miR-9通过靶向E盒结合锌指蛋白2调控小细胞肺癌的恶性生物学行为及其可能的机制

目的：探讨 miR-9 通过靶向 E 盒结合锌指蛋白 2（zinc finger E-box binding homeobox 2,ZEB2）对小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）细胞生物学行为的调控作用,分析miR-9在SCLC中的作用及其工作机制。方法：采用qPCR、WB和免疫组化方法检测于2018年2月至2019年11月于河北医科大学第四医院肿瘤内科接受手术治疗的67例SCLC患者癌组织及癌旁组织中ZEB2的表达。采用TargetScan预测miR-9的潜在靶基因并通过双荧光素酶报告基因试验、qPCR和WB法进行验证。CCK-8法、流式细胞术和Transwell实验检测miR-9和ZEB2 过表达对 NCI-H446 的生物学行为影响,WB法检测对细胞中E-cadherin,N-cadherin和Vimentin蛋白表达的影响。利用miR-9过表达NCI-H446细胞构建SCLC裸鼠移植瘤模型,观察miR-9对裸鼠移植瘤生长的影响。结果：SCLC组织中ZEB2的mRNA和蛋白表达水平明显高于癌旁正常组织（P<0.01）。miR-9在ZEB2的3'' UTR上具有潜在的结合位点,与对照组相比,miR-9过表达组NCI-H446细胞中ZEB2的mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.01）,细胞增殖、迁移和侵袭能力均显著下降（P<0.05或P<0.01）,促EMT蛋白表达减少,而同时过表达ZEB2能够逆转上述影响。体内实验中,miR-9过表达组移植瘤体积、重量均明显低于对照组（P<0.05或P<0.01）。miR-9组裸鼠肿瘤组织中和ZEB2蛋白的表达均较对照组明显降低（P<0.01）。结论：miR-9通过靶向调控ZEB2从而抑制SCLC细胞的生物学行为以及NCI-H446裸鼠移植瘤的生长。     

重组人血管内皮抑制素联合EP方案对小细胞肺癌细胞株NCI-H446的增殖抑制和促细胞凋亡作用

目的:本研究旨在评估依托泊苷(etoposide,VP-16)、顺铂(cisplatin,DDP)(EP方案)联合重组人血管内皮抑制素对小细胞肺癌(small-cell lung cancer,SCLC) NCI-H446细胞的促凋亡和抑制细胞增殖的协同作用.方法:EP方案、重组人血管内皮抑制素单药以及EP方案联合重组人血管内皮抑制素作用于NCI-H446细胞72 h后,采用CCK-8(cell counting kit-8)法测定药物对NCI-H446细胞的增殖抑制作用,FCM检测药物对NCI-H446细胞的细胞周期分布的影响,ELISA法检测药物对NCI-H446细胞分泌血管内皮细胞生长因子(vascularendothelial cell growth factor,VEGF)水平的影响.结果:EP方案联合重组人血管内皮抑制素的细胞增殖抑制率明显高于EP方案组(P＜0.01).EP方案组和EP方案联合重组人血管内皮抑制素组的NCI-H446细胞大多被阻滞于G1期,EP方案联合重组人血管内皮抑制素组的NCI-H446细胞凋亡率显著高于EP方案组(P＜0.01).与EP方案和重组人血管内皮抑制素单药相比,EP方案联合重组人血管内皮抑制素可显著抑制NCI-H446细胞分泌VEGF(P＜0.05).结论:EP方案联合重组人血管内皮抑制素在抑制SCLC NCI-H446细胞增殖和促细胞凋亡方面,具有协同作用.     

