骨髓间充质干细胞玻璃体腔移植对大鼠青光眼模型视神经的保护作用

目的：探讨骨髓间充质干细胞玻璃体腔移植对大鼠青光眼模型的神经保护作用。

方法：提取大鼠原代骨髓间充质干细胞并进行鉴定; Lewis大鼠分别随机分为3组：对照组、青光眼模型组和骨髓间充质干细胞组,并制作青光眼大鼠模型：左眼为实验眼(青光眼),右眼为对照眼,并进行鉴定; 然后进行骨髓间充质干细胞玻璃体腔移植; HE染色观察视网膜组织形态; 免疫荧光法检测视网膜神经节细胞数量; TUNEL染色观察视网膜神经节细胞凋亡情况; Western blot检测视网膜组织中IGF1和BDNF蛋白表达情况。

结果：大鼠实验眼的眼内压均明显高于对照眼(P<0.01),表明青光眼大鼠模型均建造成功; 青光眼模型组大鼠视网膜神经纤维排列不整齐,视网膜神经节细胞数量和视网膜厚度显著低于对照组(P<0.01),视网膜神经节细胞凋亡数量显著高于对照组(P<0.001); 骨髓间充质干细胞组大鼠视网膜神经纤维细胞排列较整齐,视网膜神经节细胞数量和视网膜厚度明显高于青光眼模型组(P<0.05),视网膜神经节细胞凋亡数量明显低于青光眼模型组(P<0.05); 青光眼模型组大鼠视网膜中IGF1和BDNF蛋白表达量明显低于对照组(P<0.01),骨髓间充质干细胞组大鼠的视网膜中IGF1和BDNF蛋白表达量高于青光眼模型组(P<0.05)。

结论：骨髓间充质干细胞玻璃体腔移植能改善大鼠青光眼,可以保护视网膜神经节细胞。     

双丹明目胶囊对糖尿病大鼠模型视网膜VEGF家族表达的影响

目的：观察双丹明目胶囊对糖尿病大鼠模型视网膜VEGF家族因子VEGF-a、VEGF-b、VEGF-c蛋白表达的影响。

方法：将40只雄性SD大鼠,采用随机数字法分为A空白组、B模型组、C双丹明目组、D阳性对照组4组,每组10只20眼。将B、C、D三组实验大鼠采用STZ 50mg/kg的剂量一次性大鼠尾静脉注射法建立糖尿病视网膜病变大鼠模型,造模后1wk开始连续灌胃用药,灌胃后4wk,处死动物,免疫组化法检测视网膜组织中VEGF-a、VEGF-b、VEGF-c的表达。

结果：成模后用药第4wk,模型组、双丹明目组、阳性对照组视网膜中VEGF-a、VEGF-b、VEGF-c蛋白表达平均灰度值均低于正常组,平均光密度均高于正常组,其中模型组与正常组比较,差异均具有统计学意义(P<0.01); 双丹明目组、阳性对照组VEGF-a、VEGF-b、VEGF-c表达的平均灰度值均高于模型组(P<0.05),平均光密度值均低于模型组(P<0.01)。

结论：双丹明目胶囊能明显降低VEGF家族中VEGF-a、VEGF-b、VEGF-c在糖尿病模型大鼠视网膜中的表达,对其视网膜有一定的保护作用。     

驻景丸加减方对形觉剥夺性近视小鼠视网膜厚度及细胞凋亡的影响

目的：探讨驻景丸加减方对形觉剥夺性近视小鼠视网膜厚度及细胞凋亡的影响。

方法：将72只3周龄C57BL/6J小鼠随机分为对照组1、模型组1、干预组1、对照组2、模型组2及干预组2,每组12只小鼠,前三组实验进行3wk,后三组实验进行6wk,除对照组1和对照组2外,所有小鼠均用半透明眼罩遮盖右眼诱导形觉剥夺性近视动物模型,干预组1在造模同时而干预组2则在实验3wk后灌胃驻景丸加减方混悬液0.546g/(kg·d)(0.1mL/d),其余组小鼠灌胃等量生理盐水0.1mL/d,实验前后均测眼轴,实验结束时取小鼠视网膜行HE染色用于观察视网膜各层厚度改变,免疫组织化学(IHC)和western blotting(WB)用于检测Bcl-2和Caspase3蛋白的表达。

