CIK细胞对RNAi沉默PD-L1基因的肺腺癌A549细胞的体外抑制作用

目的:观察沉默肺癌A549细胞的程序性死亡受体1（programmed death ligand 1,PD-L1）基因表达后,CIK细胞对其体外抑癌的作用。方法:分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),加入细胞因子(cytokine,CK),体外细胞因子诱导为杀伤细胞(cytokine induced killer cells,CIK cells)。将已构建的PD-L1 shRNA 重组质粒 pGPU6/PD-L1,应用脂质体转染法转染入A549细胞。RT-PCR法检测PD-L1基因的表达;Western blotting法检测PD-L1蛋白的表达;CCK8法检测CIK细胞对各组A549细胞的杀伤率。结果:成功将pGPU6/PD-L1转染入A549细胞;RT-PCR结果显示pGPU6/PD-L1使A549细胞PD-L1基因表达水平降低;Western blotting 结果显示 pGPU6/PD-L1 转染A549细胞使 PD-L1蛋白表达减少;CCK8结果显示 pGPU6/PD-L1能够增强CIK细胞对A549细胞的体外抑瘤能力。结论:下调肺癌细胞A549的PD-L1 mRNA表达,MTT证明能够增强CIK细胞对其体外杀伤作用。     

SHIP1 基因过表达非小细胞肺癌细胞系的建立及其对细胞增殖能力的影响

目的：观察SHIP1 对NSCLC细胞增殖的影响。方法：由NCBI Gene 数据库查询获得人SHIP1 基因CDS区，插至载体pTSB-CMV-MCS-SBP-3Flag-EGFP，构建SHIP1 真核过表达质粒；进一步利用其构建SHIP1 过表达慢病毒。用该慢病毒感染A549、SPCA-1 和PC-9 细胞株，获得SHIP1 稳定过表达NSCLC细胞系。Western blotting 和qRT-PCR分别从蛋白水平和mRNA水平检测SHIP1 的表达变化。采用MTT法和克隆形成实验检测过表达SHIP1 的PC-9 细胞增殖活力和克隆形成能力。Western blotting检测AP-1 蛋白复合体各组分的表达。结果：SHIP1 真核过表达质粒经测序证实构建成功。稳定过表达SHIP1 的A549、SPCA-1 和PC-9 细胞，在荧光显微镜下可见均一表达绿色荧光。与阴性对照组比较，细胞中SHIP1 在mRNA（P<0.01）及蛋白水平均明显升高。在PC-9 细胞中，过表达SHIP1 使细胞增殖、克隆形成能力降低（均P<0.01），p-c-Jun、FosB 等表达降低。结论：成功构建了稳定过表达SHIP1 的A549、SPCA-1和PC-9 细胞模型；过表达SHIP1可通过抑制AP-1 家族蛋白抑制NSCLC细胞增殖能力。     

RNAi沉默肺腺癌A549细胞系PD-L1基因表达对其增殖和凋亡的影响

目的:沉默肺癌细胞系A549的程序性死亡配体1(programmed death ligand 1,PD-L1)基因,观察其对A549细胞增殖和凋亡的影响。方法:构建PD-L1 shRNA重组质粒p GPU6/PD-L1,并应用脂质体转染法将其转染入A549细胞。RT-PCR法检测PD-L1基因的表达;Western blotting法检测PD-L1蛋白的表达;MTT法检测p GPU6/PD-L1对A549细胞增殖的影响;AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测p GPU6/PD-L1对A549细胞凋亡的影响。结果:成功将p GPU6/PD-L1转染入A549细胞;RT-PCR结果显示p GPU6/PD-L1使A549细胞PD-L1基因表达水平降低;Western blotting结果显示p GPU6/PD-L1转染A549细胞使PDL1蛋白表达减少;MTT结果显示p GPU6/PD-L1能够抑制A549细胞增殖;AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测结果显示p GPU6/PD-L1能够诱导A549细胞凋亡。结论:p GPU6/PD-L1能够下调肺癌细胞A549 PD-L1的表达,抑制细胞增殖,并诱导细胞凋亡。     

