四烯甲萘醌保护成骨细胞氧化损伤的作用研究

目的 考察四烯甲萘醌(MK₄)对成骨细胞氧化损伤的保护作用,阐明MK₄防治骨质疏松作用机制。方法 采用过氧化氢(H₂O₂)刺激小鼠成骨细胞系（MC3T3-E1）氧化应激模型,考察细胞活力、ALP活性和骨结节面积,DCFH-DA法检测活性氧(ROS)水平,JC-1检测线粒体膜电势,Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡率,RT-PCR法考察氧化应激相关基因FoxO1、FoxO3、SOD、Bcl-2和bax等的mRNA表达。结果 10 μmol/L四烯甲萘醌能显著提高H₂O₂刺激的成骨细胞增殖、ALP活性、骨结节形成面积和增强细胞膜电势,显著降低H₂O₂刺激的成骨细胞内丙二醛和活性氧水平,同时显著降低成骨细胞凋亡率和细胞凋亡因子bax/Bcl-2的mRNA表达水平,显著提高抗氧化酶SOD和转录因子FoxO1、FoxO3的mRNA表达。结论 四烯甲萘醌可通过调控FoxO通路保护成骨细胞氧化损伤和通过下调bax/Bcl-2比例,降低成骨细胞凋亡。     

人参皂苷Rg1对H2O2诱导的HaCaT细胞氧化损伤保护作用研究

目的 观察人参皂苷Rg₁对H₂O₂诱导的HaCaT细胞氧化损伤保护作用,并探讨其机制。方法 体外培养HaCaT细胞, H₂O₂诱导细胞建立氧化应激损伤模型,分为空白组、H₂O₂损伤组、人参皂苷Rg₁保护组。细胞增殖与毒性检测试剂盒(CCK-8)检测细胞存活率,Hochest染色法检测细胞凋亡情况,活性氧检测试剂盒测定细胞活性氧(ROS)水平,Western blot检测细胞中caspase-3、caspase-6、caspase-8、GAPDH蛋白表达。结果 H₂O₂诱导HaCaT细胞半数抑制浓度为100 μg?mL^-1;与H₂O₂损伤组比较,5、10和15mg?L^-1人参皂苷Rg₁预处理后,HaCaT细胞存活率明显升高(P<0.05),细胞核皱缩损伤状态明显改善,细胞凋亡数量显著减少。同时,人参皂苷Rg₁预处理可显著降低HaCaT细胞ROS水平,下调凋亡相关标志蛋白-活化型caspase-3、caspase-6、caspase-8蛋白表达水平。结论 人参皂苷Rg₁对H₂O₂诱导的HaCaT细胞氧化应激损伤具有一定的保护作用,其机制可能与增强细胞清除自由基能力及抑制凋亡相关。     

没药甾酮对H2O2损伤PC12细胞的保护作用

探讨没药甾酮(guggulsterone)对氧化应激损伤PC12细胞的保护作用。以过氧化氢(hydrogen peroxide，H₂O₂)损伤PC12细胞为氧化应激损伤模型， 维生素E为对照， 采用四甲基偶氮唑蓝［3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide，MTT］法检测细胞增殖状况； 试剂盒检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)及一氧化氮(nitric oxide，NO)的释放； DCFH法和Fura 2-AM法检测细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)和Ca²⁺的含量； 碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测细胞凋亡； 罗丹明123(rhodamine 123，Rh 123)染色FCM检测细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane protential，MMP)。结果表明， 没药甾酮(0.1～10 μmol·L^-1)可使200 μmol·L^-1 H₂O₂作用24 h后的PC12细胞生长抑制率下降； 细胞外LDH和NO， 细胞内ROS和Ca²⁺含量降低； 明显抑制200 μmol·L^-1 H₂O₂作用12 h后诱导的PC12细胞凋亡和线粒体膜电位降低作用，没药甾酮(0.1～10 μmol·L^-1)使细胞凋亡率由24.3%下降至18.4%、 15.9%、 11.8%。实验结果表明, 没药甾酮对氧化应激损伤PC12细胞具有保护作用， 其机制可能为降低细胞内ROS含量， 进而抑制LDH和NO释放， 降低细胞内Ca²⁺含量， 升高线粒体膜电位,减少细胞凋亡。     