结果：在实验结束时模型组1的眼轴比对照组1显著增加(P<0.01),干预组1的眼轴显著低于模型组1(P<0.01),模型组2的眼轴比对照组2显著增加(P<0.01),干预组2的眼轴明显低于模型组2(P<0.01); 模型组1的NFL和ONL的厚度比对照组1显著变薄(P<0.01),模型组1的INL厚度比对照组1显著变薄(P<0.05),干预组1的NFL、INL和ONL厚度较模型组1显著增加(P<0.05); 模型组2的NFL、INL和ONL的厚度比对照组1显著变薄(P<0.01); IHC检测显示Bcl-2蛋白平均光密度模型组1显著低于对照组1(P<0.05),干预组1显著高于模型组1(P<0.01),模型组2显著低于对照组2(P<0.01),干预组2显著高于模型组2(P<0.01); Caspase3蛋白平均光密度模型组1显著高于对照组1(P<0.01),干预组1显著低于模型组1(P<0.01),模型组2显著高于对照组2(P<0.05),干预组2显著低于模型组2(P<0.01); WB检测证明,Bcl-2的蛋白相对表达水平模型组1显著低于对照组1(P<0.01),干预组1显著高于模型组1(P<0.01),模型组2显著低于对照组2(P<0.01),干预组2显著高于模型组2(P<0.01); Caspase3的蛋白相对表达水平模型组1显著高于对照组1(P<0.01),干预组1显著低于模型组1(P<0.01),干预组2显著低于模型组2(P<0.05)。

结论：驻景丸加减方可通过调控凋亡相关蛋白Bcl-2和Caspase3的表达,减轻近视形成过程中及已形成近视小鼠视网膜细胞凋亡,从而起到干预形觉剥夺近视小鼠视网膜厚度变薄的作用。     

高糖环境下内脏脂肪素在人视网膜色素上皮细胞中的作用

目的：观察体外高糖诱导环境,对人视网膜色素上皮细胞中内脏脂肪素(Visfatin)的表达影响,以及研究高糖环境下重楼皂苷I(Polyphyllin I)对Visfatin表达情况的影响。

方法：人视网膜色素上皮细胞培养后分3组,正常对照组、高糖组和高糖加Polyphyllin I药物干预组,干预培养12h后进行检测。正常对照组：5.5mmol/L葡萄糖浓度常规培养; 高糖组：将25mmol/L的高糖加入培养基建立模型; 高糖加Polyphyllin I药物干预组：高糖25mmol/L和3μg/L Polyphyllin I药物加入培养基。免疫荧光染色法观察人视网膜色素上皮细胞中Visfatin和血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达; 实时荧光定量PCR检测上皮细胞中Visfatin和VEGF mRNA的表达; Western-blot法检测上皮细胞中Visfatin和VEGF蛋白的表达。

结果：免疫荧光检测发现Visfatin和VEGF在正常组视网膜色素上皮细胞中表达呈弱阳性。但在高糖组视网膜色素上皮中可见Visfatin和VEGF呈强阳性表达。药物干预组中Visfatin和VEGF荧光较高糖组明显减弱。RT-PCR显示高糖组Visfatin mRNA表达水平较正常组和干预组明显增高(t=4.24、3.89,均P<0.05)。高糖组VEGF mRNA表达水平较正常组和干预组明显增高(t=3.53、2.57,均P<0.05)。Western-blot结果示Visfatin蛋白水平,高葡萄糖组表达量显著高于正常对照组(t=3.62,P=0.01),干预组表达低于高糖组(t=3.79,P<0.01)。

结论：高糖环境可刺激视网膜色素上皮细胞中Visfatin的表达增加,Polyphyllin I可抑制高糖环境下视网膜色素上皮细胞中Visfatin的表达,可能为治疗糖尿病视网膜病变提供新的思路。     

Apelin-13通过调节YAP入核抵抗缺氧诱导的视网膜Müller细胞凋亡

目的：探讨Apelin-13在缺氧诱导的视网膜Müller细胞凋亡中的作用及机制。

方法：以视网膜Müller细胞为研究对象,实验分为对照组、缺氧组和实验组,对照组细胞培养于正常环境中,缺氧组细胞培养于缺氧环境中,实验组细胞培养于缺氧环境中并以Apelin-13(1μmol/L)处理,MTT法检测细胞活力变化,结晶紫染色法观察细胞形态,免疫荧光染色法观察细胞GFAP和YAP的表达情况,TUNEL染色检测细胞凋亡并计算凋亡指数,蛋白印记实验检测p-LATS1、p-YAP、LATS1及YAP蛋白表达变化。