山萘酚通过下调ERRα 抑制非小细胞肺癌A549 细胞的侵袭和迁移

目的:探讨山奈酚（kaempferol）对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC）A549 细胞侵袭和迁移的影响及其作用机制。方法：A549 细胞培养完成后,CCK-8 法检测不同浓度山奈酚对A549 细胞增殖的影响,Transwell 和划痕实验检测A549 细胞侵袭和迁移能力,Western blotting 检测EMT相关蛋白的表达,qRT-PCR和Western blotting 检测山奈酚对雌激素相关受体α（estrogen related receptor alpha, ERRα）mRNA和蛋白表达的影响。构建ERRα 过表达载体pLV-ERRα 转染A549 细胞后,Transwell实验、划痕愈合实验和Western blotting 检测A549 细胞侵袭、迁移和EMT相关蛋白的表达情况。结果：山奈酚浓度依赖性抑制A549 细胞增殖,选择5、10 和20 μmol/L山奈酚进行后续实验。经山奈酚处理后,A549 细胞侵袭细胞数目显著减少、划痕愈合率显著降低、N-cadherin 和Snail-2 的表达显著下调,E-cadherin 的表达显著上调,ERRa mRNA 和蛋白水平显著降低（均P<0.01）。转染pLV-ERRα 后,过表达ERRα 的A549 细胞的侵袭细胞数、划痕愈合率均显著增加,细胞中N-cadherin、Snail-2 表达上调,而E-cadherin 的表达下调（均P<0.05 或P<0.01）;该细胞再经山奈酚处理后,上述各指标均发生逆转变化（均P<0.05 或P<0.01）。结论：山奈酚通过抑制ERRα 降低NSCLC A549细胞侵袭和迁移能力,并抑制其EMT,为肺癌的临床治疗提供了实验依据。     

非小细胞肺癌组织中高表达的miR-1269 对肺癌细胞A549 生物学行为的影响

目的:探讨miR-1269 在非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer, NSCLC）组织中的表达和对人NSCLC A549 细胞生物学特性的影响及其作用机制。方法：选取2017 年1 月至2018 年1 月在河北医科大学第四医院胸外科进行首次手术切除的34例新鲜NSCLC 癌组织及相应的癌旁组织,应用qRT-PCR 检测NSCLC 癌组织及相应的癌旁组织中miR-1269 的表达水平。将miR-1269 mimics 和mimics NC转染至A549 细胞后,应用MTS实验、细胞划痕实验和Transwell 实验检测A549 细胞增殖、迁移和侵袭能力,流式细胞术检测其细胞周期的变化。生物信息学软件预测miR-1269 的靶基因,并通过Western blotting 和双荧光素酶报告基因实验验证miR-1269 对靶基因的调控作用。采用Western blotting 检测已转染的A549 细胞的细胞周期依赖性激酶抑制剂p21、细胞周期蛋白D2 以及上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白ZEB2 和E-cadherin 的表达情况。结果：NSCLC癌组织中miR-1269 的表达水平显著高于对应的癌旁组织（2.81±2.27 vs 1.61±1.36,P<0.05）。miR-1269 mimics 转染组A549 细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著高于空白对照组和mimics NC转染组（均P<0.01）。转染miR-1269-mimics 的A549 细胞S期细胞比例明显高于mimics NC转染组[ （46.54±1.57）% vs（23.32±3.15）%,P<0.01]。miR-1269 可与FOXO1 基因3’端非翻译区的结合位点相结合,且过表达miR-1269 后,A549 细胞中FOXO1 的表达水平及荧光素酶报告基因的活性均明显降低（均P<0.01）。miR-1269 mimics 转染组A549 细胞中p21、E-cadherin 蛋白表达水平降低（均P<0.05）,而CyclinD2、ZEB2 蛋白表达水平升高（均P<0.05）。结论：miR-1269 在NSCLC组织中表达上调,并且能够促进A549 细胞的增殖、迁移、侵袭能力和影响细胞周期进程;其作用机制可能与靶向调控抑癌基因FOXO1 的表达有关。     

