讨中性单细胞电泳检测肿瘤细胞放射敏感性的可行性。方法　应用克隆形成法和中性单细胞电泳技术 ,检测辐射诱导的人红白血病细胞株K562 、人结肠腺癌细胞株LS T 1 1 7和鼠胶质瘤细胞株C6的初始DNA双链断裂数及双链断裂后的修复 ,以及两者与细胞放射敏感性之间的关系。结果　 3种细胞系的放射敏感性依次为K562 >LS T 1 1 7>C6;3种细胞系的DNA迁移长度都随着照射剂量的增加而增大 ,呈良好的剂量效应关系。在相同剂量下辐射诱导的DNA双链的初始断裂数目 ,也依次为K562 >LS T 1 1 7>C6;3种细胞系经 1 0GyX射线照射 ,并在PBS中培养不同时间后DNA迁移长度 ,都有较大幅度的下降 ,但下降幅度依次为C6>LS T 1 1 7>K562 。在相同剂量下辐射诱导的DNA双链断裂后的修复能力 ,也依次为C6>LS T 1 1 7>K562 。结论　辐射诱导的DNA双链断裂及修复 ,与细胞放射敏感性有很好的相关性 ,可望用于肿瘤细胞内在放射敏感性的预测     

鼻咽癌细胞辐射抗拒的比较蛋白质组学分析

目的 通过分离并鉴定具有不同辐射抗拒的人鼻咽癌细胞株CNE-2R与CNE-2的差异表达蛋白,探讨与鼻咽癌细胞辐射抗拒相关的分子机制.方法 分别提取鼻咽癌辐射抗拒细胞株CNE-2R及其亲本细胞株CNE-2的总蛋白,采用双向凝胶电泳分离,经软件分析识别差异表达蛋白点,应用基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱技术(MALDI-TOF-MS)鉴定差异蛋白质.结果 两种不同辐射敏感性的鼻咽癌细胞株CNE-2R和CNE-2中,共筛选出差异表达明显的蛋白质点有32个,其中11个蛋白质被鉴定成功,在CNE-2R中上调的蛋白有3个,下调的蛋白有8个.结论 不同辐射敏感性的鼻咽癌细胞的差异表达蛋白,主要涉及调节凋亡、DNA损伤与修复、细胞周期调控、RNA转录、细胞信号转导、细胞骨架组成及辐射应激反应等多个方面.     

肿瘤细胞对p(35)Be快中子的辐射敏感性研究

目的 比较肿瘤细胞p(35)Be块中子及γ射线的辐射敏感性,为肿瘤的快中子治疗提供理论依据。方法 用细胞集落在存活方法研究人黑色素瘤细胞（WM9839）、人口 皮癌细胞（KB）、人结肠腺癌细胞（LS－T－117）和人前列腺癌细胞（PC3M）等4种细胞对快中子及γ射线的辐射敏感性,用彗星电泳技术研究WM9839细胞在快中子及γ射线照射后DNA损伤的修复效应。结果 细胞存活实验表明,p(35)Be快中子照射后4种肿瘤细胞的D0值（或SF2值）较γ射线照射后差异减小,即4种肿瘤细胞对快中子的辐射敏感性差异减小;快中子2Gy照射后,WM9839细胞DNA损伤修复曲线整体上下降较γ射线2Gy照射后慢,到180min时,DNA损伤残留率明显高于γ射线2Gy照射。结论 快中子治疗肿瘤可以很好地弥补低LET射线放射治疗的不足,特别是对低LET射线较为耐受的肿瘤细胞,如KB细胞和WM98309细胞。     

不同非小细胞肺癌细胞对碳离子放射敏感性的影响

目的 分析不同非小细胞肺癌（NSCLC）细胞对碳离子照射放射敏感性的影响,并探讨其相关的分子机制。方法 采用¹²C⁶⁺对肺腺癌A549细胞、鳞癌H520细胞和大细胞癌PGCL3细胞进行照射,吸收剂量分别为0、2、4和6 Gy。通过克隆实验检测3种细胞系的存活率,流式细胞术检测细胞的周期分布,利用Hoechst 33258染色检测细胞的凋亡率,实时RT-PCR方法检测细胞内DNA-PKcs基因的表达。结果 2、4、6 Gy照射后,A549、H520和PGCL3细胞的存活率明显下降,其中A549细胞辐射敏感性最低,其次是PGCL3细胞,H520细胞辐射敏感性最高。受照射后细胞均出现G₂/M期阻滞与凋亡,且随剂量的升高呈现上升的趋势。受照射H520与PGCL3细胞的阻滞率（t=4.813、20.738、25.654和t=2.790、2.977,P<0.05）和凋亡率（t=8.579、14.289、15.244和t=3.785、5.098、8.105,P<0.05）明显高于A549细胞。受照射细胞DNA-PKcs表达明显上调,A549细胞最高,其次是PGCL3细胞,H520细胞最低;并且随着剂量的升高,DNA-PKcs的表达呈现下降趋势。2、4 Gy照射后H520和PGCL3细胞DNA-PKcs的表达明显低于A549细胞（t=7.782、3.689和t=3.889、2.814,P<0.05）。结论 不同NSCLC细胞对¹²C⁶⁺离子的放射敏感性不同,H520鳞癌细胞最高,A549腺癌细胞最低。肺腺癌A549细胞放射敏感性较低可能与高表达的DNA-PKcs参与NHEJ途径修复DNA双链断裂有关。     