结果：提取分离的Müller细胞传代后贴壁生长,细胞呈长梭形、多角形、圆形等形态,细胞质丰富,细胞核呈圆形,细胞GFAP表达阳性。0.1、1、10μmol/L Apelin-13处理显著抑制缺氧诱导的Müller细胞活力下降(P<0.05或P<0.01)。与对照组相比,缺氧组细胞凋亡指数明显升高(P<0.01); 而与缺氧组相比,实验组凋亡指数明显降低(P<0.01)。对照组和缺氧组细胞p-LATS1和p-YAP蛋白表达无明显差异; 与缺氧组相比,实验组细胞p-LATS1和p-YAP蛋白表达明显降低(P<0.01)。对照组和缺氧组细胞核YAP蛋白表达无明显差异; 与缺氧组相比,实验组YAP细胞核表达明显升高(P<0.01)。

结论：Apelin-13能抵抗缺氧诱导的视网膜Müller细胞凋亡,该作用可能与调节YAP入核有关。     

生长激素释放肽对糖尿病大鼠视网膜病变的保护作用

目的：探讨生长激素释放肽(ghrelin)对糖尿病大鼠视网膜病变的影响并研究其保护作用。

方法：雄性SD大鼠18只分为对照组、模型组、ghrelin组,采用HE染色观察视网膜形态,TUNEL染色观察细胞凋亡,透射电镜观察视网膜色素上皮层超微结构,免疫组化检测氧化应激指标,ELISA检测炎性因子含量。

结果：形态学观察结果显示,ghrelin可减轻视网膜组织损伤程度,降低糖尿病大鼠视网膜组织细胞凋亡; 免疫组化结果显示,与模型组比较,ghrelin组大鼠视网膜组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性升高,丙二醛(MDA)含量下降(P<0.05); ELISA结果显示,模型组细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)及白细胞介素-1β(IL-1β)表达较对照组升高(P<0.05),ghrelin干预后,炎症因子表达均下降,与模型组比较有差异(P<0.05)。

结论：Ghrelin治疗糖尿病大鼠后,能有效延缓糖尿病大鼠视网膜病变的进程,其作用机制与降低氧化应激水平、抑制炎症反应相关。     

DHA玻璃体注射对ARMD大鼠模型光感受器细胞凋亡和PI3K/Akt通路的影响

目的：探讨二十二碳六烯酸(DHA)玻璃体注射对年龄相关性黄斑变性(ARMD)大鼠光感受器细胞凋亡和磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)通路的影响。

方法：大鼠随机分为空白对照组、模型组、低剂量DHA组(L-DHA组)、中剂量DHA组(M-DHA组)和高剂量DHA组(H-DHA组)。采用光损伤法建立干性ARMD大鼠模型。HE染色观察视网膜病理变化，TUNEL法检测视网膜细胞凋亡情况，透射电镜观察视网膜神经节细胞超微结构，酶联免疫吸附法测定视网膜组织TNF-α和IL-6水平，Western Blot检测视网膜组织p-PI3K、p-Akt、Bax、Bcl-2、p-NF-κBp65和cleved-caspase-3蛋白表达。

结果：与空白对照组比较，模型组大鼠视网膜总厚度、外核层和内核层厚度、视网膜组织p-PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白表达均降低(P<0.05)，神经节细胞层和外核层细胞凋亡指数、视网膜组织TNF-α和IL-6水平、Bax、p-NF-κBp65和cleved-caspase-3蛋白表达均升高(P<0.05)。与模型组比较，M-DHA组和H-DHA组大鼠视网膜总厚度、外核层和内核层厚度、视网膜组织p-PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白表达均升高(P<0.05)，神经节细胞层和外核层细胞凋亡指数、视网膜组织TNF-α和IL-6水平、Bax、p-NF-κBp65和cleved-caspase-3蛋白表达均降低(P<0.05)。

结论：DHA可能通过激活PI3K/Akt通路抑制ARMD大鼠光感受器细胞凋亡。     

五苓散对糖尿病视网膜病变大鼠血-视网膜屏障的保护作用

目的：探讨五苓散对糖尿病视网膜病变(DR)大鼠血-视网膜屏障的保护作用及其机制。

方法：SD雄性大鼠50只随机分为空白组、模型组、高剂量组、低剂量组、阳性对照组,每组10只,采用高脂高糖饮食联合腹腔注射链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型。高剂量组和低剂量组大鼠采用五苓散水煎液灌胃,模型组和空白组大鼠采用等量生理盐水灌胃,阳性对照组大鼠右眼球内注射康柏西普。给药12wk后,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠血清C反应蛋白(CRP)和可溶性细胞间黏附分子1(sICAM-1)表达水平,HE染色观察视网膜组织结构,伊文思蓝(EB)渗漏试验观察大鼠血-视网膜屏障通透性,免疫组织化学法检测血管内皮生长因子(VEGF)在视网膜中的表达。

