不同检材微量血间日疟原虫PCR检测模板制备方法的研究

目的 探寻不同检材微量血间日疟原虫PRC检测模板制备的方法.方法 全血标本采用酚/氯仿抽提法、洗涤沉淀法、Chelex煮沸法和洗涤水煮法;滤纸干血滴及厚血膜标本以Chelex煮沸法和洗涤沉淀法制备模板.以间日疟原虫特异性引物作PCR扩增检测模板制备的效果.结果 采用上述4种不同的方法制备的全血间日疟原虫DNA模板与采用Chelex法和洗涤沉淀法制备的滤纸干血滴以及厚血膜疟原虫DNA模板均可被扩增出1条341bp的间日疟原虫特异性DNA条带,与预期的扩增片断大小一致;不同方法制备的10份间日疟患者血样DNA模板用于PCR扩增检测,结果无明显差异.其中,Chelex煮沸法和洗涤沉淀法对不同检材的疟原虫感染血样DNA模板均能有效制备,且可在同一离心管中进行,减少了交叉污染的机会.结论 Chelex法和洗涤沉淀法简便、实用,适用于不同检材微量血疟原虫PRC模板的制备.     

疟原虫核酸检测技术建立及在献血员筛查应用的研究

目的建立血液中疟原虫检测的核酸技术，探讨应用于献血员筛查的效果。方法根据红细胞内期疟原虫ssurRNA编码基因序列，设计合成三条扩增引物。将5份待检血样混合，采用蛋白酶K消化裂解法制备模板，在同一反应体系中扩增恶性疟原虫和间日疟原虫DNA，诊断鉴别恶性疟和间日疟。与厚血膜镜检法比较评价其灵敏度及特异性。结果将3份恶性疟原虫及10份间日疟原虫感染者的血样随机混入5000份无偿献血者血样中，每5份为一个检测单元，采用PCR方法从感染血样中扩增出分别为436bp和341bp的恶性疟原虫及间日疟原虫特异性的DNA片段，并经序列测定证实扩增片段的正确性；10份间日疟患者血样以及3份恶性疟患者血样均被检出，献血者血样PCR检测结果均为阴性，结果与厚血膜方法完全一致。结论所建立的疟原虫核酸检测技术灵敏度高、特异性好，且可以批量处理，提高了检测的效率，能有效降低疟原虫的输血传播，具有很好的推广使用价值。     

云南省昭通市疟疾的实验室诊断研究

目的通过多种实验室方法综合诊断昭通市疟原虫疑似病例,为疟疾防治提供参考。方法用疟原虫检测试纸条(immune colloidal gold technique,ICGT)先做快速检测,然后按照镜检标准制作厚、薄血涂片,经常规吉氏染色后在油镜下(×1 000)的薄血膜观察疟原虫形态,鉴定虫种。最后针对间日疟原虫(Plasmodium vivax)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)和卵形疟原虫(Plasmodium ovale)4种疟原虫的18s rRNA基因进行巢式PCR扩增。结果 10份县区采集的疑似病例,快速试纸条1532未做,3份可诊断为恶性疟,其它6例皆不能明确诊断;显微镜下4份可明确诊断为恶性疟,其中1201为高密度恶性疟,3份可明确诊断为间日疟,1649县级初次镜检误诊为间日疟,省级镜检确诊为卵形疟,1532县级初次镜检误诊为恶性疟,省级镜检未发现疟原虫;所有病例皆经省级采用巢式PCR扩增,4份确诊为恶性疟,3份确诊为间日疟,1649确诊为卵形疟,1532和A无条带。经快速检测、镜检、巢式PCR,证实昭通市2013年9月以来报告的10例疟疾病例分别为3例间日疟、4例恶性疟、1例卵形疟、2例阴性。结论基层镜检技术不稳定;胶体金法诊断结果不能作为确诊依据,镜检准确性依赖于镜检人员技术水平,剿式PCR法诊断最为准确;疟疾确诊需逐级复核和多种实验室方法综合判断。     

