ETS1对非洲爪蛙早期胚胎发育的影响

目的:通过在非洲爪蛙胚胎中过表达ETS1探讨该基因对爪蛙胚胎早期发育的影响?方法:将克隆PCR获得的ETS1全长片段连接到质粒上,获得pCS2+-ETS1质粒;利用RT-PCR和Western blot检测ETS1 mRNA和蛋白在胚胎发育不同时期的表达情况;显微注射ETS1 mRNA入爪蛙胚胎,利用整胚原位杂交?定量PCR检测胚层标志性基因的表达;通过Western blot检测过表达ETS1对细胞凋亡和增殖的影响?结果:ETS1从受精卵时期即已开始表达,在器官形成期表达增强,过表达ETS1抑制了细胞分化以及神经胚期中胚层和外胚层标志基因表达,凋亡相关蛋白表达增加,增殖相关蛋白无明显变化?结论:ETS1表达于非洲爪蛙胚胎发育各阶段,过表达ETS1抑制了中胚层和外胚层发育,促进细胞凋亡但不影响细胞增殖?     

microRNA⁃1调控神经嵴细胞进而影响颅面发育

目的：采用基因敲除斑马鱼模型,观测microRNA?1（miR?1）对神经嵴细胞（neural crest cell,NCC）和颅面发育的影响。方法：用CRISPR/Cas9基因敲除系统敲除斑马鱼miR?1,观察其神经嵴衍生物的表型。原位杂交检测NCC诱导分化相关基因的表达,并用实时定量PCR （qRT?PCR）等检验与凋亡相关基因的表达。结果：基因敲除组斑马鱼下颌骨严重萎缩,色素细胞延迟出现。原位杂交显示,受精后24 h,tfap2a、dlx3b、ngn1和snailb表达下降。qRT?PCR结果证明miR?1影响凋亡相关基因的表达。结论：miR?1参与NCC的调控进而影响颅面发育,其可能通过凋亡相关通路而发挥作用。     

ETS1/2对非洲爪蛙胰腺发育的影响

目的：探讨ETS1/2对非洲爪蛙胚胎胰腺发育的影响。方法：设计并合成特异性抑制ETS1/2表达的反义吗啉代寡核苷酸(morpholino oligonueleitide,MO),通过显微注射的方法将MO转入爪蛙胚胎,利用整胚原位杂交和定量RT-PCR检测标志性基因的表达变化。结果：单独敲降ETS1或ETS2对爪蛙胚胎发育无明显影响,共同敲降ETS1/2后会使爪蛙胚胎发育异常,胰腺标志基因表达上升,肠道标志基因表达下降,肝脏和胃标志基因无明显变化;胰腺标志基因ngn3、igf1、foxa1的启动子区存在ETS1/2的结合位点。结论：单独敲降ETS1或ETS2对爪蛙胚胎发育无明显影响,敲降ETS1/2促进爪蛙胚胎胰腺发育,抑制肠道发育,对肝脏和胃的发育无明显影响。     

KLF7b对斑马鱼胚胎发育的影响

目的：探讨KLF7b对斑马鱼胚胎发育的影响。方法：体外转录野生型KLF7b mRNA、KLF7b 乙酰化位点突变体mRNA;设计合成特异性KLF7b反义吗啉代寡核苷酸（morpholino oligonueleitide,MO）;在1~2细胞期注射到斑马鱼胚胎体内以实现KLF7b的过表达、位点突变与敲降;观察胚胎表型并利用定量PCR检测发育相关基因的表达变化,钙黄绿素染色观察斑马鱼骨骼发育情况。结果：过表达KLF7b对斑马鱼胚胎的发育无明显影响;敲降KLF7b或注射乙酰化位点突变的KLF7b后,斑马鱼胚胎出现心包积液、体轴和头部发育的异常,肌肉发育标志基因表达下调。结论：KLF7b可通过乙酰化修饰影响斑马鱼的发育。     