结果：模型组大鼠空腹血糖水平和视网膜组织EB渗透量、CRP和sICAM-1表达均较空白组明显升高,高剂量组大鼠视网膜组织EB渗透量、CRP和sICAM-1表达均低于低剂量组和阳性对照组(均P<0.05)。模型组大鼠视网膜神经节细胞层结构紊乱,视网膜水肿,VEGF表达明显升高; 与低剂量组和阳性对照组比较,高剂量组大鼠视网膜组织神经节细胞排列较清晰,水肿减轻。

结论：五苓散能有效降低糖尿病大鼠血清炎症因子水平,降低视网膜组织中VEGF的表达,减轻水肿,保护血-视网膜屏障。     

六味地黄汤对老化模型大鼠视网膜组织铁死亡通路的影响

目的：观察六味地黄汤对老化模型大鼠视网膜组织中铁蛋白、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)表达水平的影响。

方法：将45只SD大鼠随机分成空白组、模型组、中药组，各15只。空白组腹腔注射生理盐水，模型组、中药组腹腔注射D-半乳糖\〖500 mg/(kg·d)\〗，同时，中药组灌服六味地黄汤\〖6.75 g/(kg·d)\〗，空白组、模型组灌服等体积生理盐水，连续8 wk。检测各组大鼠视网膜组织中铁蛋白、SLC7A11、GSH、GPX4的表达水平。

结果：模型组较空白组大鼠视网膜组织中铁蛋白表达增高(P<0.05)，GSH、SLC7A11、GPX4表达降低(P<0.05)。中药组较模型组大鼠视网膜组织中GSH、SLC7A11、GPX4表达增高(P<0.05)。

结论：六味地黄汤可能通过调控铁死亡途径发挥延缓视网膜老化的作用。     

姜黄素对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞增殖及VEGF和NF-κB p65表达的抑制作用

目的：观察不同浓度姜黄素对体外高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞(HRCECs)增殖及血管内皮生长因子(VEGF)、核因子-κB(NF-κB)p65表达的影响。

方法：用高糖培养基模拟糖尿病环境建立HRCECs体外高糖模型,将培养的细胞分为：正常对照组、高糖对照组、高糖+20、40、80μmol/L姜黄素组,分别用CCK-8法检测姜黄素干预后HRCECs的增殖能力,用Western-blot及免疫细胞化学法检测VEGF、NF-κB p65的表达。

结果：CCK-8法结果示：与正常对照组比较,高糖显著促进HRCECs增殖(P<0.01),各浓度姜黄素作用12、24、48h后与高糖对照组比较,细胞增殖均有明显抑制作用(P<0.01),且呈浓度与时间依赖性。Western-blot结果示：与正常对照组比较,高糖对照组中VEGF-A、NF-κB p65表达显著增加(P<0.01),各浓度姜黄素作用12、24、48h后与高糖对照组比较,VEGF-A、NF-κB p65的表达显著减少,且随着浓度增加、时间延长抑制作用增强,各加药组间两两比较均有差异(P<0.01)。免疫细胞化学法结果示：与正常对照组相比,高糖对照组VEGF表达显著增加(P<0.01),各浓度姜黄素干预24h后与高糖对照组比较,VEGF表达逐渐下降(P<0.01),各加药组间两两比较均有差异(P<0.01)。

结论：姜黄素可呈浓度与时间依赖性地抑制高糖诱导的HRCECs增殖以及VEGF、NF-κB p65的表达,这种增殖抑制作用可能与其下调VEGF、NF-κB p65表达有关。     