武汉市两种输入性卵形疟巢式PCR检测

目的 了解巢式PCR鉴别卵形疟curtisi及变种wallikeri效果。方法 收集武汉市2008—2015年疟疾患者血样和流行病学资料。提取患者血样中的疟原虫DNA,进行巢式 PCR 检测。结果 采用巢式PCR检测疟疾患者282例,其中恶性疟原虫206例、间日疟原虫62例、三日疟原虫6例、卵形疟原虫19例。巢式PCR结果显示,卵形疟原虫经典型curtisi 和变种型wallikeri 分别扩增出800 bp和780 bp目的 条带。2012—2015年卵形疟占当年疟疾患者分别为4.1%（2/49）、12.2%（9/74）、8.2%（4/49）、11.4%（4/35）,卵形疟总数占全部病例的6.74%,其中,经典型curtisi 14例,变种型wallikeri 3例,混合感染2例,变种型wallikeri检出率占卵形疟26.3%。19例卵形疟病例全部为男性,感染输入地主要分布在撒哈拉沙漠以南地区,2例卵形疟混合感染分别来自安哥拉和尼日利亚。其中有2例卵形疟原虫curtisi型镜检 结果分别为间日疟和恶性疟,1例血片重新复核后为卵形疟,另1例巢式PCR检测为间日疟和卵形疟混合感染型。结论 分子生物学技术可以减少卵形疟误诊的情况;加强卵形疟curtisi及变种wallikeri的巢式PCR 检测,避免误诊。     

间日疟原虫红内期SSUrRNA基因片段的扩增、测序及诊断应用

目的：体外扩增间日疟原虫（深圳株）红内期小亚单位核糖体核糖核酸编码基因（SSUrDNA）片段，克隆测序分析，并探讨其诊断应用。方法：设计1对特异性引物，采用聚合酶链反应（PCR）从间日疟患血样中扩增出间日疟原虫SSUrDNA片段；用PUC19质粒T载体构建重组子导入大肠杆菌JM109；阳性克隆双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列；以SSUrDNA为靶基因，PCR诊断间日疟，双盲法检测40份血样（28份镜检阳性的血样，12份健康血）。结果：间日疟原虫SSUrDNA扩增片段大小约为341bp；阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；序列测定插入片段为341bp，与SalI株顺序相比，仅在第151位处缺失1个碱基C；以SSUrDNA为靶基因，双盲法检测镜检阳性及健康人血样，结果完全正确。结论：所克隆的间日疟原虫SSUrDNA片段序列在间日疟原虫虫株间高度保守，以其为靶基因建立的PCR检测方法适用于间日疟的诊断。     

间日疟原虫孢子期SSUrRNA基因扩增、鉴定及其诊断应用

目的体外扩增、克隆间日疟原虫孢子期SSUrRNA编码基因特异性片段，分析其分子特征，评价其核酸诊断应用效果。方法根据间日疟原虫基因库相关核酸序列设计引物，采用聚合酶链反应技术从间日疟患者血样DNA提取物中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段，与pGEM—Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109；阳性克隆以双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定分析其序列特征；以SSUrDNA为靶基因，建立间日疟PCR诊断方法，并以镜检法为标准评价其用于间日疟原虫感染的检测效果。蛄果从间日疟患者血样中扩增的SSUrDNA片段大小约为267bp；阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；核酸序列测定显示插入的SSUrRNA基因扩增片段，含有267个核苷酸，与间日疟原虫Sall株孢子期SSUrRNA基因序列比较，同源性为99．3％，其中第220住为插入了1个碱基“T”，243住碱基由“G”取代了“T”。将纯化的含有SSUrRNA靶基因的重组质粒以正常人血液核酸提取液倍比稀释成浓度梯度作模板，PER扩增结果显示检测灵敏度至少迭102copy／μl；特异性检验显示仅间日疟原虫患者血样扩增出约267bp的特异性基因片段，而恶性疟原虫、弓形虫、血吸虫、肝吸虫感染患者血样及正常人血未见特异性扩增条带。以镜检法为参照标准，PCR敏感性为100％（102／102），特异性为100％（76／76）。结论所扩增克隆的间日疟原虫孢子期SSUrDNA片段序列具有种特异性且相对稳定，不同地理株间存在单核苷酸多态性，以其为靶基因建立的PCR检测方法敏感、特异，具有良好的推广使用价值。     