Nodal信号通路相关基因NOMO1在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的:研究斑马鱼NOMO1基因在早期胚胎发育过程中的时空表达情况?方法:首先克隆斑马鱼NOMO1同源基因全长cDNA,然后运用半定量RT－PCR技术初步检测NOMO1基因在斑马鱼早期胚胎的表达情况,最后通过原位杂交技术检测NOMO1基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的时空表达情况?结果:通过半定量RT－PCR及原位杂交技术显示NOMO1从受精卵时期开始即有表达,在24 hpf(受精后24 h)之前,NOMO1基因表达广泛,并主要集中在中?内胚层?从24 hpf开始其表达主要集中于神经系统如前脑?中脑?小脑?脊索前板?眼和耳囊等处?在心脏处也有少量表达?结论:NOMO1基因对斑马鱼早期胚胎发育具有一定的作用,推测NOMO1基因影响早期心脏发育?     

脓毒症心肌病患者循环miR⁃155诊断价值的研究

目的：探讨脓毒症心肌病（sepsis?induced cardiomyopathy,SIC）早期血浆miR?155水平的变化,与血浆B型利钠肽（B?type natriuretic peptide,BNP）、肌钙蛋白T（cardiac troponin T,cTnT）的相关性,评估miR?155是否可作为早期诊断SIC的新型生物标记物。方法：收集31例江阴市人民医院心血管内科救治SIC患者入院即刻血浆样本及24例健康对照者血浆样本。逆转录实时定量PCR（qRT?PCR）检测样本miR?155的表达水平,并与cTnT和BNP进行相关性分析。qRT?PCR检测SIC患者血浆miR?155表达水平,绘制ROC曲线评估诊断价值。结果：循环miR?155在SIC患者血浆中含量较对照组增高（P=0.004）。相关性分析表明血浆miR?155含量与BNP、cTnI呈正相关;ROC曲线分析发现miR?155对SIC的诊断效能AUC为0.905。结论：SIC早期血浆中miR?155的变化水平与血浆BNP、cTnT的相关性好,有望成为SIC的早期诊断生物标记物。     

叶酸缺乏对斑马鱼体轴发育的影响

 目的 构建叶酸缺乏斑马鱼模型,观察叶酸缺乏斑马鱼胚胎的体轴发育情况,初步探讨叶酸缺乏导致胚胎体轴发育异常的机制。方法 分别应用二氢叶酸还原酶（dhfr）抑制剂甲氨蝶呤（MTX）以及二氢叶酸还原酶（dhfr）基因阻抑技术,通过下调二氢叶酸还原酶功能构建叶酸缺乏斑马鱼模型。在胚胎发育至17 hpf时在显微镜下观察胚胎的体轴偏移情况。利用特异性探针通过胚胎整体原位杂交的方法标记肝脏、胰脏以及心脏,以观察其位于中线两侧的位置。利用胚胎整体原位杂交和Real-time PCR 的方法检测与体轴发育密切相关的Nodal信号通路下游因子ntl和gsc的表达情况。结果 叶酸缺乏组一定比例胚胎存在体轴偏移以及肝脏、胰脏和心脏左右轴异位。叶酸缺乏组Nodal信号通路下游因子ntl以及gsc的表达强度无明显变化,但表达的空间模式发生改变,提示轴中胚层发育紊乱。结论 叶酸缺乏可导致斑马鱼胚胎体轴发育异常以及轴中胚层发育紊乱,但对Nodal信号通路无明显干扰作用。     

hoxb4转基因斑马鱼造血发育中rap1b基因的表达

目的 为了发现在早期造血发育中关键的调控因子,利用hoxb4转基因斑马鱼研究rap1b基因的表达变化情况,以期明确hoxb4与rap1b在早期造血发育中的关系.方法 选取过表达hoxb4的斑马鱼系为研究对象,分为3组:实验组(表达hoxb4-EGFP的斑马鱼),实验对照组(表达EGFP的斑马鱼),空白对照组(野生型斑马鱼).通过流式分选技术将实验对照组和实验组18hpf(斑马鱼胚胎受精发育18h)、24、30、36、48hpf胚胎中带有绿色荧光(enhanced green fluorescent protein,EGFP)信号的细胞分选出来,利用实时荧光定量PCR检测分选出的细胞中的rap1b基因的表达变化;然后收集野生型斑马鱼多时相胚胎,制备rap1b基因的反义mRNA探针,通过胚胎原位杂交观察探针在3组斑马鱼胚胎18、24、30、36、48hpf杂交信号表达部位.结果 qRT-PCR结果显示实验组30、36、48hpf的斑马鱼胚胎的rap1b基因的表达明显增强(P＜0.05);制备了rap1b基因的反义mRNA探针,胚胎整体原位杂交结果显示:rap1b基因在3组斑马鱼胚胎18 ～ 48 hpf之间神经发育和造血发育部位都有表达.结论 在过表达hoxb4转基因斑马鱼中rap1b基因表达有明显的升高趋势,提示rap1b基因与hoxb4基因可能共同参与调节早期造血发育过程.     