基因通过 NF-κB途径抑制非小细胞肺癌A549细胞的迁移和侵袭能力

目的:研究桥接整合因子1(bridging intergrator-1,Bin1)基因过表达对非小细胞肺癌细胞株A549细胞迁移和侵袭能力的影响,并初步探讨其作用机制.方法:通过基因转染技术,利用阳离子脂质体将含有人全长Bin1基因序列的真核表达质粒CMV-MCS-GFP-SV40-Neomycin-Bin1转染到A549细胞株,分别设置空白对照组及空质粒转染组,利用RT-PCR和West-em blotting分别检测各处理组细胞中Bin1基因和蛋白表达水平.通过细胞划痕实验、Transwell侵袭实验分别检测Bin1过表达对A549细胞迁移、侵袭能力的影响;Western blotting实验检测Bin1过表达对A549细胞内NF-κB磷酸化水平和迁移相关蛋白E-钙黏着蛋白、N-钙黏着蛋白、MMP-9表达水平的影响.结果:与空白对照组和空质粒转染组相比,Bin1转染组A549细胞中Bin1基因和蛋白表达水平均明显升高(P＜0.05);Bin1转染组细胞迁移、侵袭能力均较空白质粒组和空白对照组明显下降[穿膜细胞数:(50.50±3.15) vs (124.00±4.25),(130.00±4.37)个;均P＜0.05];与空白转染组和空白对照组相比,Bin1转染组细胞内NF-κB表达水平明显上调(P＜0.05)而p-NF-κB表达明显下调(P＜0.05),N-钙黏着蛋白、MPP-9明显下调(P＜0.05),E-钙黏着蛋白明显上调(P＜0.05).结论:Bin1过表达可以抑制A549细胞的迁移及侵袭能力,其机制可能与NF-κB途径的失活及细胞迁移侵袭相关蛋白表达变化有关.     

CTEN通过TGF-β1促进非小细胞肺癌细胞紫杉醇耐药的作用及机制研究

目的:探讨CTEN通过TGF-β1促进非小细胞肺癌（NSCLC）细胞紫杉醇耐药的作用和分子机制。方法:采用逐步增加剂量间歇作用的方法诱导非小细胞肺癌紫杉醇耐药细胞系并命名为A549/R,采用定量PCR和Western blotting检测耐药细胞和亲本细胞中CTEN和TGF-β1 mRNA及蛋白的表达,应用Lipofectamine 2000分别将CTEN高表达质粒pcmv-CTEN及其对照质粒pcmv转染至非小细胞肺癌A549细胞,分别为高表达组和对照组,分别用定量PCR和Western blotting检测CTEN和TGF-β1 mRNA及蛋白水平的变化;MTT法检测A549细胞对紫杉醇的敏感性及细胞增殖。应用Lipofectamine 2000分别将CTEN干扰质粒siCTEN及其对照siNC转染至紫杉醇耐药细胞系A549/R细胞,分别为干扰组和对照组,分别用定量PCR和Western blotting检测CTEN和TGF-β1 mRNA及蛋白水平的变化;MTT法检测A549/R细胞对紫杉醇的敏感性及细胞增殖。应用Lipofectamine 2000分别将TGF-β1干扰质粒siTGF-β1及其对照质粒siNC转染至非小细胞肺癌A549细胞,分别为干扰组和对照组,分别检测两组细胞中TGF-β1 mRNA及蛋白水平的表达情况,然后再分别用Lipofectamine 2000将CTEN高表达质粒pcmv-CTEN转染入两组细胞,MTT法检测A549细胞对紫杉醇的敏感性及细胞增殖。结果:成功构建在5 μg/mL紫杉醇中稳定生长的非小细胞肺癌耐药细胞系A549/R。定量PCR和Western blotting显示,CTEN和TGF-β1 mRNA及蛋白在紫杉醇耐药细胞系A549/R中的表达明显高于在其亲本细胞系A549中的表达;与对照组相比,高表达CTEN组的A549细胞中TGF-β1表达上升,细胞对紫杉醇的敏感性降低,细胞增殖增强;与对照组相比,低表达CTEN组的A549/R细胞中TGF-β1表达降低,细胞对紫杉醇的敏感性升高,细胞增殖减弱;在A549细胞中低表达TGF-β1后再过表达CTEN,其促进紫杉醇耐药及细胞增殖的作用也明显减弱。结论:CTEN具有促进非小细胞肺癌A549的紫杉醇耐药,促进细胞增殖的作用,其发生机制可能与上调TGF-β1的表达有关。     

