TNF—a对内皮细胞白介素—8基因表达的影响

IL-8作为一种趋化细胞因子在炎症反应中具有重要作用，其在内皮细胞内的表达受多种细胞因子的调节。本文用TNF-a孵育培养的人脐静脉内皮细胞不同时间后，用RT-PCR法检测内皮细胞内IL-8mRNA的表达，并用免疫细胞化学染色法检测内皮细胞内NF-kB的激活。结果发现：（1）未用TNF-a孵育的内皮细胞IL-8表达量很少，TNF-a孵育1小时后IL-8表达明显增加，3h进一步增加；6h IL-8表达降低，9h进一步降低至基础水平；（2）未用TND-a孵育的内皮细胞核NF-kB p65免疫细胞化学染色呈阴性，NF-a孵育1，3h后NF-kB p55免疫细胞化学染色呈阳性，6h时后呈弱阳性，9h后呈阴性。提示：TNF-a可诱导内皮细胞表达IL-8并可激活内皮细胞内NF-kB，二者的时相过程基本一致。作者认为TNF-a诱导IL-8在内皮细胞内表达可能与转录因子NF-kB的激活有关。     

脂多糖诱导大鼠心肌细胞NF-κB、IκB-α的表达及意义

目的研究脂多糖(LPS)诱导大鼠心肌细胞NF-κB,IκB-α的表达及意义。方法100ng/mlLPS刺激心肌细胞0、0.5、1、2、4、6、8h和0、10、50、100ng/mlLPS刺激1h,免疫细胞化学检测NF-κBp65的表达,Westernblot检测IκB-α表达。结果LPS的刺激迅速激活心肌细胞NF-κBp65的表达,于1h时达高峰;IκB-α的表达先降低,后升高。结论LPS可诱导大鼠心肌细胞NF-κB的激活,并通过激活心肌细胞核因子-κB途径从而促进细胞损伤。     

siRNA对小鼠血管内皮细胞NF-κBp65表达的抑制作用

探索RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术在抑制血管内皮细胞激活中的应用前景。利用阳离子脂质体LipofectamineTM2000作为转染试剂将化学合成的小鼠NF-κBp65的小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)转染入小鼠EOMA细胞,RT-PCR测定细胞内NF-κBp65mRNA表达,Westernblot检测细胞内NF-κBp65蛋白水平。同时观察siRNA对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的NF-κB激活的抑制作用。结果显示:在转染siRNA后的第24小时,细胞内NF-κBp65mRNA水平降低,蛋白表达量明显减少,而在第48小时、72小时细胞内NF-κBp65蛋白已经无法测出;在TNF-α刺激后,转染siRNA的细胞组内NF-κBp65的表达也明显受到抑制。说明RNAi技术可以抑制NF-κBp65的表达,为进一步研究血管内皮细胞的保护提供了有效的方法。     

流体低切应力对内皮细胞IL—8mRNA表达的影响

为证实内皮细胞IL-8表达不仅受化学因子的调节,而且还受力学因素的影响。我们用低层流切应力（4.2dyne/cm^2）处理培养的人脐静脉内皮细胞后采用RT-PCR法检测内皮细胞IL-8基因表达,并用免疫细胞化学染色法检测内皮细胞内NF-kB激活的影响,结果发现：①未用切应力处理和切应力作用0.5h后内皮细胞IL-8mRNA表达量很少,切应力作用1h后内皮细胞IL-8 mRNA表达增加,2h进一步增加。②未用切应力处理和切应力作用0.5h内皮细胞核内NF-kBp65染色阴性,切应力作用1h呈弱阳性,2h呈阳性。提示低层流切应力可诱导内皮细胞表达增加,IL-8表达量与切应力作用时间有关。流体切应力可诱导内皮细胞内NF-kB的激活,激活程度与作用时间有关。低切应力诱导内皮细胞表达IL-8,可能在急性炎症和动脉粥样硬化发生、发展过程中具有重要作用。     