斑马鱼叶酸多聚谷氨酸合成酶基因的生物信息学特征及胚胎发育表达

目的 探索斑马鱼叶酸多聚谷氨酸合成酶（FPGS）的生物信息学特征及在胚胎发育中的表达模式。方法 利用Ensemble数据库及ClustalW程序进行序列比对,分析斑马鱼与哺乳动物FPGS蛋白之间的氨基酸同源性;利用系统发育树分析不同物种间fpgs基因的保守性;运用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析fpgs基因在斑马鱼重要器官及胚胎早期发育中的表达;运用整胚原位杂交技术检测野生型斑马鱼fpgsmRNA的表达。结果 生物信息学分析显示,斑马鱼FPGS蛋白在进化上与哺乳动物同源物高度保守。RT-PCR结果显示,斑马鱼fpgs基因不仅在胚胎的各个发育阶段均有表达,且在成鱼的脑、肝和胃组织中高表达。原位杂交结果显示,fpgs基因在斑马鱼胚胎4细胞期广泛表达,而在尾芽期开始仅在卵黄合体细胞层中表达;在斑马鱼胚胎20体节期,fpgs在产生初级造血祖细胞的中间细胞团、眼睛和后脑区域呈现特异性表达;从斑马鱼胚胎受精后48～96 h,fpgs基因在其肝脏及端脑与后脑的交界处特异性表达。结论 斑马鱼的FPGS蛋白与哺乳动物同源物高度保守,且fpgs基因在斑马鱼发育中的初级造血区、肝脏、后脑区及眼睛特异性...     

叶酸挽救乙醇致斑马鱼胚胎心脏和流出道发育异常

 目的  观察乙醇对斑马鱼胚胎心脏和流出道发育的干扰作用,并初步探讨叶酸挽救乙醇所致心脏和流出道发育异常的最佳时段和可能机制。方法  在斑马鱼胚胎发育不同时段予以乙醇处理,观察胚胎的发育异常情况。将受精后7~12 h被予以乙醇组定义为乙醇处理组。在乙醇处理组胚胎的发育不同时段给予外源性叶酸进行叶酸挽救实验,观察各叶酸干预组胚胎的发育状况,探寻叶酸挽救的最佳时段。将受精后7~12 h给予叶酸组定义为叶酸挽救组。观察并统计乙醇处理组以及叶酸挽救组的胚胎发育异常百分比、存活百分比、心脏和流出道形态及其异常百分比、心率、心室收缩指数等指标来评估胚胎的发育状况。利用荧光显微造影的方法探查心脏流出道形态,采用胚胎整体原位杂交和real-time PCR 方法检测胚胎bmp2b、tbx1的表达情况。结果  乙醇可干扰胚胎发育,乙醇处理组胚胎存在明显心脏和流出道形态异常以及心功能损害,在胚胎发育早期乙醇的干扰作用最明显。给予外源性叶酸能挽救乙醇导致的胚胎发育异常,在胚胎受精后7~12 h叶酸挽救作用最显著。乙醇处理组胚胎心脏和流出道的bmp2b、tbx1表达下降;予以叶酸干预后,乙醇处理组胚胎bmp2b和tbx1表达水平上调。结论  叶酸能有效挽救乙醇导致的心脏和流出道发育异常,其机制可能是上调乙醇处理组胚胎bmp2b、tbx1的表达水平。     