RNA干扰沉默 PIN1 对肺癌A549细胞增殖、细胞周期和成瘤的影响

目的： 应用RNA干扰技术沉默肺癌A549细胞中 PIN1 （protein interacting with N1MA1）基因的表达,探讨其对A549细胞增殖、细胞周期和裸鼠成瘤能力的影响。 方法: 构建靶向 PIN1 基因的shRNA真核表达质粒pGPU6-GFP-Neo-PIN1和无义对照质粒pGPU6-GFP-Neo,以脂质体法转染A549细胞,G418筛选稳定沉默 PIN1 基因的细胞株。Real-time PCR和Western blotting验证 PIN1 基因在mRNA和蛋白水平的表达,MTT法和流式细胞术检测A549细胞增殖和细胞周期分布。将稳定沉默 PIN1 的A549细胞与对照细胞皮下接种裸鼠,观察接种后肿瘤生长情况。 结果: 成功构建了pGPU6-GFP-Neo-PIN1载体,转染A549细胞并筛选获得稳定克隆。稳定转染pGPU6-GFP-Neo-PIN1的A549细胞中 PIN1 mRNA表达量较pGPU6-GFP-Neo转染组下降了893%;蛋白表达同时也显著抑制。 PIN1 基因沉默组的A549细胞增殖速率明显下降（P<0.01）,细胞出现G1期阻滞。小鼠体内实验显示, PIN1 沉默的A549细胞在裸鼠体内成瘤能力降低（P<0.01)。结论: pGPU6-GFP-Neo-PIN1质粒稳定转染肺癌A549细胞能有效沉默 PIN1 基因的表达,从而抑制A549细胞的增殖、影响细胞周期和抑制成瘤能力。     

NDV-HN致人肺腺癌A549细胞凋亡的实验研究

摘 要：［目的］ 探讨NDV-HN诱导人肺腺癌A549细胞凋亡的相关机制。［方法］ （1）构建包含绿色荧光素蛋白（GFP）及NDV-HN的慢病毒sfGFP-HN载体,用293V细胞包装慢病毒Lv-sfGFP-HN,用293V细胞进行空载质粒转染组（空载组）慢病毒包装,命名为Lv-sfGFP;（2）以空载组A549-sfGFP细胞和空白组A549为对照,用慢病毒转染方法建立稳定表达NDV-HN蛋白的A549细胞株,即A549-sfGFP-HN细胞株,RT-PCR、Western blot检测A549细胞NDV-HN蛋白的表达;（3）分别在A549-sfGFP-HN和A549两组细胞中加入顺铂,流式细胞术检测细胞凋亡;（4）在基因水平和蛋白水平上分别用RT-PCR和Western blot检测各组细胞凋亡相关蛋白Bcl-2的表达。［结果］ （1）Lv-sfGFP-HN和Lv-sfGFP慢病毒分别转染A549细胞后,只在转染组A549-sfGFP-HN细胞检测到NDV-HN蛋白。（2）转染组A549-sfGFP-HN细胞凋亡率明显高于空白组A549细胞 (P＜0.01),转染组A549-sfGFP-HN细胞加入顺铂后,其细胞凋亡率明显增加。（3）转染组A549-sfGFP-HN细胞与空载质粒转染组A549细胞和空白组A549细胞相比,凋亡相关蛋白Bcl-2表达量明显下调(P＜0.01)。［结论］ 慢病毒转染NDV-HN到A549细胞后导致A549-sfGFP-HN细胞出现凋亡,且与Bcl-2下调有关。转染NDV-HN的肺癌细胞联合使用抗癌药物顺铂,增加了肺癌细胞凋亡率。     

KiSS-1抑制骨肉瘤MG63细胞的侵袭和迁移

摘 要　目的：探讨人肿瘤转移抑制基因KiSS-1对人骨肉瘤MG63细胞侵袭、迁移能力的影响。方法:构建KiSS-1表达质粒pSNAV2.0-KiSS-1。pSNAV2.0-KiSS-1质粒转染骨肉瘤MG63细胞,经G418筛选稳定表达KiSS-1基因的MG63细胞。应用real-time PCR、Western blotting检测KiSS-1 mRNA和蛋白的表达。Transwell小室法检测MG63细胞的侵袭力,millicell小室、细胞划痕愈合实验检测KiSS-1基因对MG63细胞迁移能力的影响。结果:成功建立pSNAV2.0-KiSS-1质粒并稳定转染MG63细胞（MG63-KiSS-1细胞）,MG63-KiSS-1细胞高表达KiSS-1 mRNA和蛋白。转染KiSS-1质粒后的MG63细胞侵袭力显著降低（P<0.05）;millicell法、细胞划痕愈合实验证实转染KiSS-1质粒后的MG63细胞迁移力也明显降低（P<0.05）。结论:KiSS-1基因能显著抑制人骨肉瘤MG63细胞的侵袭和迁移能力,在骨肉瘤的转移中起重要作用。     