Intraocular expression of thymosin β4 in proliferative diabetic retinopathy

Purpose: To examine an association between thymosin β4 as potentially angioproliferative factor and proliferative diabetic retinopathy. Methods: The clinical study part included 62 patients with proliferative diabetic retinopathy (PDR) (study group) and 24 patients with non‐diabetic pre‐retinal membranes (control group). All patients underwent pars plana vitrectomy. We examined the thymosin β4 concentration in vitreous and plasma; and the expression of thymosin β4, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and CD31 (PECAM‐1 or Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule) and the levels of thymosin β4 mRNA and vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA in the excised membranes. The experimental study part consisted of 24 Sprague–Dawley rats with streptozotocin‐induced diabetes mellitus and 24 age‐matched control animals without diabetes. We determined the mRNA concentrations of thymosin β4, VEGF and GFAP in the rat retinas. Results: In the clinical study part, the vitreal and plasma thymosin β4 concentrations were significantly higher in the study group than control group (p = 0.04 and p = 0.01, respectively), and were significantly (p = 0.028) correlated with each other. Co‐expression of thymosin β4 and CD31 was observed in the diabetic fibrovascular membranes. Thymosin β4 mRNA and VEGF mRNA levels were significantly (p < 0.01) higher in diabetic membranes than in non‐diabetic membranes. In the experimental study part, the diabetic retinas showed co‐localization of thymosin β4 and GFAP. The mRNA levels of thymosin β4, VEGF and GFAP were significantly (p < 0.01) higher in diabetic rats than in control animals. Conclusions: Thymosin β4 was produced in intraocular fibrovascular membranes of patients with PDR and in rats with experimental diabetes mellitus. Thymosin β4 may play a role in diabetic retinal neovascularization.     

Expression and effect of proline hydroxylase domain 2 in retina of diabetic rats

AIM: To observe the expression of proline hydroxylase domain 2 (PHD2) in the retina of diabetic rats and investigate the relationship between PHD2 and relevant intraocular vascular proliferation factors. METHODS: Sixty male specific pathogen free (SPF) Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into two groups: the diabetic group and the control group. The rats in the diabetic group were intraperitoneally injected with 60 mg/kg (0.60 mL/100g) of streptozotocin to induce a diabetic rat model. The rats in the control group were injected with an equal volume of sodium citrate buffer solution by the same method. Hematoxylin-eosin (HE) staining and immumofluorescence (IF) method were adopted to observe the pathological changes of retinal tissues and the expression of PHD2, glial fibrillary acidic protein (GFAP), vascular endothelial growth factor (VEGF) by 8wk. RT-PCR method was applied to detect the expressions of mRNA of PHD2, VEGF and GFAP. The relationship between PHD2 and other vascular proliferation factors was analyzed. RESULTS: HE staining showed that there was the retinal tissue edema in the diabetic group, and the arrangement was in disorder, and proliferation could be seen. IF staining: in the retina of normal rats, PHD2 was not expressed, GFAP and VEGF were mainly expressed in astrocytes; while in the diabetic rats, PHD2, GFAP and VEGF staining showed strong positivity in all retinal layers, mainly in neurogliocytes. PHD2 was co-expressed with VEGF and GFAP. The mRNA expression levels of PHD2, GFAP and VEGF in the diabetic group were obviously higher than that in the control group,respectively 1.83 times, 1.75 times and 2.08 times. The difference had statistical significance (P<0.01). CONCLUSION: The high expression of PHD2 in the retina of early-stage diabetic rats might result from secretion of neurogliocytes induced by local high-concentration blood glucose, thus promoting the expression of VEGF and GFAP. PHD2 plays an important role during the occurrence of diabetic retinopathy.     

VEGF和PEDF在糖尿病大鼠视网膜脉络膜中的表达

目的:通过免疫组织化学法比较正常大鼠及糖尿病大鼠视网膜、脉络膜组织中VEGF和PEDF的表达情况及相互关系。方法:选取健康雄性Wistar大鼠,随机分成糖尿病组和正常对照组(M0),用链脲佐菌素大剂量一次性腹腔注射诱导1型糖尿病模型。成模后大鼠随机平均分成1mo(M1),2mo(M2),3mo(M3)及5mo(M5)组,免疫组织化学法检测VEGF和PEDF在各组大鼠视网膜及脉络膜的表达。结果:M1大鼠VEGF在视网膜及脉络膜的表达均与M0无明显差别;M2大鼠VEGF在脉络膜有阳性表达(33.3%),在视网膜的表达与M0无明显差别;M3大鼠VEGF在脉络膜有阳性表达(55.6%),在视网膜的表达与M0比较有明显差别(33.3%);M5大鼠VEGF在视网膜及脉络膜阳性表达(88.9%);M1和M2大鼠视网膜PEDF表达与M0比较无明显差别,各组脉络膜均无PEDF表达;M3和M5大鼠视网膜PEDF表达均较M0减弱,且随病程延长表达逐渐减弱(P<0.05),各组脉络膜均无PEDF表达;随着糖尿病病程延长,VEGF/PEDF比值逐渐增大,与M0相比有显著统计学差异(P<0.01)。结论:随着糖尿病病程的延长,VEGF在视网膜及脉络膜的表达均逐渐增强,而PEDF与之相反,在视网膜的表达逐渐减弱,且VEGF/PEDF比值逐渐增大,提示VEGF和PEDF均与糖尿病病程密切相关。     