MiR-738通过Wnt信号通路调控斑马鱼心脏发育

目的：研究miR-738对模式动物斑马鱼心脏发育的影响。方法：通过全胚胎原位杂交检测miR-738的表达。在斑马鱼受精卵中显微注射miR-738前体来过表达miR-738。通过显微镜成像来检测心脏表型。通过荧光素酶报告基因检测来验证miR-738调控Lefl。结果：MiR-738在30hpf斑马鱼心脏表达。MiR-738过表达导致斑马鱼胚胎心脏显著增大。MiR-738可以抑制Lefl的表达。结论：MiR-738通过Wnt信号通路调控斑马鱼心脏发育。     

MicroRNA⁃190调控衰老相关的脂肪能量代谢稳态

目的：探究微小RNA（microRNA,miR）?190在衰老相关的能量代谢紊乱中的作用和潜在分子机制。方法：利用实时荧光定量PCR（real?time fluorescent quantitative ?polymerase chain reaction,RT?PCR）,对衰老小鼠脂肪组织中miR?190的表达水平进行检测;构建细胞衰老模型,利用RT?PCR检测脂肪细胞中miR?190的变化;利用RT?PCR检测转染miR?190的脂肪细胞中产热基因的变化;用双荧光素酶报告基因实验验证miR?190的靶基因;利用antagomir注射抑制衰老小鼠脂肪中产生miR?190,检测代谢表征。结果：衰老进程中,脂肪组织中miR?190表达升高;衰老细胞模型中,miR?190的表达同样上调;脂肪细胞中过表达miR?190会导致产热基因的表达降低;产热关键基因PRDM16是miR?190的直接靶基因;抑制衰老小鼠中miR?190的产生,可以有助于改善衰老小鼠的能量代谢稳态。结论：miR?190可能通过靶向PRDM16影响脂肪组织产热,继而影响能量代谢稳态,加速衰老。     

斑马鱼丝氨酸羟甲基转移酶1基因的生物信息学和表达分析

目的 探索斑马鱼丝氨酸羟甲基转移酶1(shmt1)基因的生物学结构和基因表达模式.方法 利用生物信息学方法对斑马鱼shmt1的基因结构、物种间同源性、物种间进化、蛋白质二级结构和三级结构等进行分析和预测,并用整胚原位杂交技术探究斑马鱼shmt1在重要器官及胚胎早期发育中的表达.结果 斑马鱼shmt1位于3号染色体(ZDB-GENE-040426-1558)上,全长15142 bp,能编码481个氨基酸,属于天冬氨酸转氨酶(AAT)超家族,其二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,且斑马鱼shmt1蛋白与其他哺乳动物同源物在进化上高度保守.反转录定量PCR(RT-PCR)结果显示,斑马鱼shmt1不仅在胚胎发育的各个时期表达,而且也在成年鱼的肾脏、心脏和性腺中高表达.原位杂交结果显示,shmt1除了在卵黄多核层、鼻翼板中脑区、视顶盖和视泡等处集中表达,还在肝脏特异性表达.结论 shmt1作为一碳代谢叶酸循环中的重要蛋白,在斑马鱼发育早期的胚胎卵黄多核层、鼻翼板中脑区、视顶盖和视泡、肝脏特异性表达.该研究为今后以斑马鱼为模型动物探究shmt1基因在器官发育中的功能研究奠定基础.     