M3受体对体外H2O2诱导大鼠心肌细胞凋亡的保护作用

目的探讨M₃受体激动对H₂O₂诱导的大鼠培养心肌细胞凋亡的作用，进一步阐明其机制。方法末端标记法 (TUNEL)进行细胞凋亡检测；免疫组化方法检测Bcl-2和Fas的表达；共聚焦显微镜观察［Ca²⁺］_i荧光强度变化。结果M₃受体激动剂胆碱(10 mmol·L^-1)可减少H₂O₂诱导的心肌细胞凋亡的数量，并可增加心肌Bcl-2的表达，减少Fas表达，抑制H₂O₂诱导的［Ca²⁺］_i荧光强度的升高。但预先应用4DAMP (10 nmol·L^-1)阻断M₃受体可逆转胆碱作用。结论激动M₃受体对H₂O₂诱导的心肌细胞凋亡有保护作用，其机制可能与Bcl-2和Fas表达以及下调［Ca²⁺］_i有关。     

基于能量代谢分析白藜芦醇对H2O2诱导SH-SY5Y细胞保护作用

目的 基于能量代谢探究白藜芦醇对H2O2诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞氧化损伤的保护作用。方法 选取20、10、5、1 μmol•L^-1的白藜芦醇（Res）处理SH-SY5Y细胞24 h后,加入1.2 mmol•L^-1的H₂O₂,继续培养24 h,采用MTT法测定细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,试剂盒检测糖代谢相关酶己糖激酶（HK）、磷酸果糖激酶（PFK）、丙酮酸激酶（PK）、琥珀酸脱氢酶（SDH）、乳酸脱氢酶（LDH）活力以及葡萄糖消耗量、ATP含量,Western blot法检测低氧诱导因子1α（HIF-1α）和葡萄糖转运体1（GLUT-1）表达。结果 1.2 mmol•L^-1的H₂O₂造成SH-SY5Y细胞氧化损伤,细胞活力降低,细胞凋亡率升高（P<0.01）;与H₂O₂氧化损伤组相比,20、10、5 μmol•L^-1白藜芦醇组细胞活力升高,细胞凋亡率显著降低（P<0.01）;PFK、PK、SDH活力及ATP含量、葡萄糖消耗量显著升高,HK活力和细胞外LDH活力明显降低（P<0.01）;GLUT-1表达量显著升高,HIF-1α表达量显著降低（P<0.01）。结论 20、10、5 μmol•L^-1的白藜芦醇调控GLUT-1和HIF-1α蛋白表达,提高细胞糖代谢酶活力,增加产能,对H₂O₂诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤发挥保护作用。     

过氧化氢诱导人肝癌细胞BEL7402产生氧化应激细胞模型的建立

目的 研究过氧化氢(H₂O₂)构建体外人肝癌细胞BEL7402氧化应激模型的最佳作用浓度及时间。方法 采用噻唑蓝(MTT)染色法检测以10、100和1 000 μmol/L的H₂O₂处理0、2、4、6、8、10、12和24 h后BEL7402细胞的存活率;采用双氢罗丹明123(DHR123)探针法、单细胞凝胶电泳技术和分光光度法检测以100 μmol/L H₂O₂处理BEL7402细胞4 h后线粒体活性氧(ROS)含量、DNA损伤、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性。结果 100 μmol/L H₂O₂处理BEL7402细胞4 h后,其存活率为(43.44±5.74)%,与10 μmol/L H₂O₂处理组(92.77±5.51)%相比,细胞存活率降低,差异有统计学意义(P<0.01);ROS含量结果显示100 μmol/L H₂O₂处理BEL7402细胞40 min时其体内的ROS含量达到峰值,之后呈下降趋势;与健康对照组比较,100 μmol/L H₂O₂组OTM值升高(P<0.05),MDA含量升高,差异有统计学意义(P<0.01),SOD和GSH-Px活性均下降(P<0.05或P<0.01)。结论 100 μmol/L H₂O₂、预处理4 h,可成功构建BEL7402细胞体外氧化应激模型,可为通过氧化应激机制抗肝病新药的研发奠定基础。     