抗氧化剂和NF-κB对大肠癌细胞IL-8表达的作用及机制

目的：探讨NF-κB在大肠癌细胞IL-8诱导表达中的作用及抗氧化剂对大肠癌细胞IL-8诱导表达的影响及其机制。 方法： IL-8 mRNA表达采用逆转录/聚合酶链反应(RT/PCR)检测，培养上清IL-8蛋白含量用ELISA检测，EMSA法测定细胞核内NF-κB结合活性。 结果： 抗氧化剂可阻断大肠癌细胞培养体系TNF-α诱导的IL-8生成及IL-8 mRNA的表达, TNF-α可诱导大肠癌细胞NF-κB的激活并被抗氧化剂阻断。 结论： TNF-α诱导的大肠癌细胞IL-8基因和蛋白表达依赖于NF-κB的激活；抗氧化剂可通过抑制NF-κB的活化而阻断IL-8基因和蛋白的诱导表达。     

切应力诱导内皮细胞表达IL-8基因的信号转导

目的现已确定动脉粥样硬化是一种炎症疾病,单核/巨噬细胞在动脉内膜下集聚是导致动脉粥样硬化损伤发展的基础;血流低切应力促进其损伤的发展.趋化细胞因子MCP-1对单核/巨噬细胞起强力趋化和激活作用,并有报告切应力可诱导其基因的表达.新近报道在层流作用下IL-8亦是单核/巨噬细胞与内皮细胞相互作用的重要调节因子.本研究旨在观察切应力诱导人脐静脉血管内皮细胞IL-8mRNA的表达,探讨Toll/NF-κB信号转导通路对其基因激活的介导作用.方法4.2dyn/cm2层流切应力处理人脐静脉血管内皮细胞,提取总RNA,应用RT-PCR和Northern杂交技术检测切应力作用不同时间后IL-8、TLR-2和TLR-4mRNA的表达.免疫印迹技术检测IκB磷酸化和降解.免疫荧光细胞化学染色检测NF-κB胞核易位.结果切应力作用0.5h后IL-8mRNA表达逐渐增高,2h时达到很高水平.胞浆蛋白IκB和磷酸化IκB的免疫印迹显示4.2dyn/cm2层流切应力作用10min后磷酸化IκB水平即显著增加,30min后又逐渐下降,与之相应IκB含量随切应力作用时间而逐渐下降,到1h时几乎测不出,表明在切应力作用下内皮细胞胞浆NF-κB抑制因子IκB发生了磷酸化和降解.NF-κBp65亚基免疫细胞化学染色显示在4.2dyn/cm2切应力作用0.5h后内皮细胞核逐渐着色,1.5h时细胞核几乎全着色,表明胞浆NF-κB在切应力作用下发生了易位,从胞浆进入胞核.RT-PCR检测和Northern杂交分析显示内皮细胞固有表达TLR-2和TLR-4mRNA,在4.2dyn/cm2切应力作用1h后TLR-4mRNA的表达显著增强,而TLR-2mRNA的表达变化不明显.结论流体切应力可诱导血管内皮细胞表达IL-8,活化转录因子NF-κB.在切应力作用下内皮细胞TLR-4mRNA表达增强,提示Toll/NF-κB信号转导通路可能参与动脉粥样硬化性炎症反应.     

CCK-8通过调节κB活性促进大鼠滑膜细胞株RSC-364 IL-6转录

目的观察硫酸化八肽胆囊收缩素(sCCK-8)对TNF-α诱导大鼠滑膜细胞株RSC-364 IL-6基因表达的影响及核因子NF-κB活性,以探讨CCK-8对类风湿性关节炎(RA)的调控机制。方法大鼠滑膜细胞株RSC-364经TNF-α、sC-CK-8、CCK受体拮抗剂丙谷胺及溶剂单独或联合应用孵育3 h,用RT-PCR检测细胞IL-6 mRNA的表达,孵育1 h,用电泳迁移率检测NF-κB活性,孵育30 min,用Western blot检测胞浆I-κB蛋白表达。结果sCCK-8(10-8~10-6mol/L)明显增加TNF-α诱导的IL-6 mRNA表达及NF-κB活性,呈剂量依赖性,降低胞浆中I-κB蛋白水平,并可被丙谷胺所拮抗。结论sCCK-8在类风湿性关节炎(RA)发病过程中可能具有调控作用。     