ETS1在多巴胺能神经元发育中的作用

【立论依据】 帕金森病是第二大神经系统退行性病变,主要多发于60岁以上的老年人。其基本病理改变是特异性多巴胺能神经元因各种原因渐行性退变坏死,数量减少,致使多巴胺释放减少,但具体机制不明。从多巴胺能神经元发育的角度或许能解释多巴胺释放减少的分子机制。多巴胺神经元发育的各个阶段都有转录因子基因参与调控, 如SHH、FGF、Nurr1、Pitx3、Mash1 等。这些因子决定了多巴胺能神经元发育的命运并控制了一些重要的发育过程。作为转录因子,ETS1表达于发育中的脑组织。在前期研究发现ETS1影响胚胎神经发育的基础上,过表达ETS1抑制酪氨酸羟化酶(TH)的表达。但ETS1在多巴胺能神经元发育的哪一阶段发挥作用,如何发挥作用均未阐明。 【设计思路】 利用非洲爪蟾作为模式动物,通过过表达或封闭ETS1表达,检测在多巴胺能神经元发育的不同阶段标志基因的表达,探讨ETS1影响多巴胺能神经元发育的阶段;进而寻找ETS1的下游靶基因。 【实验内容】 选择分裂良好的非洲爪蟾胚胎,利用显微注射方法注射ETS1 mRNA或反义寡核苷酸,实现ETS1的过表达或基因封闭,在神经发育的不同阶段收集胚胎,提取RNA或蛋白质,利用定量RT-PCR、整胚原位杂交及蛋白质印迹方法检测标志基因的表达改变。之后,通过萤光素酶报告基因方法检测ETS1对其靶基因的转录调控。 【材料】 非洲爪蟾胚胎,ETS1 mRNA、反义寡核苷酸,原位杂交用探针及其他试剂,RT-PCR、蛋白质印迹试剂,报告基因检测系统,其他常规试剂。 【可行性】 本课题建立在前期预实验的基础上,研究方向明确;非洲爪蟾胚胎体积大,易于进行显微注射;胚胎在体外发育,便于随时观察表型。 【创新性】 发现新的调节多巴胺能神经元发育的转录因子ETS1及其作用机制,为探讨帕金森病的发生机理提供新的线索。     

MicroRNA⁃141靶向致癌基因Bmi⁃1抑制胰腺癌细胞的增殖

目的：探讨miR?141调控胰腺癌细胞增殖的机制。方法：采用qRT?PCR检测正常胰腺细胞和4种胰腺癌细胞株中miR?141的表达。从Gene Expression Omnibus数据库（GEO）下载包含36例胰腺癌样本和16例正常样本的GSE71533 miR?141表达文件,分析miR?141在胰腺癌及癌旁的表达差异。Western blot 检测Bmi?1在正常胰腺细胞和4种胰腺癌细胞株中的表达。荧光素酶报告基因检测miR?141和Bm?1之间的靶向关系。通过CCK8、平板克隆形成检测Bmi?1和miR?141对胰腺癌细胞增殖能力的影响。结果：qRT?PCR显示与正常胰腺细胞相比,miR?141在胰腺癌细胞中表达下调;GSE71533数据集分析结果也显示miR?141在胰腺癌组织中下调;Western blot分析结果表明Bmi?1在胰腺癌细胞中高表达,双荧光素酶实验表明miR?141锚定在Bmi?1的3′非编码区,下调Bmi?1可以抑制胰腺癌细胞的增殖;上调miR?141可以降低Bmi?1的蛋白质表达水平,从而抑制胰腺癌细胞中细胞增殖。结论：miR?141通过靶向Bmi?1在胰腺癌中起抑制作用,在胰腺癌诊疗中具有潜在功能。     

isthmin 1对斑马鱼胚胎汇聚延伸运动的影响

目的在原肠期,斑马鱼胚胎细胞进行着外包(epiboly)、内卷(involution)以及汇聚延伸(convergence and extension)运动,对于胚胎的形态发生起关键作用。本文旨在研究isthmin 1(ism1)在斑马鱼胚胎发育中的表达图谱,并进一步探讨其在原肠期胚胎汇聚延伸运动中的功能。方法通过原位杂交技术,检测ism1在斑马鱼早期胚胎发育中的表达图谱;利用过表达和特异敲降等实验技术,活体拍照及原位杂交检测ism1对胚胎汇聚延伸运动的影响。结果整胚原位杂交实验结果显示ism1是合子表达的基因,在30%外包时期开始表达于胚胎背部,原肠期表达在整个胚胎边缘区,尤其在胚盾部位表达更为明显。活体拍摄及原位杂交结果表明,与野生型斑马鱼胚胎相比,过表达或敲低ism1均会使胚胎的汇聚延伸运动受到影响。结论 ism1是调控斑马鱼胚胎原肠期汇聚延伸运动的重要基因。     