CDK抑制剂对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞胶质增殖及新生血管形成的抑制作用

目的　探讨CDK抑制剂对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞胶质增殖及新生血管形成的影响。方法　雄性SD大鼠30只，随机分成对照组、糖尿病组、治疗组(CDK抑制剂SCH727965)，每组各10只。后两组大鼠采用单次腹腔注射55 mg·kg^-1链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)的方法诱导糖尿病模型。模型诱导成功后，治疗组玻璃体内注射SCH727965 8 μL(3 nmol·L^-1)。12周后，免疫荧光检测三组大鼠视网膜胶质纤维酸性蛋白质(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达，免疫组织化学检测视网膜色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)表达，Western blot检测GFAP、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、PEDF蛋白相对表达量。结果　与对照组GFAP (100.00±0.00)%、VEGF(100.00±0.00)%、PEDF(38.26±0.52)%、PCNA(9.34±0.47)%表达相比，糖尿病组GFAP(168.24±2.72)%、VEGF(156.79±1.75)%、PCNA(16.11±0.34)%表达均明显增加，PEDF(23.72±0.71)%表达明显降低(均为P<0.01)；而与糖尿病组相比，治疗组GFAP(124.37±3.01)%、VEGF(118.36±1.98)%、PCNA(12.05±0.67)%表达均明显降低，PEDF(8.22±0.36)%表达明显增加(均为P<0.05)。结论　SCH727965可下调大鼠糖尿病状态下视网膜GFAP、VEGF、PCNA表达，上调PEDF表达，进而抑制Müller细胞增殖及新生血管形成。     

色素上皮衍生因子对糖尿病大鼠视网膜谷氨酸代谢的影响

目的 观察色素上皮衍生因子(PEDF)对糖尿病大鼠视网膜谷氨酸代谢的影响.方法 Sprague_Dawley大鼠78只,分为模型组、模型对照组、PEDF干预组(干预组)、干预对照组,实验结束时去除血糖恢复鼠和实验期间死亡鼠,每组以12只大鼠作为统计样本.模型组、干预组、干预对照组大鼠采用链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型.模型组大鼠不作任何干预,模型对照组为相同月龄的正常大鼠.干预组大鼠左眼玻璃体腔注射0.1 μg/μl的PEDF 5.0μl,干预对照组大鼠左眼玻璃体腔注射相同容积的磷酸盐缓冲液.采用蛋白免疫印迹法(Western bolt)和实时荧光聚合酶链式反应(PCR)法检测视网膜L-谷氨酸-L-门冬氨酸转运体(GLAST)表达的变化,高压液相色谱法(HPLC)观察视网膜谷氨酸的含量变化.将体外培养的大鼠视网膜Müller细胞随机分为对照组、实验组、PEDF干预组(干预组)和干预对照组,荧光免疫法和实时荧光PCR法检测Müller细胞GLAST表达的改变,根据[3H]标记的D,L-谷氨酸摄入量判断Müller细胞的摄取功能.结果 实时荧光PCR法和Western bolt检测结果显示,相对于模型对照组大鼠,模型组大鼠视网膜GLAST表达降低(实时荧光PCR法:t=8.86,P＜0.01;Western blot:t=3.42,P＜0.05),视网膜谷氦酸含量升高(t=4.01,P＜0.05);干预组大鼠视网膜GLAST表达与干预对照组视网膜GLAST表达比较,干预组大鼠视网膜GLAST的表达升高(实时荧光PCR法:t=3.56,P＜0.05;Western blot:t=3.52,P＜O.05);视网膜谷氨酸含量下调(t=4.36,P＜0.05).实时荧光PCR法和荧光免疫法检测结果显示,高糖可以降低视网膜Müller细胞GLAST的表达(实时荧光PCR法:t=3.48,P＜O.05;荧光免疫法:t=4.72,P＜O.05);[3H]标记的D,L-谷氨酸摄人量结果显示,高糖可以下调视网膜Mü1ler细胞GIAST的功能(t=3.81,P＜0.05);经PEDF处理后,可以明显改善高糖状态下视网膜Müller细胞GLAST的表达(实时荧光PCR法:t=6.82,P＜O.01;荧光免疫法:t=3.72,P＜0.05)和对谷氨酸的摄取功能(t=4.14,P＜0.05).结论 PEDF可通过改善糖尿病大鼠视网膜Müller细胞中GLAST功能从而改善谷氨酸循环,抑制神经节细胞的死亡.