过表达OMA1通过促进线粒体释放细胞色素C诱导肺腺癌A549细胞凋亡

目的:探讨OMA1在肺腺癌中的表达水平及其对肺腺癌A549细胞凋亡的影响及机制。方法:收集2018年01月至2019年10月在本院保存的42例经病理确诊为肺腺癌患者的癌组织样本及其癌旁组织(距离肿瘤边缘≥5 cm),免疫组化染色法检测癌组织及癌旁组织中OMA1表达情况。体外培养人肺腺癌细胞系NCI-H2009、Calu-3、SPC-A-1、A549及人正常肺上皮细胞BEAS-2B,qRT-PCR和Western blotting检测细胞中OMA1 mRNA和蛋白表达水平。采用OMA1过表达慢病毒及其空载慢病毒感染A549细胞,分为OMA1过表达慢病毒感染组(OMA1组)和空载慢病毒感染组(Vector组),另设置空白对照组(Blank组)。采用MTT检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡水平;JC-10染色法检测细胞线粒体膜电位变化;qRT-PCR法检测细胞中OMA1 mRNA表达水平;Western blotting法检测细胞中OMA1、cleaved caspase-3、OPA1以及细胞线粒体和胞浆中Cyt C蛋白表达水平。结果:肺腺癌患者癌组织中OMA1表达水平显著低于癌旁组织...     

FGF-2和ToPo Ⅱ在小细胞肺癌中的表达及相关性

目的 探讨成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）和拓扑异构酶Ⅱ（ToPo-Ⅱ） 在小细胞肺癌（SCLC）中的表达情况及二者的相关性。方法 采用En Vision两步法检测64例SCLC组织、20例癌旁组织中FGF 2和ToPo Ⅱ蛋白的表达水平。采用Western blotting、RT-PCR法检测外源性FGF-2对人SCLC细胞株NCL-H446中ToPo-Ⅱ蛋白及mRNA表达水平的影响。结果 SCLC组织中FGF-2和ToPo-Ⅱ阳性表达率分别为68.75％（44／64）和79.69％（51／64）,显著高于癌旁组织的15.0％和10.0％（P＜0.01）;FGF-2和ToPo-Ⅱ表达与淋巴结转移和临床分期密切相关（P＜0.05）,与性别、年龄和吸烟情况无关（P＞0.05）;两者表达在SCLC中呈正相关（r=0.497,P＜0.01）。FGF-2可以上调NCL-H446细胞中ToPo-Ⅱ蛋白和mRNA的表达。结论 FGF-2和ToPo-Ⅱ之间可能存在共同作用通路,FGF-2可能通过ToPo-Ⅱ促进SCLC的发生、发展。     

血管内皮生长因子C过表达或抑制表达对人小细胞肺癌NCI-H446细胞生物学行为的影响

目的:探讨血管内皮生长因子C (vascular endothelial growth factor C,VEGF-C)对人小细胞肺癌细胞株NCI-H446生长、体外侵袭和细胞凋亡的影响.方法:构建VEGF-C过表达慢病毒质粒pHRi-VEGF-C和小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)慢病毒表达质粒pHRi-siVEGF-C,经慢病毒包装后分别感染NCI-H446细胞.蛋白质印迹法检测VEGF-C的表达水平,MTT方法检测细胞增殖活性,Transwell实验检测细胞体外侵袭能力,FCM检测细胞凋亡比例.结果:与空载体对照组相比,pHRi-VEGF-C质粒感染入NCI-H446细胞后VEGF-C基因表达水平显著升高,而pHRi-siVEGF-C质粒感染后VEGF-C基因表达水平显著降低.pHRi-VEGF-C质粒感染第5天后,NCI-H446细胞增殖(D值=1.481±0.056)明显高于pHRi-siVEGF-C组(D值=0.838±0.035)和空载体对照组(D值=1.146±0.07),差异有统计学意义(P＜0.05); pHRi-siVEGF-C组中每个视野侵袭的细胞平均数为39.78±0.77,显著低于pHRi-VEGF-C组的84.87±1.27和空载体对照组的60.82±1.05,差异有统计学意义(P＜0.01).感染了pHRi-VEGF-C质粒后的NCI-H446细胞凋亡数较空载体对照组减少约90％,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:VEGF-C过表达可以显著促进NCI-H446细胞增殖,增强其侵袭能力,抑制细胞凋亡;而VEGF-C表达经RNA干扰后可以显著减缓细胞的增殖趋势,降低NCI-H446细胞的侵袭能力.推测VEGF-C可能成为临床治疗小细胞肺癌的基因治疗靶点之一.     