胰岛素样生长因子结合蛋白-2参与斑马鱼胚胎心血管系统发育的实验研究

 目的 通过显微注射吗啡啉修饰的反义寡核苷酸制作斑马鱼IGFBP-2基因表达下调的动物模型,观察IGFBP-2表达下调导致斑马鱼胚胎心脏血管发育的异常表型及其对心脏发育相关基因表达的影响。方法 胚胎整体原位杂交验证IGFBP-2基因在斑马鱼胚胎发育早期的时空表达谱。特异抑制IGFBP-2基因启动子的吗啡啉（morpholino,MO）和标准对照吗啡啉（Con-MO）由Gene-Tools公司设计合成。设置0.05、0.10、0.25和1.0 mmol/L 4个不同浓度梯度的IGFBP-2 MO注射组,观察不同注射浓度对斑马鱼胚胎心脏异常表型发生率和死亡率的影响,并与Con-MO注射组以及野生型（Wild type,Wt）对照组比较。详细记录0.25 mmol/L浓度 IGFBP-2 MO注射组不同发育时段斑马鱼胚胎心脏发育的异常表型。荧光显微镜下观察IGFBP-2 EGFP重组质粒单独以及与IGFBP-2 MO或Con-MO共注射后12hpf胚胎的绿色荧光表达。原位杂交比较IGFBP-2 MO注射组与Wt组斑马鱼心房标记基因Amhc的表达情况;观察IGFBP-2基因下调的Vmhc-EGFP转基因斑马鱼心室特异性绿色荧光的变化;显微血管荧光造影显示IGFBP-2 MO注射组与Wt组胚胎外周血管发育的差异。结果 斑马鱼胚胎早期的发育过程中,IGFBP-2基因在眼球、中脑和肝脏先后表达。0.25 mmol/L浓度MO注射组12 hpf存活的胚胎在48 hpf有59.6%发生心脏发育的异常表型,包括心管搏动无力、心包水肿和房室环化障碍,部分胚胎发生心房扩大、房室反流伴循环瘀滞,且畸形随发育时间推移加重。接受单独显微注射IGFBP-2 EGFP重组质粒和与Con-MO共同注射的Wt胚胎12 hpf出现明显的绿色荧光表达,而重组质粒与IGFBP-2 MO共同注射的胚胎几乎无荧光表达,证实MO下调斑马鱼胚胎IGFBP-2基因的有效性。48 hpf胚胎整体原位杂交显示IGFBP-2 MO注射组心房特异标记基因Amhc的表达下调;48 hpf IGFBP-2基因下调的Vmhc-EGFP转基因斑马鱼心室特异绿色荧光蛋白的表达减弱;60 hpf IGFBP-2 MO注射组显微血管荧光造影显示体节间血管显影稀疏紊乱。结论 显微注射IGFBP-2 MO能够有效实现斑马鱼胚胎的IGFBP-2基因下调。IGFBP-2基因下调导致斑马鱼胚胎心脏血管的异常表型,并抑制心脏发生基因Amhc和Vmhc的表达。IGFBP-2在斑马鱼胚胎心血管系统的正常发育过程中起到重要作用。     

视黄酸缺乏对斑马鱼心脏房室分化的影响

目的 通过化学遗传学方法建立视黄酸缺乏的斑马鱼模型,探讨视黄酸缺乏对斑马鱼胚胎心脏前后轴发育即房室分化的影响.方法 在斑马鱼胚胎孵育的5 hpf,用不同浓度梯度的视黄醛脱氢酶2抑制剂DEAB(1×10-6、5×10-6、10×10-6、25×10-6 mol/L)处理斑马鱼胚胎,实时观察斑马鱼胚胎发育的全过程.通过给予斑马鱼胚胎外源性视黄酸,观察其对DEAB的拮抗作用.应用胚胎整体原位杂交观察视黄酸缺乏对心脏特异基因vmhc和amhc表达的影响.结果 斑马鱼胚胎的生存率随着DEAB处理浓度的增加而降低,当DEAB浓度≥5×10-6 mol/L时,斑马鱼的畸胎率达100%.5×10-6 mol/L DEAB的致畸作用能够被1×10-9mol/L外源性视黄酸所拮抗.整体原位杂交结果显示视黄酸缺乏会导致斑马鱼胚胎心脏房室分化异常,表现为vmhc表达细胞的范围增大,amhc表达细胞的范围缩小.结论 通过外源性DEAB处理能有效地建立视黄酸缺乏的斑马鱼模型,DEAB影响胚胎发育存在剂量依赖性.视黄酸在斑马鱼心脏前后轴发育过程中起重要调控作用,心脏发育早期视黄酸缺乏会抑制心房的发育而支持心室的发育,出现房室分化异常.     