NF-κB信号通路蛋白和细胞因子在金黄色葡萄球菌PV杀白细胞素相关肺炎症性损伤中的作用

目的 探讨NF-κB信号通路蛋白和细胞因子在金黄色葡萄球菌PV杀白细胞毒素(PVL)介导的肺炎症性损伤中的变化和作用.方法 取30只新西兰大白兔随机分为2组,每组各15只.rPVL组用重组PVL灌入,正常对照组使用PBS灌人.造模后,于3、6、9h处死兔,每个时间段5只,取肺组织做病理学检查;ELISA方法检测肺组织匀浆IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α蛋白含量;免疫组织化学染色检测肺组织中NF-κB p65蛋白.结果 rPVL组兔肺组织病理检查显示有弥漫性炎性细胞浸润、出血、水肿等肺损伤表现;肺组织匀浆中IL-6、IL-8、TNF-α含量随感染时间延长逐渐升高,IL-10含量于9h开始升高;NF-κB p65蛋白活化强度随感染时间延长逐渐增强.结论 NF-κB信号通路蛋白激活及细胞因子大量释放是PVL相关肺损伤重要的发病机制之一,下调肺内NF-κB激活细胞数量有望成为治疗PVL相关肺损伤的途径.     

RNAi沉默NF-κB p65对小鼠巨噬细胞细胞因子表达的影响

目的:探讨RNA干扰(RNAi)技术在抑制NF-κB p65表达、调控LPS活化后巨噬细胞细胞因子表达中的应用.方法:利用阳离子脂质体将NF-κB p65小干扰RNA(siRNA)瞬时转染入Ana-1细胞,RT-PCR及Western blotting法检测其沉默效率,ELISA法检测LPS(1 mg/L)刺激下0 h、4 h、12 h和24 h Ana-1细胞培养上清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10浓度.结果:NF-κB p65 siRNA转染24 h后,NF-κB p65在基因水平及蛋白水平表达均被明显抑制(P<0.05).RNA干扰组Ana-1细胞培养上清中细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达在相应时点内均较对照组明显降低(P<0.05),IL-10表达显著升高,在12 h和24 h差异显著(P<0.05).结论:体外实验初步证实RNAi技术能有效沉默小鼠巨噬细胞NF-κB p65基因的表达,下调其下游调控的促炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及上调抑炎症细胞因子IL-10的表达,从而抑制过度的炎症反应.     

丙酮酸乙酯对LPS致急性肺损伤大鼠肺组织NF-κB p65及TNF-α和IL-lβ的影响

目的:观察丙酮酸乙酯(EP)对内毒素性急性肺损伤(ALI)大鼠肺组织核转录因子-κB(NF-κB)p65表达及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)含量的影响,探讨EP可能的肺保护机制。方法:雄性SD大鼠30只随机分为三组(n均=10):正常对照组,静脉注射与其它二组等量生理盐水;LPS组,静脉注射脂多糖(LPS)5mg/kg复制大鼠ALI模型;EP+LPS组,于静脉注射LPS前1h腹腔内注射EP(40mg/kg)。所有动物于注射LPS或生理盐水后4h颈动脉放血处死,取肺组织用Westernblot测定其NF-κBp65的表达,用ELISA测定其TNF-α和IL-1β的含量。结果:与对照组相比,LPS组、EP+LPS组肺组织NF-κBp65表达增加,肺组织TNF-α和IL-lβ含量升高(P0.05);与LPS组相比,EP+LPS组肺组织NF-κBp65表达降低,肺组织TNF-α和IL-lβ含量降低(P0.05)。结论:EP通过下调大鼠LPS诱导的肺组织NF-κBp65表达,降低了TNF-α和IL-lβ的释放。EP可减轻ALI大鼠肺的炎症反应。     

LLDT-8对类风湿关节炎滑膜细胞NF-kB信号通路的影响

研究新雷公藤衍生物雷藤舒[(5R)-5-hydroxytriptolide,LLDT-8]对TNF-α联合IL-17诱导的类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者的成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte,FLS)NF-κB信号通路及其下游IL-6、IL-8表达的影响。体外培养FLS,TNF-α联合IL-17体外诱导FLS,ELISA法检测FLS上清液中IL-6、IL-8的含量;RT-PCR法检测FLS中IL-6、IL-8mRNA的表达;Western blotting检测FLS p-p65、p-IκBα的表达;免疫荧光染色法检测FLS NF-κB p65的核转运。研究发现LLDT-8可抑制NF-κB信号通路下游炎性因子IL-6、IL-8的表达;LLDT-8可抑制FLS NF-κB信号通路的IκBα磷酸化、p65活性;LLDT-8可显著抑制TNF-α联合IL-17诱导的NF-κB p65向FLS核内移位。由此LLDT-8可能通过调控NF-κB信号通路的活化,抑制IL-6、IL-8表达最终达到抗炎作用,将为进一步的临床应用提供实验依据。     

