姜黄素干预人视网膜色素上皮细胞钙离子信号的改变与整合素基因表达的探讨分析

目的 探讨视网膜色素上皮细胞(RPE)的钙离子与整合素基因表达的相关性.方法 人RPE细胞经分离培养,免疫细胞化学鉴定后,传至第4~6代;对各组RPE细胞进行5 μmol/L Fluo-3负载30 min,姜黄素分别以0.9375、1.8750、3.7500、7.5000、15.0000 mg/L浓度干预人RPE细胞,利用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)测定各组RPE细胞内早期钙离子的变化.利用MTT法测定不同浓度的姜黄素干预人RPE细胞48 h后的IC50,并观察相应的形态学变化.用Real-Time PCR测定姜黄素干预后的整合素基因的表达.结果 LSCM检测结果:空白对照组、0.9375、1.8750、3.7500、7.5000、15.0000 mg/L姜黄素组RPE细胞内均有钙荧光.空白对照组钙荧光强度明显低于姜黄素各组,且差异有统计学意义(P＜0.05),对照组基因表达量与整合素α4和整合素β5呈正效应,与整合素α3和整合素α5呈负效应.结论 体外培养的人RPE细胞经不同浓度姜黄素干预后,较空白对照组早期细胞内钙离子荧光强度明显增加,且有显著性差异.当细胞受到姜黄素外界信号刺激时,细胞内钙离子浓度能迅速增加,继而调节整合素的活性,继而引起细胞的生物学效应.因此,姜黄素通过调节细胞内的信号传导,可能成为治疗人眼疾,如增殖性玻璃体视网膜病变的一种有效物质.     

姜黄素对人视网膜色素上皮细胞增殖和VEGF表达的影响

目的 探讨姜黄素对人视网膜色素上皮(hRPE)细胞增殖和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法 (1)采用不同浓度(5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL)的姜黄素干预hRPE细胞1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d,同时设置空白对照组(不给予姜黄素干预)。采用CCK-8法检测各时间点不同浓度姜黄素对hRPE细胞增殖的影响,采用流式细胞仪检测各时间点各组细胞周期时相分布情况。(2)将hRPE细胞分为姜黄素组和对照组,姜黄素组加入10μg/mL的姜黄素,对照组加入等体积培养液,采用实时荧光半定量PCR检测各组hRPE细胞VEGF mRNA的表达水平。结果 (1)各浓度姜黄素对hRPE细胞均有抑制作用(均P<0.05),且随着药物浓度的增大、作用时间的延长,其抑制率呈升高趋势,整体呈现剂量和时间依赖性。(2)不同浓度姜黄素干预后,G₀/G₁期细胞比例均大于空白对照组,S期细胞比例和G₂/M期细胞比例均小于空白对照组(均P<0.05)。(3)姜黄素组hRPE细胞VEGF mRN...     

视网膜色素上皮细胞培养及移植进展

视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞的代谢障碍与许多眼底疾病的发病有着密切的关系。将体外分离、培养的视网膜色素上皮细胞移植入患眼治疗眼底疾病是当今眼科研究的热点之一。现将目前有关于RPE细胞体外分离、培养及移植的研究进展进行综述。     

金雀异黄素抑制氯化钴诱导的人视网膜色素上皮细胞缺氧诱导因子1α表达的研究

目的：研究氯化钴(CoCl2)诱导体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的表达以及金雀异黄素(Gen)对其表达的影响。方法：采用免疫组化和激光共聚焦显微镜研究HIF-1α的表达。结果：CoCl2可明显诱导人RPE细胞HIF-lα的表达，0．5h达高峰，随后逐渐下降。Gen可呈浓度依赖性地抑制氯化钴诱导的HIF-1α蛋白表达。结论：Gen可抑制CoCl2诱导的人RPE细胞HIF-1α蛋白表达。     

兔视网膜色素上皮细胞移植的实验研究

目的 用改良的二步酶法制备视网膜色素上皮（RPE）细胞悬液，不做玻璃体切割，直接进行视网膜下间隙的移植。方法 用酶I（含220kU/L)透明质酸酶和0.1%胰蛋白酶）分离视网膜神经上皮层与RPE之间的联系，再用酶Ⅱ（含0.25%胰蛋白酶）将RPE从玻璃膜上分离下来获得悬浮的RPE细胞，用特制的移植针头通过人为造成的局限性视网膜脱离区将其移植入受体视网膜下间隙。结果 术后2周供体RPE细胞呈单层排列于受体视网膜下间隙并存活，未见明显炎症反应。电镜观察术后5周供体RPE细胞位于受体Bruch膜上并与受体感光细胞外节盘膜形成镶嵌关系。结论 改良的内路法可以将供体RPE细胞成功移植在受体眼视网膜下间膜，并至少存活7周。     