应用双重PCR检测海南疟区发热病人的效果

目的 评价双重PCR检测疟区发热病人的效果。方法 对疟区求诊发热病人，手指取血分别制作厚薄血膜片和滤纸血斑作为检测血样。参照献用恶性疟原虫PF1－2和间日疟原虫PV3－5为特异性引物，同在一个反应体系常规进行PCR，扩增片段分别为206bp和431bp。同时镜检厚血膜作对照。结果 该反应体系最低可检出原虫血症为1个恶性疟原虫／μl血和10个间日疟原虫／μl血的感染；检测132例疟区发热病人血样的阳性率为65．1％，而镜检法为64．4％，且有1例漏诊和3例误诊，两法符合率为97％。结论 双重PCR用于疟区发热病人检测，较镜检敏感、特异，适合我国恶性疟与间日疟混合流行区的疟疾诊断，还可用于血检质量的监控。     

薄血膜及滤纸片干血滴分离疟原虫DNA方法的比较

DNA检测以特异性强、敏感性高、简便快速 ,被广泛应用于疟疾的诊断及普查。疟原虫 DNA的分离方法虽多 ,但多以静脉血分离为主 [1 ] 。有学者应用指尖取血制作滤纸片干血滴及静脉全血制作的薄血膜进行疟原虫 DNA的分离 [2 ] 。本文就两种方法对疟原虫 DNA的分离进行比较 ,探讨其应用价值。1　材料与方法1.1　血样制备1.1.1　恶性疟原虫血样品制备 :用采自非疟疾流行区、经姬姆萨染色显微镜检查确诊恶性疟原虫阴性的正常人静脉血对人工培养的恶性疟原虫 FCR3株进行倍比稀释 ,制成恶性疟原虫浓度分别为 1.5× 10 4/μl、1.5× 10 3/μl、…     

干血滤纸片试剂盒和水煮法提取间日疟原虫DNA用于PCR检测的比较

目的：比较水煮法和干血滤纸片基因组DNA分离试剂盒提取间日疟原虫DNA用于PCR检测及克隆研究的差异。方法：采集间日疟患者末梢血制备干血滤纸片,分别用水煮法和QIAamp DNAmini kit试剂盒提取间日疟原虫基因组DNA10份。PCR扩增LDH基因,并克隆质粒pGEM-PvLDH。分析比较2种提取方法的差异。结果：水煮法和试剂盒法提取的间日疟原虫gDNA,均扩增出LDH基因特异条带,但试剂盒提取的gDNA目的条带亮于水煮法。结论：水煮法操作简便、快速、经济,在等量血源条件下,所得DNA量较少、纯度较低;试剂盒提取可获得较高的得率,在定量检测和复合扩增时受到的影响因素较少,成功率较高。     

套式/多重PCR检测疟疾感染的应用研究

目的了解标签引物-套式/多重PCR技术在检测疟疾感染中的现场应用价值。方法随机采取我省疟疾流行区有发热症状的居民及家庭成员的耳垂血79份,同时制作厚血片和滤纸血样本各1份,用标签引物-套式/多重PCR检测所采集滤纸血样本中的疟原虫,并与镜检法进行比较。结果79份样本中,用标签引物-套式/多重PCR技术检出间日疟原虫阳性6例,镜检初检出10例间日疟原虫阳性,经复查血片后有4例排除了疟疾感染。镜检复核阳性的6例样本PCR均为阳性。以镜检复核为标准,两法阳性和阴性符合率为100%。结论标签引物-套式/多重PCR检测疟疾感染具高度敏感性和特异性,对疟疾鉴别诊断和明确诊断具有重要价值。     