岩藻黄素抗H2O2诱导WI-38细胞早衰的作用研究D*

目的：探讨岩藻黄素是否具有抑制H₂O₂引起的WI-38细胞早衰的活性。方法：WI-38细胞在添加岩藻黄素的培养基中培养一定时间后经H₂O₂处理诱导发生早衰,用MTT法检测细胞活力,SA-β-半乳糖苷酶染色法检测细胞内衰老相关的β-半乳糖苷酶活性。 结果：300 μM H₂O₂处理WI-38细胞20 min可成功建立早衰细胞模型。与空白对照组相比,H₂O₂处理组细胞活力明显降低,SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞数明显增多。5 μM和10 μM岩藻黄素组细胞活力明显高于H₂O₂处理组,SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞数较H₂O₂组明显减少。 结论：岩藻黄素能够抑制由H₂O₂处理引起的细胞早衰,具有一定的抗衰老作用。     

脑蛋白水解物对神经细胞损伤修复活力测定方法的研究

目的 评价脑蛋白水解物对H₂O₂诱导的PC12细胞损伤的修复效果,建立一种脑蛋白水解物注射液的生物活性检测方法。方法 以脑蛋白水解物的进口代表药物注射用脑蛋白水解物为例,采用PC12细胞培养,分析不同细胞接种浓度、不同浓度的H₂O₂损伤细胞、不同浓度脑蛋白水解物对抗干预的影响;采用MTT比色法对样品组、对照组和损伤组的细胞进行染色后,用酶标仪测定OD值,计算修复率,以评价脑蛋白水解物对模型细胞PC12损伤的保护作用;同时将该损伤修复评价方法用于国产脑蛋白水解物的生物活性检测。结果 在8×10⁴~12×10⁴·mL^-1细胞接种量、0.5 mmol·L^-1 H2O2损伤浓度下、60 μg·L^-1药物浓度(以含氮量计)下可成功的建立H₂O₂诱导的PC12细胞损伤模型。结论 采用该方法对8批国产脑蛋白水解物注射液样品及注射用脑蛋白水解物进行对比检测,发现对H₂O₂损伤的细胞均具有良好修复作用。     

华蟾素诱导人肝癌细胞株HepG2凋亡及其作用机制

为了观察华蟾素体外抑制肝癌细胞株HepG₂增殖、诱导细胞凋亡作用及其机制, 将不同浓度华蟾素作用于HepG₂细胞。采用MTT法观察华蟾素对HepG₂细胞的增殖抑制作用; 用Hoechst 33258染色法观察细胞凋亡的形态学改变; 以流式细胞术观察细胞的凋亡率和细胞周期的变化; 以实时荧光定量PCR技术 (real time-PCR) 和蛋白免疫印迹 (Western blotting) 法检测细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax及p53 mRNA水平和蛋白水平的表达情况。结果表明, 华蟾素对体外培养的肝癌HepG₂细胞有抑制增殖作用, 且具有剂量、时间相关性; 华蟾素可致HepG₂细胞阻滞于G₂/M期, 细胞凋亡率随药物浓度增加亦呈增长趋势; 细胞凋亡相关因子Bax及p53 mRNA和蛋白表达上调, Bcl-2的mRNA和蛋白表达下调。因此, 华蟾素可抑制肝癌细胞株HepG₂的增殖, 诱导肝癌HepG₂细胞凋亡, 其机制可能与调节凋亡相关因子Bcl-2、Bax及p53的表达有关。     