金丝桃素对培养的人视网膜色素上皮细胞钙离子内流的抑制

目的研究蛋白激酶C (PKC) 抑制剂金丝桃素对视网膜色素上皮细胞(RPE cells)钙离子信号共聚成像的影响. 方法使用钙荧光指示剂fluo-3 AM和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM),分析在100 nmol*L-1 佛波酯(PMA)和(或)5个浓度的金丝桃素(1, 2, 3, 4和5 μmol*L-1)刺激时培养的人RPE细胞的钙离子信号的变化. 结果 RPE细胞荧光着色很强,遍布整个细胞,其中细胞核比细胞质更强. 只用PMA或金丝桃素刺激时,可以观察到荧光强度迅速下降,并且5个浓度金丝桃素之间的下降曲线无明显差异. 用PMA预先处理细胞24 h后,再给予金丝桃素刺激发现荧光强度并没有进一步下降. 结论 fluo-3 AM 是人RPE细胞钙离子良好的指示剂,金丝桃素能强力抑制钙离子内流,它作为治疗增殖性玻璃体视网膜病变的潜在药物可能是因为能抑制PKC活性和钙离子内流.     

全反式维甲酸对人视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

目的：研究全反式维甲酸（ATRA）对体外培养人视网膜色素上皮（RPE）细胞增生的抑制作用及机制。 方法：采用传代培养的人RPE细胞,分成不同浓度（10^-9、10^-8、10^-7、10^-6和10^-5 mol•L ^-1的ATRA）和不同时间点（6、12、24、48、72和96 h）给药组,通过活细胞计数法、MTT比色法和流式细胞术分别检测ATRA对人RPE细胞增生的影响。 结果：ATRA给药组细胞生存率低于非给药组（P<0.01）。细胞增生的抑制率与药物剂量及时间呈正相关 (r₁=0.9926,P<0.05; r₂=0.9647,P<0.05)。与非给药组比较,ATRA给药组 RPE细胞周期中G₁期细胞增加（P<0.05),而G₀/G₁期细胞数明显减少(P<0.05）。结论：ATRA可能通过阻滞人RPE细胞周期对RPE细胞增生具有剂量依赖和时间依赖的抑制作用。     

The Effect of Zinc on the Apoptosis of Cultured Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Age relatedmaculardegeneration (ARMD ) ,orsenilemaculardegeneration (SMD) ,hasbecomeamoreimportantsightlessdisease .The precisepathogenicmechanismofARMDiscurrentlyun known .Sotheeffectivetreatmentsand preventivemeasureshavenotbeenavailableuntilnow .Ithasbeenprovedthattheretinalpigmentepithelia (RPE)wasthemaincelltypeaffectedbyARMD .Zincdefi ciencyhasbeensuspectedasapotentialriskfactor.Inthisstudy ,theinfluenceofzincontheapoptosisofRPEwasstudied .1　MATERIALSANDMETHODS1 1　MAT…     

维拉帕米对兔视网膜色素上皮细胞增殖的抑制作用

目的：观察维拉帕米对兔视网膜色素上皮细胞增殖的影响。寻找有效、安全、方便的药物以防治增增性玻璃体视网膜病变。方法：分别将不同浓度的维拉帕米加入体外的兔ＲＰＥ细胞,用噻唑蓝（ＭＴＴ）比色法在自动酶标测定仪测５４０ｍｍ处的吸光值Ａ「旧称光密度（ＯＤ）」,计算出不同浓度条件下的细胞增殖抑制率及５０％抑制浓度,同时用２％台盼蓝色,测定细胞活性。结果：Ｖｅｒ在所设浓度范围内均明显抑制血清诱导的兔ＲＰＥ细胞的     

Immunocytochemical characteristics of cultured human retinal pigment epithelial cells