siRNA干扰MT1H基因对A549/DDP细胞耐药性的逆转

目的：探讨siRNA干扰金属硫蛋白1H（metallothionein 1H,MT1H）基因逆转A549/DDP细胞耐药的可行性。方法：采用RT-PCR方法检测MT1H基因在A549和其顺铂耐药株A549/DDP细胞中的表达;将针对MT1H的siRNA导入A549/DDP细胞;用RT-PCR和斑点印迹方法分析MT1H基因表达情况;MTT法观察细胞顺铂耐药性;TUNEL、流式细胞术检测顺铂诱导细胞凋亡率;免疫细胞化学分析凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。结果：MT1H在A549/DDP细胞中高表达但不在A549细胞中表达;A549/DDP细胞转染48 h后,与对照组比较,MT1HsiRNA转染组MT1H mRNA和蛋白表达均明显下调,细胞对DDP的药物敏感性明显提高,DDP诱导凋亡率明显增加,Bcl-2表达明显下降,Bax表达无变化。结论：MT1H基因沉默能降低Bcl-2表达,增强顺铂对A549/DDP细胞凋亡诱导作用,有效逆转A549/DDP细胞耐药。     

MLN4924通过抑制类泛素化通路上调人肺腺癌A549细胞中PD-L1的表达

目的:探究MLN4924对肺腺癌A549细胞中程序性死亡-配体1(PD-L1)表达的影响及其可能的内在机制。方法:体外培养A549细胞,按(0、0.25、0.5、0.75、1、5、10μmol/L)MLN4924分组分别处理24、48、72 h后,CCK-8法检测细胞增殖抑制率,作图并计算各组半数抑制浓度(IC₅₀),流式细胞术检测PD-L1的表达,选择最适时间72 h及其IC₅₀用于后续实验。后续实验按(0、0.469μmol/L)MLN4924分组培养72 h, Western blot法检测FBXW2蛋白、肌段同源盒2(MSX2)蛋白、Y-染色体性别决定基因盒2(SOX2)蛋白、PD-L1蛋白表达,qPCR法测定PD-L1 mRNA表达。结果:MLN4924在24、48、72 h的IC₅₀值分别为(1.976、 0.647、0.469)μmol/L;与对照组相比,实验组A549细胞PD-L1表达均上调,呈时间-浓度依赖性。与对照组相比,实验组A549细胞FBXW2、SOX2蛋白表达降低,MSX2蛋白、PD-L1 m...     

STC1基因对A549细胞放射敏感性影响

目的 探讨斯钙素-1(STC1)基因对人肺癌A549细胞增殖凋亡及放射敏感性影响。方法 将合成的STC1-siRNA及不具有干扰作用的siRNA (阴性对照组)经Lipofectamine^TM2000转染人肺癌A549细胞,并设置空白组,通过Western blotting检测转染48 h后各组细胞STC1的蛋白表达。用克隆形成实验检测A549细胞经STC1-siRNA和照射处理后的增殖情况,用CCK8法检测细胞经STC1-siRNA和STC1-siRNA+8 Gy处理后的活力,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。用Western blotting检测ki67、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、STAT3和磷酸化的信号转导与转录因子3(p-STAT3)的蛋白表达。结果 STC1-siRNA转染的A549细胞STC1的蛋白表达低于空白组(P<0.05)。与单纯照射组比较,转染STC1-siRNA后的增敏比明显升高。与空白组比较,STC1-siRNA组细胞活力及ki67和p-STAT3的蛋白表达均降低,细胞凋亡率和Bax蛋白表达均升高;与STC1-siRNA组比较,STC1-siRNA+8 Gy组细胞活力及ki67和p-STAT3蛋白表达均降低,细胞凋亡率和Bax蛋白表达均升高(P<0.05)。结论 抑制STC1基因表达可增强非小细胞肺癌的放射敏感性并下调STAT3信号通路。     