miR⁃552⁃3p通过抑制DACH1促进肝细胞性肝癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的：探讨miR?552?3p在肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）中的表达及其促进细胞增殖和迁移、侵袭的机制。方法：qRT?PCR检测HCC细胞系及人正常肝细胞系中miR?552?3p的表达情况;下载TCGA数据库中HCC样本的微阵列数据,分析miR?552?3p在HCC癌组织及癌旁组织中是否存在表达差异;miR?552?3p mimics以及miR?552?3p inhibitor转染HCC细胞,荧光素酶报告基因验证miR?552?3p与DACH1是否存在靶向关系,CCK?8及Transwell实验检测miR?552?3p及其与DACH1相互作用对于HCC细胞增殖、迁移、侵袭的影响。结果：TCGA数据库中HCC样本的分析结果表明,miR?552?3p在HCC中高表达,同时qRT?PCR显示miR?552?3p在HCC细胞系中的表达水平显著高于人肝细胞系L02;miR?552?3p的高表达促进HCC细胞的增殖、迁移和侵袭,而抑制miR?552?3p表达后则相反;荧光素酶报告实验证实miR?552?3p靶向作用于DACH1的3′?UTR,上调miR?552?3p可抑制DACH1的表达,而下调miR?552?3p则增加DACH1表达;DACH1的过表达可抑制HCC细胞增殖、迁移和侵袭,但同时过表达miR?552?3p后DACH1对于HCC细胞相关功能的抑制即可解除;miR?552?3p正向调控Wnt/β?catenin信号通路的激活。结论：miR?552?3p靶向作用于DACH1促进HCC细胞增殖、迁移和侵袭,并参与调控Wnt/β?catenin信号。可能为HCC的诊疗策略提供潜在靶点。     

Midkine-a通过限制心肌细胞总数的方式阻碍斑马鱼胚胎心脏生长

目的 探讨一种可溶性的外分泌因子Midkine-a在斑马鱼胚胎心脏发育过程中的功能。方法 在整体胚胎上做Midkine-a RNA的原位杂交实验;利用原有的转基因斑马鱼系Tg (pMidkine-a:EGFP),动态观察胚胎从出生到心脏发育成形这一段时间心脏荧光表达情况;将原有的转基因斑马鱼体系 Tg (phsp:Midkine-a:EGFP) 胚胎进行热休克而过表达Midkine-a,观察胚胎心脏表型;利用Tg (pcmlc2:dsRed)鱼系胚胎的心肌细胞核带有红色荧光,能进行单个心脏心肌细胞计数这一特点,将杂合的Tg (phsp:Midkine-a:EGFP)鱼系与纯合的Tg (pcmlc2:dsRed)鱼系交配,以得到Tg (phsp:Midkine-a:EGFP/pcmlc2:dsRed)的杂合胚胎,对其进行热休克而过表达Midkine-a,计算每个胚胎心脏内心肌细胞的总数; 用吗啉寡聚核苷酸 （Morphonino,MO）阻碍新生胚胎内的Midkine-a mRNA 表达,观察胚胎心脏表型。结果 原位杂交试验证实Midkine-a在胚胎48hpf （hours post fertilization, 受精后小时,用来标记斑马鱼胚胎年龄）大时表达于心脏;转基因Tg (pMidkine-a:EGFP)胚胎在72hpf时其EGFP表达于心脏;Tg(phsp:Midkine-a:EGFP) 胚胎在过表达Midkine-a后心脏变小;吗啉寡聚核苷酸敲除Midkine-a对胚胎心脏发育无影响;最后在Tg (phsp:Midkine-a:EGFP/pcmlc2:dsRed)鱼系胚胎内过表达Midkine-a导致其单个心脏内心肌细胞数目变少,与其小心脏外形吻合。结论 Midkine-a在斑马鱼胚胎发育过程中表达于胚胎心脏;过表达Midkine-a导致胚胎心脏内心肌细胞总数减少及心脏变小;敲除Midkine-a则对胚胎心脏发育无影响。