lncRNA CCAT2 对宫颈癌CaSki细胞增殖及周期的影响

目的：研究长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）CCAT2 对宫颈癌细胞增殖、周期的影响。方法：采用qPCR法检测3 种宫颈癌细胞（HeLa、C-33A和CaSki）中CCAT2 的表达水平，选择表达水平最高的细胞进行后续实验。设计合成CCAT2 过表达及干扰载体，转染细胞后，qPCR检测转染效率。细胞分为5 组：对照组、干扰空载（sh-EV）组、过表达空载（overExp-EV）组、CCAT2 干扰（sh-CCAT2）组和CCAT2 过表达（overExp-CCAT2）组，MTT法检测各组细胞增殖活力，流式细胞术检测细胞周期，WB法检测细胞中Ki67、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）和周期蛋白依赖性激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）表达水平。结果：在HeLa、C-33A和CaSki 3 种细胞系中，选择CCAT2 表达水平最高的CaSki 细胞为研究对象。CCAT2 过表达及干扰载体均成功转入细胞，转染效果明显。与对照组比较，sh-CCAT2 组细胞增殖活力显著降低（P<0.01）、G1 期细胞比例显著升高（P<0.01），Ki67、Cyclin D1 及CDK4 表达水平显著降低（均P<0.01）；而overExp-CCAT2 组与之相反，细胞增殖能力增强，且Ki67、Cyclin D1 及CDK4 表达水平显著升高（均P<0.01）。结论：CCAT2 通过调控细胞增殖及周期相关蛋白的表达，进而影响宫颈癌CaSki细胞的增殖和周期。     

肺腺癌穿膜蛋白 125 通过高甲基化介导 NF-κB 信号通路的激活降低对 地西他滨的敏感性

目的：探讨穿膜蛋白125（transmembrane protein125,TMEM125）在肺腺癌组织与A549细胞中的表达,以及影响细胞的增殖和侵袭能力的分子机制。方法：从癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）数据库收集肺腺癌数据包,下载临床信息及基因表达谱数据。分析 TMEM125在肺腺癌组织中的表达及其与患者总生存期的相关性。构建 TMEM125过表达 A549细胞株,以CCK-8法、细胞划痕实验检测TMEM125过表达对肿瘤细胞的增殖和迁移能力的影响;流式细胞术检测TMEM125过表达对A549细胞的细胞周期和凋亡的影响。WB检测TMEM125过表达对下游NF-κB信号通路、凋亡蛋白的影响;免疫共沉淀法（co-immunoprecipitation,Co-IP）检 测 TMEM125 与 NF- κB 抑 制 因 子 结 合 Ras 样 2（NF- κB inhibitor interacting Ras-like 2,NKIRAS2）的相互作用。利用TNFα（10 ng/ml）处理TMEM125过表达A549细胞,CKK-8、流式细胞术及WB检测其对细胞增殖、凋亡以及NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响。去甲基化试剂地西他滨处理A549细胞,qPCR和WB检测TMEM125基因和蛋白的表达。结果：TMEM125 mRNA在肺腺癌组织中表达水平显著低于正常组织（P<0.001）,启动子甲基化水平显著高于正常组织（P<0.001）,并且低、中表达患者总生存期显著低于高表达患者（P<0.001）。过表达TMEM125抑制了A549细胞的增殖和迁移（P<0.01）,增加细胞 G2/M 期,促进细胞凋亡（P<0.01）;过表达 TMEM125 与 NKIRAS2 相互作用,显著抑制 NF-κB 的活性（P<0.01）;地西他滨处理 A549 细胞可促进 TMEM125 表达并且抑制细胞增殖（P<0.01）。结论：启动子高甲基化水平降低了TMEM125基因表达,导致其抑制NF-κB活性功能和抑制细胞增殖的作用下降,并且降低了细胞对地西他滨的敏感性。     