异亚丙基莽草酸对H2O2损伤血管内皮细胞的保护作用

目的研究异亚丙基莽草酸(ISA)对血管内皮细胞损伤的保护作用。方法倒置显微镜下观察细胞形态学改变,MTT比色法检测细胞活性,用硝酸还原酶法测定细胞培养液中NO的含量。放射免疫法测定细胞培养液中前列环素代谢物6-酮-前列腺素F_1α(6-keto-PGF_1α)含量,比色法测定培养液及细胞裂解液的乳酸脱氢酶(LDH)活性并计算LDH的释放率。结果ISA可明显改善H₂O₂所致的内皮细胞变形、皱缩等损伤表现。1～100 μmol·L^-1 ISA可浓度依赖性的减轻H₂O₂引起的细胞活性降低和LDH释放,并促进H₂O₂诱导的血管内皮细胞释放NO和前列环素。结论异亚丙基莽草酸对H₂O₂损伤血管内皮细胞具有保护作用。     

依达拉奉对H2O2致星形胶质细胞损伤的保护作用

目的:观察依达拉奉(EDA)对H2O2损伤后的星形胶质细胞活力的影响及其细胞内谷胱甘肽(GSH)含量、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响.方法:应用MTT法检测星形胶质细胞活力;Tietze法检测细胞内GSH含量;Western-blot法检测细胞内iNOS的表达.结果:H2O2作用24 h后可呈浓度依赖性地抑制星形胶质活力;EDA可逆转H2O2导致的星形胶质细胞活力的下降,胞内GSH含量的降低以及iNOS表达的增加.结论:EDA可改善H2O2所致的星形胶质细胞的氧化损伤.     

高效液相色谱-光化学衍生法测定湖南产莲子中黄曲霉毒素G1、G2、B1、B2

目的对不同来源的湖南产莲子中黄曲霉毒素G_1、G_2、B_2、B_1进行高效液相色谱-光化学衍生法测定。方法采用高效液相色谱–光化学衍生法,采用岛津GL Inertsil ODS-3色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇–乙腈–水(35∶13∶52),柱温35℃;光化学衍生器(254 nm)激发波长λ_(ex)=360 nm,发射波长λ_(ex)=450 nm。结果黄曲霉毒素G_1、G_2、B_2、B_1分别在6.7～33.3、11.4～56.8、10.3～51.5、4.1～20.3 pg线性关系良好;平均回收率分别为98.07%、97.72%、96.11%、99.52%,RSD值分别为1.69%、1.40%、2.72%、1.34%(n=6)。9批莲子样品中,有6批未检出黄曲霉毒素,来自于农贸市场农户自存的2批次检出黄曲霉毒素B_1,实验室塑料袋包装储存1年的1批检出黄曲霉毒素B_1、B_2,但质量分数均低于法定标准限量。结论不同来源湖南产莲子中黄曲霉毒素质量分数均低于《中国药典》2020年版规定限量。该法测定结果准确、重复性良好,可为完善莲子安全性控制和质量标准提升提供实验依据。     

高效液相色谱-荧光检测法测定沉香中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2

目的建立高效液相色谱–光化学衍生–荧光检测法测定沉香药材中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2。方法采用高效液相色谱法,通过免疫亲和柱提取和净化,荧光检测器检测。Agilent Zorbax Ecilpse Plus C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:甲醇–水(45∶55);体积流量:0.8 m L/min;柱温:30℃;进样盘温度:4℃;荧光激发波长为360 nm,发射波长为450 nm。结果黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2分别在9.3~74.4、3.0~24.0、9.3~74.4、3.5~28.0 pg线性关系良好,r均大于0.998 0;检测限分别为1.86、0.60、1.86、0.70 pg,定量限分别为7.44、2.40、7.44、2.80 pg。平均回收率分别为78%、92%、82%、99%,RSD值分别为4.4%、3.0%、4.3%、2.8%。结论所建立的方法结果准确、重复性、稳定性均良好,可用于沉香药材中黄曲霉毒素的质量控制。     