多重荧光定量PCR测定疟原虫方法建立

目的建立可同时检测四种疟原虫的多重荧光定量PCR方法。方法 PCR扩增四种疟原虫目的片段,克隆并构建标准质粒,进行梯度稀释。体系按浓度加入五重引物探针,对临床四种疟原虫阳性血样及单一腺病毒和肺炎支原体阳性血样、人基因组进行特异性检测。将本地区优势虫种恶性疟及间日疟阳性血样混合并检测。每个反应做一式三份验证重复性。检测标准品梯度浓度,获得体系最低检测限。结果成功构建四种疟原虫标准质粒。对20份样本进行检测,其中15份恶性疟,3份间日疟,1份三日疟,1份卵形疟,与原有确证结果一致。对单一腺病毒及肺炎支原体阳性血样、人基因组检测结果均为阴性。恶性疟及间日疟阳性血样混合检测显示3条特异性扩增曲线。三个复孔的变异系数在0.17~4.96之间。恶性疟可检测到10~2copies/m L,间日疟、三日疟、卵形疟可检测到10~3copies/m L。结论建立五重荧光定量PCR检测四种疟原虫特异性及重复性均较好,灵敏度高,可用于疟原虫快速筛选及分型鉴定。     

Nested polymerase chain reaction in detection of Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes

目的　检测蚊体内间日疟原虫DNA。方法　以疟原虫SSurRNA为模板 ,采用套式PCR扩增间日疟原虫特异性 12 1bp片段。结果　在实验感染蚊中 ,套式PCR可检测到低至 3个间日疟原虫子孢子的DNA或 10 0只蚊中的一只阳性蚊 ,而其它 3种人疟原虫或正常蚊DNA未扩增出条带。结论　套式PCR的敏感性及特异性表明 ,该方法在检测蚊体内少量疟原虫感染时 ,比DNA探针或直接PCR具有更大优越性。     

中缅边境居民疟疾感染的疟原虫抗原检测、镜检和PCR筛查

目的 了解云南省沧源县抵边村寨居民和境外周边居民疟疾感染情况，比较疟原虫抗原检测（RDT）、镜检和PCR在低疟区和消除区居民疟疾筛查效果，为预防疟疾消除后再输入提供依据。方法 2020年8月—2021年3月，在中缅边境地区云南省临沧市沧源佤族自治县班老乡、缅甸掸邦第二特区勐冒县班歪区梅不老乡、缅甸掸邦第二特区南邓特区拥摸和大岩乡3个调查点，采集调查对象指尖血，运用RDT、疟原虫显微镜检查法、荧光定量PCR与巢式PCR法检测疟原虫感染情况。结果 共采集1 040人份血样，含中国居民606人、缅甸居民434人。其中男性506人，女性534人，年龄0～<5、5～<15、15～<30、30～<45、45～<60和≥60岁分别有51、283、187、232、205和82人。经疟原虫抗原检测试剂盒法检测1 040人均为阴性，疟原虫显微镜检查法检出间日疟阳性1份，疟原虫检出率为0.10%，荧光定量PCR与巢式PCR检出间日疟阳性1份，疟原虫检出率为0.10%。其中，缅甸掸邦第二特区勐冒县班歪区梅不老乡检出间日疟1例，疟原虫检出率为0.35%，云南省临沧市沧源佤族自治县班...     

海南省三亚市1名间日疟原虫带虫者的调查与处置

目的分析和总结海南省三亚市天涯区高峰一名间日疟原虫带虫者的调查与处置,为防治和消除疟疾提供科学依据。方法通过回顾性调查收集该带虫者发现、诊断及处置等的相关信息,查阅三亚市历年疟疾资料等。结果在处置1起本地三日疟疫情中,通过PCR(巢式)检测发现1名间日疟无症状感染者,该无症状感染者入院治疗时无畏寒、发热等不适症状,体温正常,血常规检查未见异常,血涂片镜检和RDT检测均为阴性,但是PCR(巢式)检测为阳性;该无症状感染者为三亚本地居民,既往无疟疾史和输血史。近3年,未曾外出务工,也无畏寒、发热等疟疾临床表现;该无症状感染者经治疗后,多次随访血涂片镜检、RDT和PCR(巢式)检测均为阴性。后经另一个省级疟疾诊断参比实验室通过PCR荧光探针法检测该感染者治疗前采集的血样,其结果为阴性。随访至今该感染者无复发,现正常工作和生活。结论该间日疟原虫带虫者虽然一开始被诊断为本地间日疟无症状感染者,但其流行病学调查结果没有直接和明显的证据支持。此外,两次不同PCR方法的检测,其结果不一样,故不能排除第一次PCR检测结果为假阳性的可能。提示今后碰到此类情况,除考虑流行病学调查情况和临床表现的同时,还需寻求更多准确和有力的证据。     