lncRNA HIT对骨肉瘤组织和细胞U2OS顺铂抵抗的影响及其机制

目的:探究长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）HIT与骨肉瘤细胞顺铂（cisplatin,DDP）抵抗的关系及其上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的相关机制。方法：选择天津医院骨科2017 年6 月至2018 年6 月42 例骨肉瘤组织及相应癌旁组织（距癌变边缘>5 cm）标本,采用qRT-qPCR 检测骨肉瘤组织及相应癌旁组织中HIT 及EMT标志物Snail、E-钙黏蛋白（E-cadherin）mRNA的表达水平。构建DDP抵抗的人骨肉瘤U2OS细胞株及人肾上腺293T细胞株作为抵抗组及对照组,采用慢病毒转染两组表达靶向HIT的siRNA载体于抵抗组细胞中作为干扰A组及B组,同时转染HIT过表达载体及空白载体构建HIT 过表达的U2OS细胞株及空白U2OS细胞株分别作为过表达组及空白组。MTT实验检测各组细胞DDP半抑制浓度（IC50）,qRT-PCR实验检测各组细胞中HIT、Snail 及E-cadherin mRNA的表达水平,Western blotting 检测各组细胞Snail 及Ecadherin的表达水平,RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA-IP）实验检测U2OS 及293T 细胞中HIT 与Snail 蛋白分子的结合情况。结果：骨肉瘤组织中HIT及Snail mRNA表达显著高于癌旁组织、E-cadherin mRNA表达显著低于癌旁组织,且骨肉瘤组织中HIT与E-cadherin mRNA表达呈显著负相关(均P<0.01);抵抗组细胞DDP IC50显著高于对照组、干扰A组及B组细胞,过表达组DDP IC50显著高于空白组(均P<0.01);抵抗组细胞HIT 表达显著高于对照组,干扰A组及B组细胞HIT 表达显著低于抵抗组及对照组,过表达组HIT表达显著高于空白组（均P<0.05 或P<0.01）;抵抗组细胞Snail 、E-cadherin mRNA表达水平显著高于或低于对照组、干扰A组及干扰B组,过表达组E-cadherinmRNA显著低于空白组;抵抗组细胞Snail 蛋白表达水平显著高于对照组、干扰A组及B组细胞,E-cadherin 蛋白表达水平则显著低于对照组、干扰A 组及B 组细胞,过表达组Snail 蛋白表达水平显著高于空白组(P<0.05或P<0.01）;在U2OS及293T细胞中,免疫磁珠介导Anti-snail 抗体下拉HIT的表达水平显著高于对照IgG抗体下拉HIT的表达水平（P<0.01）。结论：HIT通过正调控Snail蛋白水平,抑制E-cadherin的转录活性,从而促进骨肉瘤细胞EMT及DDP抵抗的发生。     

七氟烷通过抑制PI3K磷酸化抑制结肠癌SW480 细胞的增殖和侵袭以及裸鼠移植瘤的生长

目的：探讨七氟烷（sevoflurane）通过调控PI3K磷酸化对结肠癌SW480 细胞增殖和侵袭以及裸鼠移植瘤生长的影响及其机制。方法：采用七氟烷处理结肠癌SW480 细胞,将细胞随机分为对照组、0.5%七氟烷组、1.0%七氟烷组和2.0%七氟烷组进行后续实验。用克隆形成实验检测SW480 细胞的增殖能力,RT-PCR 检测细胞中MDM2、survivin mRNA表达水平,Transwell小室法检测细胞的侵袭能力,Western blotting 检测细胞中MDM2、survivin、VEGF、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT 蛋白的表达水平。并加入PI3K激活剂740 Y-P 进行验证。建立裸鼠SW480 细胞移植瘤模型,称取肿瘤质量,免疫组化检测移植瘤组织中MDM2 和VEGF阳性表达率。结果：与对照组和低剂量组比较,1.0%和2.0%七氟烷组SW480 细胞的克隆形成率显著降低（均P<0.01）;细胞中MDM2 mRNA和蛋白水平显著升高（均P<0.01）,survivin mRNA和蛋白水平显著降低（均P<0.01）;SW480 细胞侵袭数显著降低（P<0.01）,VEGF、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 蛋白水平显著降低（均P<0.01）。740Y-P 可逆转七氟烷对SW480 细胞增殖、侵袭及PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响。2.0%七氟烷组小鼠移植瘤质量显著降低（P<0.01）,瘤组织中MDM2 阳性表达率显著升高（P<0.01）、VEGF阳性表达率显著降低（P<0.01）。结论：七氟烷抑制结肠癌SW480 细胞的增殖和侵袭以及裸鼠移植瘤的生长,其作用机制可能是通过抑制PI3K磷酸化实现的。     