IQGAP1 在食管鳞状细胞癌中的表达及其对TE-2 细胞恶性生物学行为的影响

[摘要] 目的：探讨具有IQ 结构域的GTP 激酶活化蛋白1（Ras GTPase-activating-like protein, IQGAP1）在食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）组织与细胞中的表达及其对TE-2 细胞增殖及侵袭能力的影响。方法: 收集2015 年1 月至2016 年12 月郑州大学附属肿瘤医院125 例ESCC手术切除的癌及癌旁组织标本,以及ESCC细胞系TE-2、TE-3、ECA109 和正常食管上皮细胞株Het-1A。用免疫组化染色法检测癌组织中IQGAP1 的表达,分析其表达水平与临床病理特征的关系;用qPCR和Western blotting 检测ESCC细胞中IQGAP1 mRNA和蛋白的表达。用si-IQGAP1（阳性转染组）、si-CTRL（阴性对照组）质粒转染TE-2 细胞,用MTT法、Transwell 小室法和Western blotting 分别检测沉默IQGAP1 对TE-2 细胞增殖、侵袭能力以及上皮钙黏蛋白和神经钙黏蛋白表达的影响。结果: IQGAP1 在ESCC组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织（P<0.05）,其高表达与肿瘤分期和分级密切相关（均P<0.05）;IQGAP1 mRNA和蛋白在TE-2、TE-3、ECA109 细胞中表达水平显著高于Het-1A细胞（均P<0.05）。沉默IQGAP1 后,与阴性对照组和空白组比较,阳性转染组TE-2 细胞中IQGAP1 mRNA及蛋白的表达水平明显下降（均P<0.05）;细胞的增殖和侵袭能力显著降低（均P<0.05）,上皮钙黏蛋白表达水平升高（P<0.05）,神经钙黏蛋白表达水平下降（P<0.05）。结论: IQGAP1 在ESCC组织中高表达,敲减IQGAP1 可抑制ESCC细胞的增殖和侵袭能力,其在ESCC的发生发展过程中起重要的作用。     

桥接整合因子1在上皮性卵巢癌组织和细胞中的表达及其临床意义

目的：探讨桥接整合因子1(BIN1)在上皮性卵巢癌(EOC)组织中的表达及其临床意义,以及BIN1对EOC细胞A2780增殖、迁移和侵袭的影响。方法：收集2017年7月至2018年1月河北医科大学第四医院手术切除的67例EOC患者的肿瘤组织及同期因其他妇科疾病手术切除的30例非肿瘤患者的卵巢组织(正常对照组)标本。用免疫组织化学染色法检测EOC组织和非肿瘤卵巢组织中BIN1蛋白的表达水平,χ²检验分析BIN1表达与患者临床病理特征之间的关联,Kaplan-Meier法分析BIN1表达与患者的无病生存期(DFS)和总生存期(OS)之间的关系。用qPCR和WB法检测EOC细胞SKOV3、A2780和人卵巢上皮细胞IOSE80中BIN1 m RNA和蛋白的表达水平。利用基因转染技术将BIN1质粒CMV-MCS-GFP-SV40-NeomycinBIN1和空载体质粒CMV-MCS-GFP-SV40-Neomycin分别转染到A2780细胞以构建过表达BIN1细胞及其对照,用qPCR和WB法分别检测转染细胞中BIN1 mRNA和蛋白的表达水平,CCK-8、划痕愈合和Tran...     

BAG-1蛋白在衣霉素诱导人肺癌A549细胞内质网应激及提高顺铂敏感性中的作用

目的:体外观察低剂量衣霉素对人肺腺癌A549细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的诱导作用,以及此过程中Bcl-2结合抗凋亡基因1(Bcl-2 associated athanogene 1,BAG-1)表达的变化;同时,观察衣霉素作用后A549细胞对顺铂敏感性的变化以及此过程中BAG-1蛋白表达的变化.方法:采用蛋白质印迹法检测低剂量衣霉素作用A549细胞后ERS标志性蛋白GRP78及抗凋亡蛋白BAG-1的表达变化;MTT法测定衣霉素作用后顺铂对A549细胞的半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50)变化;FCM法检测低剂量衣霉素作用后A549细胞对顺铂的敏感性变化;蛋白质印迹法检测衣霉素作用前后顺铂对A549细胞中BAG-1和procaspase-12蛋白表达的影响.结果:1.25 μg/mL衣霉素作用A549细胞8h后,能诱导细胞发生ERS,即ERS标志性蛋白GRP78表达上调,同时BAG-1蛋白表达也明显上调(P均＜0.05).衣霉素诱导A549细胞ERS能增加细胞对顺铂的敏感性(P＜0.05).细胞发生ERS前,1.25、2.5和5 μg/mL 3个质量浓度的顺铂均上调BAG-1蛋白的表达(P均＜ 0.05),但2.5和5μg/mL顺铂诱导BAG -1蛋白上调量均小于1.25 μg/mL组(P＜0.05);细胞发生ERS后,与单纯ERS未给予顺铂干预的细胞组比,1.25、2.5和5μg/mL 3个质量浓度的顺铂均下调BAG -1蛋白的表达(P均＜0.05),且下调量与顺铂浓度呈正比.2.5和5μg/mL顺铂能通过ERS途径诱导细胞发生凋亡,在此过程中BAG-1和procaspase-12蛋白表达均下调(P均＜0.05).结论:BAG-1蛋白可能是ERS和顺铂诱导肺癌细胞凋亡的一个重要调控因子之一,且ERS凋亡途径可能是顺铂诱导肺癌细胞凋亡的重要途径之一.     