Rehnal Pigment epithelial cells (RPEC), as one ofthe most ~t cell layers in the eye, po~ a nof fUnctions cmcial in PreServing the integhty Of the visualsystem. The hantenance of healthy RPEC is critical fornOImal retinal funCtion, and the etiologies Of many retinaldisolders may have their Prifnaly origins in the pigment epitheliam. The PIDlilbmtion of RPEC in foe yi~s and onthe surfaCe Of retina is the pathological cause Of Pmlifelative yi~whnOPathy (PVR). On the other hand the a…     

亮菌多糖对LPS诱导的肠上皮细胞炎性损伤的保护作用及机制探讨

目的 观察在脂多糖(LPS)诱导的IEC-6肠上皮细胞损伤的情况下,亮菌多糖(ATPS)对细胞活性、闭合素(Oc-cludin)、细胞紧密连接蛋白1(ZO-1)的影响,并探讨ATPS对肠黏膜屏障损伤的保护机制.方法 利用LPS构建的IEC-6肠上皮细胞体外损伤模型,将细胞随机分为对照组、LPS组、LPS+ATPS组、LPS+Matrine组(阳性对照),使用普通显微镜和MTT法观察细胞的活性;免疫荧光和流式细胞术检测细胞的凋亡情况;Western blot检测膜蛋白ZO-1和跨膜蛋白Occludin的表达水平.同时Western blot检测与介导细胞凋亡密切相关的内质网应激(ERS)通路上磷酸化蛋白激酶R样内质网调节激酶(p-PERK)、磷酸化真核细胞翻译起始因子(p-eIF2α)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、内质网应激相关蛋白(CHOP)以及调节肠黏膜损伤重要分子β-抑制蛋白1(Arrb1)的表达水平.结果 与对照组、LPS组比较,随着ATPS的浓度增加,LPS+ATPS组中细胞的活性越多且免疫荧光和流式检测也表明细胞的凋亡率减少;Occlu-din、ZO-1的表达水平增多,明显高于LPS组;与LPS组相比,LPS+ATPS 组中 p-PERK、p-eIF2α、GRP78、CHOP 及Arrb1蛋白的水平降低.结论 ATPS可通过抑制Occludin、ZO-1的破坏来保护LPS介导的肠上皮细胞炎性损伤,其机制可能与介导细胞凋亡的内质网应激蛋白以及调节肠黏膜损伤的重要分子Arrb1有关.     

培养人视网膜色素上皮细胞的免疫细胞化学特征

目的：观察体外培养人视网膜色素上皮细胞（ＲＰＥ）免疫组化特征．方法：取第１代、第３￣６代ＲＰＥ,以间接免疫荧光方法比较角蛋白、波形蛋白、肌动蛋白、ＶⅢ因子和ＧＦＡＰ,ＨＡＭ４５等６种蛋白表达的特征．结果：与对照组相比,传代培养的人ＲＰＥ角蛋白、波形蛋白表达呈阳性;随传代次数增多,角蛋白表达强度无明显变化,波形蛋白表达逐渐增强;肌动蛋白、ＶⅢ因子、神经纤维酸性蛋白（ＧＦＡＰ）、ＨＭＢ４５呈阴性．结论     

连翘苷对金黄色葡萄球菌刺激的人单核巨噬细胞炎性反应的抑制作用

目的探讨连翘苷对金黄色葡萄球菌引起的人单核巨噬细胞Toll样受体2(TLR2)和TLR4表达增高的抑制作用,研究其在感染性疾病时对机体的保护作用。方法采用金黄色葡萄球菌刺激人单核巨噬细胞,构建感染性疾病的体外模拟炎症模型,实时定量多聚酶链反应(RT-PCR)检测TLR2和TLR4表达,酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定连翘苷对金黄色葡萄球菌刺激人单核巨噬细胞释放炎性介质白细胞介素-6(IL-6)、IL-8、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和巨噬细胞集落刺激因子-1(MCSF-1)的影响。结果 RT-PCR检测结果显示,金黄色葡萄球菌能够使人单核巨噬细胞表达TLR2和TLR4升高,但经连翘苷预处理后,TLR2和TLR4的表达显著下降(P<0.05),当连翘苷为200 mg·L~(-1)时,TLR2与TLR4的抑制剂阳性对照OxP APC和MST510组比较差异无统计学意义(P>0.05)。ELISA检测结果显示,当连翘苷为50 mg·L~(-1)时,抑制金黄色葡萄球菌刺激人单核巨噬细胞分泌TNF-α、IL-8水平明显增强(P<0.05),且随着连翘苷浓度升高,抑制效果更为明显(P<0.001,P<0.01),呈浓度依赖关系;当连翘苷为100 mg·L~(-1)时,抑制金黄色葡萄球菌刺激人单核巨噬细胞分泌IL-6、MCSF-1水平明显增强(P<0.05,P<0.01),且随着连翘苷浓度升高,抑制效果更为明显(P<0.01,P<0.001),呈浓度依赖关系。结论连翘苷能够抑制人单核巨噬细胞活化产生的炎症反应,其抗炎作用机制可能是通过抑制TLR2和TLR4信号通路而发挥效用。     