双重PCR用于高疟区疑似疟疾病人诊断效果评价

目的对高疟区＂三热＂疑似疟疾病人双重PCR检测与传统镜检法检测的比较,探讨双重PCR应用于临床诊断疟疾的前景。方法在高疟区门诊采集就诊的＂三热＂疑似疟疾病人末梢滤纸血,用chelex-100提取DNA模板进行双重PCR检测,同时与显微镜镜检厚血膜查找疟原虫进行比较。结果在334例疑似疟疾病例的血样中,双重PCR检测疟原虫敏感性为96.1%、漏检率为3.9%。镜检法检测疟原虫敏感性为86.1%、漏检率为13.9%。结论双重PCR在诊断疟疾上比传统镜检法敏感性高,适合于临床实验室对疟疾诊断。     

云南省1例输入性三日疟实验室检测分析

目的对云南省1例输入性疟疾患者的血样进行实验室检测分析。方法采用疟原虫属特异性引物和种特异性引物对该样本进行巢式PCR检测,将PCR扩增结果进行序列测定,并对获得的序列进行Blast比对,分析其分子性状。结果使用疟原虫属特异性引物r PLU5和r PLU6对血样进行PCR检测,第一轮未扩增出预期条带;使用疟原虫种特异性引物对血样进行PCR检测,扩增出预期大小约141bp的三日疟条带,无对应大小的恶性疟、间日疟和卵形疟扩增条带产生。序列分析表明,扩增片段长度为115bp,进行Blast比对发现,与Genbank中注册编号为gb|KJ934253.1的三日疟对应部分的基因序列同源性为96%。结论通过使用巢式PCR、序列测定分析等方法,基本证实该病例为三日疟原虫感染。     

聚合酶链反应检测间日疟原虫感染的探讨

研究一种适用于流行式人群聚合酶链反应检测间日疟原虫感染的方法。方法：用滤纸片与毛细管两种方法收集血样本，１％Ｔｒｉｏｎｘ－１００裂解，煮沸法处理血样，对全部血样进行ＰＣＲ检测，并与常规镜检作比较。结果２００例血样ＰＣＲ法阳性８．０％高于镜检阳性率３．５％，滤纸血样与毛细管血样ＰＣＲ扩增取得相同的效果。结论ＰＣＲ检测间日疟原虫方法具有快速，敏感，实用性强等优点，有一定的推广应用价值。     

湿血片荧光素吖啶橙染色法检验间日疟原虫的效果

厚血膜和薄血膜用荧光素吖啶橙染色检查疟原虫,国内外已证明有疟原虫易于发现和检出率高等优点;但应用于门诊检查,还不能适应快速诊断的要求,主要是厚血膜干燥要一定时间.为此,我们进行了湿血片吖啶橙染色检验疟原虫的研究,并与湿摁片吉氏伊红皂素染色法及厚、薄血膜常规染色法进行对照比较,现报告如下.材料与方法一、荧光素染液的配制:所用荧光素为吖啶橙粉,以吖啶橙粉1克加蒸馏水99毫升配成1%吖啶橙母液,置于棕色玻璃中,保存于4—8℃冰箱中备用.此次所用者为保存了三年多的吖啶橙母液.仍然有效.     

关于变异间日疟原虫

近年来,江苏发现有变异的间日疟原虫(据张奎等1977、1979年报道),主要特征为间日疟原虫滋养体期具有多核、同期和不同期的重复感染,部分疟原虫游离于红细胞外,受染的红细胞胀大变形等。据此,1980年10月起,我们复查了历年保持的广西间日疟原虫薄血膜制片标本。在查片镜检中也发现了这种变异的间     

薄血膜片与厚血膜片对猴肝囊原虫检出率的比较

薄血膜片与厚血膜片对猴肝囊原虫检出率的比较吴军＊赛白胡黎娅（中国实验动物云南灵长类中心，昆明６５０２１６）在检查猴肝囊原虫时，一般采用薄血片法。在薄血膜片中能清晰地观察到寄生在动物红细胞中原虫的形态特征，也便于同猴疟原虫相区别。但猴肝囊原虫在猴外周血...