二至丸水提物对体外肝细胞损伤的保护作用

目的研究二至丸水提物（aqueous extract of Erzhi Pill,AEEP）对体外肝细胞损伤的保护作用及其机制。方法培养L-O2型肝细胞,采用H2O2和CCl4体外分别诱导肝细胞损伤,检测培养上清液中天门冬氨酸转换酶（AST）和丙氨酸氨基转换酶（ALT）水平,测定上清液中丙二醛（MDA）的含量和过氧化物岐化酶（SOD）活力,MTT法检测细胞存活和增殖活性。结果①AEEP（0.32~40μg/ml）剂量组可明显降低由H2O2升高的肝细胞培养上清液中AST和ALT水平及MDA含量,还可提高H2O2降低的肝细胞存活率和SOD活力;②AEEP（0.32~40μg/ml）剂量组可使CCl4升高的肝细胞培养上清液中ALT和ALT水平及MDA含量明显降低或恢复,还可提高CCl4降低的肝细胞存活率和SOD活力。结论提示AEEP对体外肝细胞损伤有直接保护作用,该作用可能与其抗氧化作用有关。     

Protection of l-methionine against H2O2-induced oxidative damage in mitochondria

Reactive oxygen species (ROS) is reported to be a critical pathogenic factor and mitochondria is one of the susceptible subcellular organs for oxidative damage. Methionine sulfoxide reductase A (MsrA) is a key anti-oxidant enzyme associated with cytoprotection and previous reports have revealed its importance in mitochondrial function. The anti-oxidation of MsrA is due to Met-centered redox cycle, suggesting that Met-centered redox cycle may play a critical role in mitochondrial protection. l-Methionine (l-Met), a natural amino acid with anti-oxidation activity, can mimic the effect of Met-centered redox cycle. Here, we investigated the protection of l-Met on H₂O₂-induced oxidative damage in mitochondria. Our study demonstrated that l-Met protected H₂O₂-induced injury in CHO cells. Cytoprotections of l-Met at low concentrations (1–5 mM) were abolished by dimethyl sulfoxide (DMSO), a competitive inhibitor of MsrA function, suggesting that these effects may involve the participation of MsrA. Overexpression of MsrA in CHO cells protected mitochondria from H₂O₂-induced downtrend of membrane potential and production of mitochondrial superoxide. Pre-treatment with l-Met (1 mM) produced a similar effect on the mitochondrial protection against H₂O₂. Furthermore, it was observed that topical application of l-Met can prevent 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate (TPA)-induced oxidative damage in the skin of mice. These results suggest that anti-oxidation activity of l-Met may promise a new strategy for the prevention of oxidative stress-induced damage.     

正交试验优化苦豆子多糖的双氧水脱色工艺研究

目的：优化苦豆子多糖的脱色条件。方法以多糖脱色率和多糖保留率为指标,考察双氧水（H2O2）对苦豆子多糖溶液的脱色效果。通过单因素试验考察H2O2脱色方法中双氧水加入量、脱色时间、脱色温度和pH值对苦豆子多糖脱色效果的影响,进一步采用正交试验确定苦豆子多糖脱色的最佳条件。结果 H2O2对苦豆子多糖最佳脱色条件为脱色温度60℃,调节pH 5,加入1.0%的H2O2,脱色反应3 h。在此条件下经验证,多糖脱色率和多糖保留率可分别达到29.83%、71.12%。结论 H2O2脱色具有较好的脱色效果,可为生产出高品质的苦豆子多糖提供依据。     