Abstract：

Objective To observe the effect of pigment epithelium-derived factor(PEDF)on glutamate metabolism in diabetic rat retina.Methods 78 Sprague-Dawley rats were randomly divided into the model group,model control group,PEDF intervention group and intervention control group.There were some dead and euglycemia rats at the end of experiment,so only 12 rats in each group were included in the statistical analysis.The diabetic retinopathy rat model of the model,PEDF intervention and intervention control group were induced with streptozotocin injection.The rats in the model group were not intervened.The monthly-age matched normal rats of model group were in the model control group.The left eyes of rats were received intravitreal injection with 5μl(0.1μg/μl)PEDF(PEDF intervention group)or 5μlphosphate buffer solution(intervention control group).The expressions of L-glutamate/L-aspartate transporter in retina were analyzed by western blot and real time RT-PCR techniques and glutamate content in retina was analyzed by high-pressure liquid chromatography(HPLC).Cultured rat Mailer cells were divided into the control,experimental,PEDF intervention and intervention control group,GLAST expressions were detected by fluorescence immunofluorescence and real-time RT-PCR techniques.The glutamate up-take activity of Müller cells was determined by intracellular[3H] labeled D,L-glutamate concentration with scintillation counting.Results Western blot and real-time RT-PCR showed that GLAST expression decreased(real-time RT-PCR:t=8.86,P＜0.01;Western blot:t=3.42,P＜0.05).glutamate content increased(t=4.01,P＜0.05)in model group compared with the model control group:GLAST expression increased(real-time RT-PCR:t=3.56,P＜0.05;Western blot:t=3.52,P＜0.05),glutamate content decreased(y=4.36,P＜0.05)in the PEDF intervention group compared with the intervention control group.Real-time RT-PCR and fluorescence immunofluorescenee showed that high glucose down-regulate GLAST expressions in Müller cells(real-time RT-PCR:t=3.48,P＜0.05;fluorescence immunofluoreseence:t=4.72,P＜0.05)and impair glutamate up-take activity of Müller cells(t=3.81,P＜0.05).Under high glucose conditions,PEDF up-regulated GLAST expression significantly(real-time RT-PCR:t=6.82,P＜0.01;fluorescence immunofluorescence:t=3.72,P＜0.05)and ameliorated the glutamate up-take activitv of Mailer cells(t=4.14,P＜0.05).Conclusions In diabetic rats,PEDF may improve the activitv of GLAST in Müller cells,thus ameliorate retinal glutamate metabolism and inhibit death of retinal ganglion cells.     

长链非编码RNA 母系表达基因3调控miR-34a对糖尿病视网膜病变Müller细胞活化及炎症因子分泌的影响

目的　探讨母系表达基因3（maternally expressed gene 3,MEG3）对糖尿病视网膜病变（DR）Müller细胞的活化及炎症因子分泌的影响及机制。方法　高脂饮食联合链脲佐菌素腹腔注射构建小鼠DR体内模型。高糖刺激人视网膜Müller细胞株MIO-M1构建DR体外模型。免疫荧光化学染色及Western blot检测小鼠视网膜及Müller细胞中胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。Western blot及酶联免疫吸附实验（ELISA）检测小鼠视网膜及细胞培养基上清中血管内皮生长因子（VEGF）蛋白的表达。ELISA检测小鼠视网膜及细胞培养基上清中IL-1β蛋白的表达。分别或同时向Müller细胞中转染pcDNA-MEG3及miR-34a mimic对其表达进行干预。qRT-PCR检测MEG3 mRNA及miR-34a表达。结果　与正常对照组小鼠比较,DR组小鼠视网膜中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均增多（均为P<0.05）,MEG3 mRNA表达降低(P<0.01)。与对照组比较,高糖组Müller细胞中MEG3 mRNA表达降低(P<0.01),而GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均升高（均为P<0.05）。与高糖组比较,高糖+pcDNA-MEG3组中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均降低（均为P<0.05）。与正常对照组比较,DR组小鼠视网膜及高糖刺激的Müller细胞中miR-34a表达均升高(均为P<0.05)。与pcDNA组比较,pcDNA-MEG3组中miR-34a表达减少(P<0.01)。与pcDNA+NC mimic组比较,pcDNA+miR-34a mimic组中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均升高（均为P<0.05）,而pcDNA-MEG3+NC mimic组中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均减少（均为P<0.05）。与pcDNA-MEG3+miR-34a mimic组比较,GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达水平均升高（均为P<0.05）。结论　MEG3在DR小鼠视网膜及高糖刺激的Müller细胞中表达均降低,其可通过负向调控miR-34a抑制Müller细胞活化及炎症因子的分泌。过表达MEG3可能成为DR治疗的新靶点。     