BCSC-1基因异位表达对人小细胞肺癌细胞增殖的抑制效应

背景与目的:人乳腺癌候选抑制蛋白1(breast cancer suppressor candidate 1,BCSC-1)基因已被证实是一种新型抑癌基因,在多种肿瘤细胞均存在表达缺失的现象。该研究通过将BCSC-1基因转染至人小细胞肺癌细胞株NCI-H446,探讨BCSC-1基因异位表达对NCI-H446细胞增殖的抑制效应。方法:用PCR扩增BCSC-1 cDNA,构建真核重组表达载体pcDNA3.1/v5-HisB-BCSC-1。通过脂质体把pcDNA3.1/v5-HisB-BCSC-1和空质粒pcDNA3.1/v5-HisB转染入野生型NCI-H446细胞。以转染空质粒pcDNA3.1/v5-HisB的NCI-H446细胞为对照组,野生型NCI-H446细胞为空白对照组。采用流式细胞仪检测细胞周期;MTT法检测细胞增殖;免疫组化确认BCSC-1基因和CD44分子在NCI-H446细胞中的表达。结果:成功构建了真核重组表达载体pcDNA3.1/v5-HisB-BCSC-1,制备了BCSC-1基因异位高表达的NCI-H446稳定细胞株。细胞周期分析显示,异位表达BCSC-1的NCI-H446细胞大部分阻滞在G0/G1期,明显高于对照组和空白组(P<0.01)。MTT法检测显示,异位表达BCSC-1的NCI-H446细胞与对照组、空白组相比,生长速度明显减慢(P<0.05)。免疫组化显示异位表达BCSC-1的NCI-H446细胞CD44表达增高。结论:BCSC-1基因的异位表达对NCI-H446细胞的恶性增殖行为有明显的抑制作用,这种抑制作用可能与细胞周期阻滞和黏附分子CD44表达增高有关。     

以hsa-miR-491-3p为靶标的反义寡核苷酸对NCI-H446细胞生物学特性的影响

背景与目的:miRNAs是一类小分子RNA,参与转录后调控.前期研究结果显示,hsa-miR-491-3p在肺痛和肾痛组织中高表达,目前鲜见其功能研究的报道.本研宄旨在探讨以hsa-miR-491-3p为靶标的反义寡核苷酸对人小细胞肺癌NCI-H446细胞生物学特性的影响.方法:合成以hsa-miR-491-3p为靶标的反义寡核苷酸和随机对照序列,转染NCI-H446细胞.实验分4组:空白对照组(组1)、空白转染组(组2) ⑺婊?对照组(组3)和反义寡核苷酸组(组4).用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法筛选最佳作用浓度,Hoechst33258染色检测细胞核的形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡和周期变化,划痕实验检测细胞的迁移能力.结果:转染反义寡核苷酸后细胞生长受到抑制,最佳作用浓度为0.5 μmol/L.Hoechst33258染色各组的凋亡率分别为(6.67±0.58)%、(7.00±1.00)%、(6.67±1.53)%和(26.33±1.53)%,组4的凋亡率明显高于前3组,差异有统计学意义(P<0.001).流式细胞仪检测各组的凋亡率分别为(2.44±0.60)%、(2.59±0.85)%、(2.62±1.11)%和(5.22±0.40)%,组4的凋亡率明显高于前3组,差异有统计学意义(P<0.01),且G1期细胞增多,S期细胞减少.划痕实验显示各组细胞24 h的迁移距离分别为(196.88±39.13)、(163.06±21.28)、(225.49±23.42)和(77.41±6.07)μ m,组4细胞的迁移距离小于前3组(P<0.05),迁移能力减弱.结论:以hsa-miR-491-3p为靶标的反义寡核苷酸能够抑制NCI-H446细胞增殖,诱导其凋亡,并降低其侵袭能力.     