放射抗性肺癌D6-R细胞亚系的特征分析

目的研究新的放射抗性肺癌D6-R细胞亚系在增殖活性、放射诱导的凋亡、DNA损伤与修复方面的特征，初步探讨D6-R细胞放射抗性的机理。方法以D6-R和D6细胞为实验对象，MTT法测定细胞生长曲线，流式细胞仪和荧光显微镜分析细胞凋亡状况，碱性单细胞凝胶电泳检测DNA单链断裂与修复。结果D6-R和D6细胞具有相同的增殖活性；照射前后均无明显的细胞凋亡发生；照射后D6-R、D6细胞的初始DNA单链断裂与修复能力存在统计学意义，放射抗性的D6-R细胞初始DNA单链断裂程度较轻，修复速率较快，修复后残存单链断裂较少。结论初始DNA损伤程度较轻，修复能力较强可能是D6-R细胞放射抗性的重要原因。     

RNA干扰抑制c-jun基因表达对放射抗拒人鼻咽癌细胞系CNE-2R放射敏感性的影响

目的 利用RNA干扰技术抑制放射抗拒人鼻咽癌细胞系CNE-2R中高表达的c-jun基因,研究其对CNE-2R细胞放射敏感性的影响及其潜在机制.方法 设计合成3组特异性针对c-jun基因的siRNA,构建慢病毒vshRNA载体,感染CNE-2R细胞,采用RT-PCR和Western blot方法检测各组对目的基因的抑制效果;并通过克隆形成实验测定其放射敏感性,CCK-8实验检测细胞的存活能力,流式细胞术检测细胞凋亡率.结果 重组慢病毒c-jun-RNAi-LV2能明显下调CNE-2R细胞中c-jun的mRNA和蛋白水平的表达(F=217.20、42.07, P<0.05).6 MV X射线联合c-jun-RNAi-LV2组在0、2、4、6和8 Gy照射后细胞的吸光度值均显著低于未转染组和阴性对照组(F=42.70~200.67, P<0.05).克隆形成实验显示,c-jun-RNAi-LV2组与未转染组及阴性对照组相比,SF₂、D₀和D_q值均减小,放射增敏比(SER_D0)为1.41.细胞凋亡实验结果显示,未经照射的c-jun-RNAi-LV2组与联合2 Gy照射的凋亡率分别为(20.93±1.99)%和(38.17±0.83)%,均高于未转染组和阴性对照组的凋亡率[0 Gy:(10.97±0.70)%和(20.43±0.25)%;2 Gy:(10.80±1.25)%和(19.53±1.50)%;F=50.54、330.14, P<0.05].结论 RNA干扰技术可有效抑制放射抗拒人鼻咽癌细胞系CNE-2R中高表达的c-jun基因,使细胞放射敏感性增高,其作用可能与c-jun基因的下调使细胞增殖能力减弱,细胞凋亡增多有关.     

放射抗拒肺癌细胞亚系D6-R的建立及其细胞周期研究

目的 探讨放射抗拒肺癌细胞系的放射抗拒机理。方法 应用X射线照射肺癌D6细胞系8次，每次吸收剂量650cGy，对存活细胞单克隆化，采用克隆形成实验测定所得的新细胞亚系D6-R细胞及其亲本的放射敏感性，流式细胞术检测它们的细胞周期特征。结果 与亲本D6细胞相比，D6-R细胞显示出放射抗性，其D0、Dq及N值增大，细胞存活曲线肩区增宽，在SR2水平上，D6-R细胞的放射抗性是其亲本细胞D6的1．65倍。D6-R细胞S期比例较其亲本D6细胞明显增高，而G2／M，G1期比例则下降。结论 新的细胞亚系D6-R比其亲本对射线更加抗拒，并且显示出与亲本不同的细胞周期特征。     