双丹明目胶囊对DR大鼠视网膜血管形态学及VEGF表达的影响

目的:观察糖尿病视网膜病变大鼠模型视网膜血管的病理变化及VEGF表达变化,初步评价双丹明目胶囊抑制视网膜血管新生效应。方法:将双丹明目胶囊作用于糖尿病视网膜病变大鼠,通过与正常组、模型对照组、阳性对照组的比较,电镜下观察双丹明目胶囊对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜组织的影响,HE染色后光镜下观察视网膜结构,并采用免疫组织化学法检测大鼠视网膜中VEGF的表达。结果:经双丹明目胶囊治疗2mo后,双丹明目组大鼠视网膜组织轻度水肿,毛细血管周细胞水肿,线粒体轻度肿胀,结构稍欠清晰,部分内皮细胞轻度增生。除正常组外各组视网膜VEGF表达增加,以模型对照组最为明显,且双丹明目组和阳性对照组与模型对照组VEGF的表达有明显差异(P<0.01)。结论:双丹明目胶囊能有效地改善糖尿病大鼠视网膜微血管改变,减轻视网膜各层结构水肿、坏死情况,改善超微结构改变,可以抑制DR大鼠视网膜VEGF表达。     

Effect of ginsenoside-Rg3 on the expression of VEGF and TNF-α in retina with diabetic rats

AIM: To investigate the effect of ginsenoside-Rg3 on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in retina with diabetic rats and its roles in preventing neovascularization in diabetes. METHODS: Sixty male Wistar rats were divided into 3 groups randomly: negative control group, diabetic control group and ginsenoside-Rg3 treatment group (5mg/kg, 0.2mg/mL) followed by establishing diabetic model. The expression of VEGF and TNF-α were measured after 8 weeks. RESULTS: There were significant differences among negative control group, diabetic control group and ginsenoside-Rg3 treatment group in the expression of VEGF and TNF-α (F =129.363, 211.992; all the P <0.01). VEGF and TNF-α expression were significantly higher in diabetic control group and ginsenoside-Rg3 treatment group than that in negative control group (P <0.01), with a significant reduction in ginsenoside-Rg3 treatment group than that in diabetic control group (P <0.01). CONCLUSION: Ginsenoside-Rg3 can down-regulate the expression of VEGF and TNF-α in retina, which may interfere in the development of diabetic retinopathy.     

驻景方对病理性近视脉络膜新生血管VEGF表达的影响

目的: 观察中药驻景方对氪激光诱导的病理性近视脉络膜新生血管VEGF表达的影响,探讨中药驻景方对病理性近视脉络膜新生血管的干预作用。方法: 将3周龄雌性三色豚鼠45只随机选出15只为空白对照组,剩余豚鼠均带头套右眼形觉剥夺诱导病理性近视,A超检影(诱导失败者剔除出组)并随机分为模型组、中药组,双眼行氪激光光凝。中药组于光凝后第2d开始连续灌胃21d,3.285g/(kg·d),每次1.5mL,1次/d。21d后行脉络膜铺片、HE染色、免疫荧光、免疫组织化学观察。结果: 形觉剥夺4wk后右眼均诱导出高度近视,且眼轴较左眼增长;脉络膜铺片及免疫荧光示模型组右眼CNV面积及视网膜VEGF表达均明显高于左眼(P<0.01),中药组右眼CNV的面积及VEGF的表达较模型组右眼减少(P<0.01);免疫组织化学结果显示,中药组右眼VEGF的平均光密度值(0.0589±0.0146)较模型组右眼(0.0972±0.0507)减少(P<0.01)。结论: 中药驻景方可抑制氪激光诱导的病理性近视脉络膜新生血管的生长及VEGF的表达。