The Role of Chemokine Receptor CXCR7 in Lung Cancer

OBJECTIVE To investigate whether CXCL12 and its receptor,CXCR7, play a role in lung cancer invasion and metastasis.METHODS Western blot and immunocytochemistry were used to detect CXCR7 protein expression in 8 lung cancer cell lines, EKVX, HOP62, HOP92, NCI-H23, NCI-H226, NCIH322M,NCI-H446, and A549, and cell migration experiment was conducted to observe mobility of the lung cancer cells. The concentration of intracellular calcium in cytoplasm was measured under the fluorescence microscopy.RESULTS CXCR7 protein was positively expressed in the 8 lung cancer cell lines EKVX, HOP62, HOP92, NCI-H23, NCI-H226, NCIH322M,NCI-H446, and A549. Following CXCL12 stimulation,obvious pseudopodia of lung cancer cells was observed under the microscope. The cell migration experiment showed that after incubation with CXCL12, the number of EKVX cells, which passed through the polycarbonate microporous filter membranes increased to a great extent. This phenomenon can be reversed by CXCR7-siRNA. After CXCL12 incubation, the intracellular Ca2+level in the EKVX cells was increased to a great extent. CONCLUSION Chemokine CXCL12 facilitates the migration of lung cancer cells by changing the concentration of intracellular Ca2+. The CXCL12-CXCR7 axis may play an important role in lung cancer invasion and metastasis. It could be a potential target for lung cancer therapy and an effective way to prevent recurrence and metastasis of lung cancer.     

Inhibition of proliferation of human small cell lung cancer cells expressing an autocrine system for gastrin releasing peptide by antisense oligodeoxynucleotides to gastrin releasing peptide receptor

The objectives of this study were to investigate the effect of antisense (AS) oligodeoxynucleotides (ODNs) directed against gastrin releasing peptide (GRP) receptor mRNA on proliferation of human small cell lung cancer (SCLC) NCI-H345 cells which express the autocrine system for GRP. The methods used were to expose human SCLC cell lines to antisense ODNs or sense ODNs and to measure their proliferation by spectrophotometric assay or viable cell counts. Our results demonstrated that the single or combined AS ODNs against GRP receptor inhibited proliferation of human SCLC NCI-H345 cells significantly by 37% (P<0.01), but did not inhibit proliferation of either human bronchial epithelial BEAS 2B cells or human SCLC NCI-N417 cells, neither of which express the GRP autocrine system. The sense controls did not significantly inhibit proliferation compared with no treatment controls. Specificity was also demonstrated by the observation that cells exposed to AS ODNs had a decrease in GRP receptor expression as measured by specific binding of 34% (P<0.01), and when all three AS ODNs were used, binding was decreased by 60% (P<0.03). Furthermore, AS ODNs decreased by 75% the maximum percentage of cells responding to GRP in an intracellular calcium release assay. Our conclusions are that antisense ODNs directed against a GRP receptor which is involved in an autocrine loop in human SCLC cells inhibited proliferation of these cells by their impact on reducing GRP receptor expression. Further development of means of increasing AS ODN specificity and effectiveness in human SCLC cell is warranted.     

小细胞肺癌细胞系NCI-H446蛋白质表达谱的建立

背景与目的:小细胞肺癌(smallcelllungcancer,SCLC)是一种侵袭性极强的恶性肿瘤,具有增长迅速、早期转移等特点。目前公开的数据库中尚未见到小细胞肺癌的双向电泳参考图谱及其蛋白表达谱。本研究目的是建立高分辨率的小细胞肺癌细胞系NCI-H446细胞双向凝胶电泳图谱,并初步分析其蛋白质表达情况。方法:用固相pH梯度双向凝胶电泳技术(IPG-DALT)分离NCI-H446细胞总蛋白,凝胶银染显色,ImageMaster2D图像分析系统分析,从凝胶中选取分离较好的蛋白质点,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术和数据库搜索鉴定蛋白质。结果:获得了背景清晰、分辨率和重复性较好的双向凝胶电泳图谱,三块胶平均蛋白质点数为1506±74,匹配点数为1412±56,匹配率达93.4%,三块胶蛋白质点在位置上有较好的重复性,不同胶间蛋白质点在IEF方向偏差是(0.96±0.27)mm,在SDS-PAGE方向偏差是(1.24±0.41)mm。胶内酶解-肽质指纹图分析鉴定了58个蛋白质,其中有原癌蛋白、细胞周期调控和信号转导相关蛋白质。结论:建立了小细胞肺癌细胞系NCI-H446双向电泳参考图谱,并应用质谱技术鉴定了部分蛋白质点,为进一步构建其蛋白质表达数据库提供了基础。     