miR-1180-5p通过激活CDKN1A基因表达抑制前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的：研究微小RNA-1180-5p（miR-1180-5p）对前列腺癌细胞株VCAP和LNCaP恶性生物行为的影响及可能的作用机制。方法：合成dsControl （dsControl 组）和miR-1180-5p（miR-1180-5p 组）,分别转染至两个前列腺癌细胞株VCAP和LNCaP。采用qPCR 和Western blotting 分析转染后各组细胞CDKN1A、Cyclin D1 和CDK6 mRNA及蛋白的表达变化,采用流式细胞术、MTT法、平板克隆实验和Transwell 实验分别检测细胞周期分布、增殖活力、克隆形成能力、细胞迁移和侵袭能力。结果：qPCR结果显示,相比dsControl,转染miR-1180-5p 后VCAP 和LNCaP 细胞中CDKN1A mRNA 表达明显上调(P<0.01);Cyclin D1 和CDK6 mRNA表达明显下调(P<0.05 或P<0.01)。Western blotting 与qPCR 结果相符。转染miR-1180-5p 后VCAP和LNCaP 位于G0/G1 期的细胞比例增加(P<0.01),而位于S 期和G2/M期的细胞比例减少(P<0.05),细胞周期被阻滞在G0/G1 期。转染miR-1180-5p 后,两种前列腺癌细胞增殖活力较dsControl 组明显降低(P<0.05),miR-1180-5p 组两种细胞的克隆数量明显较少（P<0.01）,同时miR-1180-5p 组两组细胞迁移和侵袭能力均下降（P<0.01）。结论：miR-1180-5p 能显著激活前列腺癌细胞中CDKN1A基因的表达,从而抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性生物行为。     

活化T细胞核因子5 对人胃癌MGC803 细胞增殖及凋亡能力的影响

目的:探讨活化T 细胞核因子5（nuclear factor 5 of activated T cells, NFAT5）对人胃癌MGC803 细胞增殖及凋亡能力的影响及其可能的机制。方法：设计并合成3 条靶向NFAT5 基因的siRNA（siRNA2567、siRNA2714 和siRNA4562）及1 条与NFAT5 基因无同源性的阴性对照siRNA（NC-siRNA）,脂质体介导转染人胃癌MGC803 细胞后,采用Real-time PCR检测分析细胞中NFAT5 mRNA 表达水平的变化,进而筛选出有效抑制NFAT5 基因表达的siRNA（NFAT5-siRNA）。NFAT5-siRNA 转染MGC803 细胞48 h 后,进一步采用Real-time PCR和Western blotting 验证并检测细胞中NFAT5 和S100A4 mRNA及蛋白表达水平的变化,流式细胞术和CCK-8 法分析抑制NFAT5 表达对细胞增殖及凋亡的影响。结果: 转染siRNA2567 对NFAT5 mRNA的表达抑制最为明显（P<0.01）,siRNA2567 被验证为NFAT5-siRNA。转染NFAT5-siRNA 48 h 后,NFAT5 和S100A4 mRNA及蛋白的表达水平均明显降低（P<0.05）;与NC-siRNA 组相比较,NFAT5-siRNA 组MGC803 细胞的增殖率在72 h 和96 h 均显著降低（P<0.01）;NFAT5 基因沉默48 h 后,MGC803 细胞的凋亡率由（2.7±0.2）%上升至（7.9±0.2）%（P<0.01）。结论: NFAT5-siRNA 能有效沉默人胃癌MGC803 细胞中NFAT5 基因表达,在抑制细胞增殖率的同时能够有效促进细胞凋亡,该作用可能通过调控S100A4 表达实现。