纳米锰锌铁氧体颗粒对L-02细胞的氧化损伤作用

目的 探讨磁性锰锌铁氧体纳米颗粒(Mn_0.5Zn_0.5Fe₂O₄)对人肝细胞株L-02的毒性作用机制。方法 Mn_0.5Zn_0.5Fe₂O₄ 800 mg·L^-1作用L-02细胞48 h,透射电镜观察细胞形态及超微结构的变化。Mn_0.5Zn_0.5Fe₂O₄ 200, 400和800 mg·L^-1作用48 h后,检测L-02细胞内丙二醛(MDA)的含量、超氧化物歧化酶(SOD)和还原型谷胱甘肽(GSH)的活性;荧光染色观察凋亡细胞形态;流式细胞术检测细胞周期及凋亡;荧光定量PCR仪检测胱天蛋白酶3 mRNA表达。结果 Mn_0.5Zn_0.5Fe₂O₄ 800 mg·L^-1作用48 h后,纳米颗粒进入细胞内,细胞膜发生破损,细胞器消失,染色体异常聚集。与正常对照组比较,Mn_0.5Zn_0.5Fe₂O₄ 200~800 mg·L^-1使细胞内MDA含量逐渐升高,SOD与GSH活性逐渐降低(P<0.05)。Mn_0.5Zn_0.5Fe₂O₄可使细胞周期发生改变,G₀/G₁期细胞百分率有降低的趋势,S期和G₂/M期细胞百分率有升高的趋势。Hoechst33258显示明显的细胞凋亡形态。Mn_0.5Zn_0.5Fe₂O₄可引起L-02细胞发生剂量依赖性的细胞凋亡,Mn_0.5Zn_0.5Fe₂O₄ 800 mg·L^-1作用48 h后,细胞凋亡率达到30.3%,是对照组细胞凋亡率(2.4%)的12.6倍。胱天蛋白酶3 mRNA表达量先增加后降低,但都明显高于正常对照组(P<0.05)。结论 Mn_0.5Zn_0.5Fe₂O₄可破坏细胞膜完整性并进入细胞内,诱导细胞发生氧化应激,改变细胞周期,引发细胞凋亡,产生细胞毒性。     

Marine natural products targeting phospholipases A2

Phospholipases A₂ (PLA₂s) form a family of enzymes catalyzing the hydrolysis of membrane phospholipids into arachidonic acid, which is the major precursor of pro-inflammatory eicosanoids. As a result, PLA₂s have been considered as potential targets in anti-inflammatory drug discovery.Marine natural products are a rich source of bioactive compounds, including PLA₂ inhibitors. Here, we review the properties of marine PLA₂ inhibitors identified since the first discovery of PLA₂ inhibitory activity in the marine natural product manoalide in the mid 1980s.     

人参皂甙Rh2体外对小鼠黑色素瘤细胞的分化诱导作用

体外实验证明人参皂甙Rh₂在10μg·ml^-1的浓度下能明显抑制B₁₆细胞的生长,并呈浓度依赖性,其IC₅₀为4.1μg·ml^-1。Rh₂在10μg·ml^-1浓度下对B₁₆细胞有较强的分化诱导作用,表现为黑色素生成能力明显增加;形态向上皮样细胞分化;细胞呈网状结构;黑色素颗粒增多,生长变缓慢。细胞动力学研究结果表明,Rh₂可使B₁₆细胞阻断在G₁期。提示Rh₂对B₁₆细胞具有分化诱导作用。     

A phospholipase A2 from Bothrops asper snake venom activates neutrophils in culture: Expression of cyclooxygenase-2 and PGE2 biosynthesis

In this study, the production of prostaglandin E₂ (PGE₂) and up-regulation in cyclooxygenase (COX) pathway induced by a phospholipase A₂ (PLA₂), myotoxin-III (MT-III), purified from Bothrops asper snake venom, in isolated neutrophils were investigated. The arachidonic acid (AA) production and the participation of intracellular PLA₂s (cytosolic PLA₂ and Ca²⁺-independent PLA₂) in these events were also evaluated. MT-III induced COX-2, but not COX-1 gene and protein expression in neutrophils and increased PGE₂ levels. Pretreatment of neutrophils with COX-2 and COX-1 inhibitors reduced PGE₂ production induced by MT-III. Arachidonyl trifluoromethyl ketone (AACOCF₃), an intracellular PLA₂ inhibitor, but not bromoenol lactone (BEL), an iPLA₂ inhibitor, suppressed the MT-III-induced AA and PGE₂ release. In conclusion, MT-III directly stimulates neutrophils inducing COX-2 mRNA and protein expression followed by production of PGE₂. COX-2 isoform is preeminent over COX-1 for production of PGE₂ stimulated by MT-III. PGE₂ and AA release by MT-III probably is related to cPLA₂ activation.