８-溴-７-甲氧基白杨素对人小细胞肺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的　观察８-溴-７-甲氧基白杨素（ＢｒＭＣｈＲ）对人类小细胞肺癌（ＳＣＬＣ）细胞株ＮＣＩ Ｈ４４６增殖和凋亡的影响。方法　体外培养ＮＣＩ-Ｈ４４６细胞,ＭＴＴ比色法测定ＢｒＭＣｈＲ对ＮＣＩ-Ｈ４４６细胞增殖的抑制作用,平皿克隆形成法测定ＢｒＭ ＣｈＲ对ＮＣＩ-Ｈ４４６细胞集落形成的抑制作用;ＤＮＡ凝胶电泳观察ＢｒＭＣｈＲ诱导基因ＤＮＡ梯形条带,流式细胞术（ＦＣＭ）分析ＢｒＭＣｈＲ对ＮＣＩ-Ｈ４４６细胞周期的影响。结果　ＭＴＴ法显示ＢｒＭＣｈＲ能明显抑制ＮＣＩ-Ｈ４４６细胞增殖,且呈浓度依赖性;平皿克隆形成法结果显示ＢｒＭＣｈＲ能明显抑制ＮＣＩ-Ｈ４４６细胞集落的形成;琼脂糖凝胶电泳检测呈现典型“梯形”ＤＮＡ条带;ＦＣＭ结果显示ＢｒＭＣｈＲ将ＮＣＩ-Ｈ４４６细胞周期阻滞在Ｇ１期。结论　ＢｒＭＣｈＲ具有抑制ＮＣＩ-Ｈ４４６细胞增殖并诱导其凋亡的作用。     

肺癌细胞株APC基因启动子甲基化对其转录的影响

背景与目的:抑癌基因家族性腺瘤样结肠息肉病易感基因(adenomatous polyposis coli,APC)启动子区的高甲基化在很多肿瘤中被发现,与这些肿瘤的发生发展相关.本实验室在肺癌患者肿瘤组织中检测到APC甲基化率达47%,为了研究其在肺癌细胞株中的甲基化情况,并进一步了解甲基化对其转录的影响,本研究检测了3株肺癌细胞的抑癌基因APC启动子甲基化状态及其对该基因转录水平的影响.方法:提取3株肺癌细胞株(肺腺癌细胞株SPC-A1、小细胞肺癌细胞株NCI-H446、大细胞肺癌细胞株NCI-H460)的DNA,以经转甲基处理和未做处理的脐带血DNA为阳性、阴性对照,亚硫酸氢盐化学修饰后,用甲基化特异性基因扩增(methylation specific-polymerase chain reaction,MSP)和甲基化基因芯片对APC基因启动子1A CpG岛甲基化进行研究,并用实时荧光定量PCR(real time-polymerase chain reaction)技术,以Sybr-GreenⅠ为荧光染料,β-actin基因为内参照,检测mRNA转录;对甲基化阳性的NCI-H460细胞,分别用1、5、10、15 μmol/L的5'-杂氮-2'-脱氧胞嘧啶(5-aza-2-deoxycytidine,5-aza-dC)试剂进行脱甲基化,提取RNA,荧光定量检测其转录变化.结果:SPC-A1和NCI-H446细胞APC甲基化阴性,NCI-H460细胞APC甲基化阳性;甲基化芯片检测NCI-H460细胞在APC启动子1A 5个CpG位点均存在甲基化(687、707、714、719、726),SPC-A1和NCI-H446甲基化阴性,荧光定量结果NCI-H460的APC转录较SPC-A1和NCI-H446有明显的下降,仅为二者平均的30.04%;经5-aza-dC脱甲基化作用后,NCI-H460细胞的APC表达增加了约5～10倍,其中10 μmol/L浓度作用下,APC表达增加最多.结论:肺癌细胞株NCI-H460中存在APC基因高甲基化,5-aza-dC脱甲基化试剂可以激活其转录.