神经纤毛蛋白1对非小细胞肺癌放射敏感性的影响

目的 探讨神经纤毛蛋白1 (neuropilin 1,NRP1)在不同种类非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系的表达情况及其与肿瘤放射敏感性的关系.方法 通过Western blot技术检测不同来源的5种人NSCLC细胞系(H358、H460、H1299、A549、SK-MES-1)NRP1的基础表达水平,MTT方法检测经不同剂量X射线照射后肺癌细胞的存活情况,初步筛选5种细胞中辐射敏感和辐射抵抗的2种细胞;采用克隆形成实验及流式细胞术分别检测细胞存活分数及凋亡率的变化,分析2种肺癌细胞的放射敏感性,采用Western blot检测2种细胞受X射线作用后 NRP1 的表达变化,通过克隆形成实验检测靶向抑制NRP1对A549细胞放射敏感性的影响.结果 5种肿瘤细胞NRP1表达量由高到低依次为:A549>SK-MES-1>H358>H460>H1299;X射线对肿瘤细胞的抑制能力呈剂量依赖性增强,其抑制率由高到低依次为:H460>H1299>H358>SK-MES-1>A549,因此选取A549细胞和 H460细胞做后续研究.克隆形成实验显示,A549在2 Gy照射下的存活分数(SF₂)是0.887,而H460细胞为0.313.A549细胞受照后的凋亡率为对照组的122.54%,明显低于H460细胞的238.88%.辐射可以诱导A549细胞NRP1的表达上调达40%,同时靶向抑制NRP1则可以增强A549细胞的放射敏感性.结论 在NSCLC细胞中A549细胞具有较强的辐射抗性,且辐射抗性的形成与其NRP1表达上调有关.     

端粒酶阴性肿瘤细胞株U2OS中Ku80表达抑制模型的建立及其对放射敏感性的影响

目的 探讨Ku80在端粒酶阴性肿瘤细胞中与端粒和放射敏感性的关系。方法 构建重组表达质粒pshRNA-Ku80,转染U2OS细胞,并筛选稳定表达的转化克隆。RT-PCR 和Western blot分别在基因和蛋白水平检测干扰前后Ku80 表达量的变化。定时PCR检测干扰前后端粒长度的变化。克隆形成实验分析pshRNA-Ku80 干扰对U2OS细胞放射敏感性的影响。结果 流式细胞仪检测重组质粒稳定转染细胞株的转染效率为(83.23±7.63)%。PCR结果显示,重组质粒组Ku80基因抑制率为(68.09±1.16)%。Western blot结果表明,重组质粒组Ku80 蛋白抑制率达到(11.03±2.45)%。端粒长度检测结果显示,重组质粒组的端粒长度(1.07±0.07)明显短于空白组(4.42±1.30) (F=38.58, P<0.05),而空质粒组端粒长度(4.11±0.84)与空白组无明显变化。克隆形成实验结果显示,重组质粒组细胞株SF₂ 值较空白组降低显著(F=1089.61,P<0.05),放射增敏比(SER)为1.47。结论 运用RNAi技术所建立的Ku80 表达抑制的细胞模型,可用于以后的基因功能研究;在U2OS中,特异性地沉默Ku80会引起端粒长度的缩短,并增加U2OS细胞的放射敏感性,推测pshRNA-Ku80引起端粒缩短很可能是其放射增敏的机制之一。     

多西紫杉醇对甲状腺乳头状癌细胞系的放射增敏研究

目的 研究多西紫杉醇对甲状腺乳头状癌TPC-1细胞系放射敏感性的影响。方法 6 MV X射线照射及多西紫杉醇单独或联合作用于细胞。采用CCK-8检测多西紫杉醇对TPC-1细胞增殖的影响;克隆形成法观察多西紫杉醇对TPC-1细胞放射敏感性的影响;流式细胞仪测定多西紫杉醇TPC-1细胞凋亡的变化和细胞周期的影响。Western blot法检测Bax、Bcl-2蛋白表达水平。结果 多西紫杉醇对TPC-1细胞系的增殖具有抑制作用,且存在明显的剂量和时间依赖性,半数抑制浓度分别为6.06(24 h)、1.39(48 h)和0.09μg/ml (72 h)。多西紫杉醇联合照射的SF₂、D₀、D_q较单纯照射均有所下降,放射增敏比(SER)为1.53。0.05μg/ml多西紫杉醇联合照射作用于TPC-1细胞24、48、72 h后凋亡率分别为31.67%、44.57%、70.20%,与单纯照射比较,差异具有统计学意义(t=-146.56、-15.13、-19.15,P<0.05)。多西紫杉醇使TPC-1细胞发生G₂/M期阻滞。与单纯照射相比,紫杉醇联合照射能显著增加G₂/M期细胞阻滞(t=-79.17,P<0.05),伴有Bax蛋白表达增加(t=93.56,P<0.05)和Bcl-2表达降低(t=41.02,P<0.05)。结论 多西紫杉醇能增加甲状腺乳头状癌TPC-1细胞的凋亡,使细胞周期再分布,可能是通过调节Bax、Bcl-2等相关蛋白表达增加其放射敏感性。