转染反义Bcl-2对柔红霉素诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡的影响

目的 :观察转染反义Bcl 2对柔红霉素诱导人视网膜色素上皮细胞 (RPE)凋亡的影响 .方法 :用Annexin V fluo ,琼脂糖凝胶电泳 ,TUNEL分别观察柔红霉素诱导正常RPE与转染反义Bcl 2的RPE的凋亡作用 .结果 :Annex in V fluo法在 4h即可检测到凋亡细胞膜的变化 ,琼脂糖凝胶电泳在 36h可检测到确切的梯状带纹 ,1 80 μg·L-1 柔红霉素作用 72h转染组与正常组凋亡指数分别为 0 .5 9和 0 .4 5 (P <0 .0 1 ) .结论 :转染反义Bcl 2可增加柔红霉素诱导的RPE凋亡的敏感性 .     

多西他赛对人视网膜色素上皮细胞增殖的抑制作用

目的 研究多西他赛（docetaxel, DTX）对体外培养的人视网膜色素上皮（human retinal pigment epithelium, hRPE）细胞增殖的抑制和凋亡。方法 选择不同浓度（0、10、20、40、80μg/mL）的DTX作用于hRPE细胞一定时间,MTT法检测DTX对hRPE细胞的生长抑制,荧光染色显微镜观察凋亡细胞,流式细胞术检测DTX对hRPE细胞周期的影响。结果 DTX对人hRPE细胞有生长抑制作用,随着DTX浓度的增加,对hRPE细胞的增殖抑制作用明显增强（P<0.05）,当DTX浓度为80μg/mL作用于hRPE细胞48 h时,细胞增殖抑制达93%。20μg/mL DTX作用的hRPE细胞中细胞核或细胞质内出现致密浓染的颗粒状或条索状荧光的凋亡细胞,随着浓度的增加,凋亡细胞数亦增加。流式细胞仪检测显示,加入DTX的hRPE细胞各周期比例发生改变,G₀/G₁期、S期细胞比例逐渐减少,G₂/M期细胞增加,不同浓度组与阴性对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）,80μg/mL...     

紫杉醇抑制原代培养人视网膜色素上皮细胞增殖的实验研究

目的研究紫杉醇（Taxol）对体外原代培养人视网膜色素上皮（human Retinal Pigment Epithelium,hRPE）细胞增殖的抑制作用及机制。方法体外分离、原代培养hRPE细胞,采用免疫细胞化学方法对其进行鉴定。不同浓度紫杉醇（0、0.005、0.05、0.5、5mg/L）处理hRPE细胞一定时间,采用形态学观察、细胞生长曲线及MTT法检测药物对hRPE细胞的生长抑制效应,流式细胞术检测药物对hRPE细胞的细胞周期阻滞作用及凋亡诱导作用。结果原代培养的hRPE细胞胞浆富含色素,随传代次数增加,黑色素颗粒逐渐减少直至消失。用抗人细胞角蛋白抗体进行免疫细胞化学鉴定hRPE细胞呈特异的阳性反应。细胞生长曲线及MTT法显示：紫杉醇作用于hRPE细胞24h和72h,其抑制细胞生长增殖的IC50值分别为5.24和3.24mg/L。流式细胞分析术检测结果显示：0.5mg/L紫衫醇作用细胞48h即可显著延迟hRPE细胞G2/M期进展并诱导凋亡（P〈0.05）。透射电镜观察显示：0.5mg/L紫杉醇作用后细胞表面微绒毛减少,电子密度增加,细胞器减少,异染色质聚集成团、边聚等。结论紫杉醇通过阻滞G2/M期进展和诱导凋亡显著抑制hRPE细胞生长增殖。