siRNA对小鼠血管内皮细胞NF-κB p65表达的抑制作用

探索RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术在抑制血管内皮细胞激活中的应用前景.利用阳离子脂质体LipofectamineTM000作为转染试剂将化学合成的小鼠NF-κB p65的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染人小鼠EOMA细胞,RT-PCR测定细胞内NF-κB p65 mRNA表达,Westem blot检测细胞内NF-κB p65蛋白水平.同时观察siRNA对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的NF-κB激活的抑制作用.结果显示在转染siRNA后的第24小时,细胞内NF-κB p65mRNA水平降低,蛋白表达量明显减少,而在第48小时、72小时细胞内NF-κB p65蛋白已经无法测出;在TNF-α刺激后,转染siRNA的细胞组内NF-κB p65的表达也明显受到抑制.说明RNAi技术可以抑制NF-κB p65的表达,为进一步研究血管内皮细胞的保护提供了有效的方法.     

过表达SIRT1抑制脂多糖诱导的胰岛β细胞炎症因子表达及NF-κB信号通路激活

目的研究沉默信息调节因子1(SIRT1)对脂多糖(LPS)诱导的胰岛β细胞炎症因子表达及核因子-κB(NF-κB)信号通路激活的影响。方法用LPS处理胰岛β细胞,qRT-PCR和Western blot测定细胞中SIRT1表达变化。用pcDNA3.1-SIRT1慢病毒感染胰岛β细胞,qRT-PCR检测细胞中白细胞介素-6(IL-6)mRNA和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达水平,流式细胞术测定细胞凋亡变化,Western blot检测细胞中Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)、核因子-κBp65亚型(NF-κBp65)、Toll样受体4(TLR4)蛋白表达水平。结果 LPS处理后的胰岛β细胞中SIRT1表达水平降低。pcDNA3.1-SIRT1慢病毒感染可以提高LPS条件下胰岛β细胞中SIRT1表达水平。LPS处理后的胰岛β细胞中IL-6 mRNA和TNF-αmRNA表达水平升高,凋亡率升高,细胞中Bax、Cleaved Caspase-3、NF-κBp65、TLR4蛋白表达升高。过表达SIRT1可以降低LPS条件下胰岛β细胞中IL-6 mRNA和TNF-αmRNA表达水平,抑制细胞凋亡,减少细胞中Bax、cleaved Caspase-3、NF-κBp65、TLR4蛋白表达。结论 SIRT1减少LPS诱导的胰岛β细胞炎症因子表达并下调细胞中NF-κB信号激活水平。     

NF-κB和PI3K-Akt通路调节肺炎链球菌HSP40诱导小鼠巨噬细胞免疫应答

目的研究肺炎链球菌热休克蛋白40(heat shock protein 40,HSP40)诱导巨噬细胞免疫应答的机制。方法表达重组HSP40蛋白,并在体外诱导培养小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derived macrophage,BMDM);使用NF-κB、PI3K和JAK的抑制剂预处理BMDM后,ELISA检测其对HSP40诱导的TNF-α和IL-6表达的影响;HSP40刺激BMDM后,Western blot法检测NF-κBp65和Akt的磷酸化水平。结果 NF-κB和PI3K抑制剂可显著下调IL-6和TNF-α的表达,而JAK抑制剂无此效果。HSP40可增强NF-κBp65和Akt磷酸化水平。结论 NF-κB和PI3K-Akt通路参与调控肺炎链球菌HSP40诱导BMDM免疫应答的过程。     

脂多糖体外诱导RAW264.7细胞产生NF-κBp65、iNOS及TNF-α

目的 研究脂多糖诱导RAW264.7细胞产生NF-κBp65、TNF-α及诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)的剂量、时间关系,为抗炎药物的体外筛选提供实验依据.方法 调整RAW264.7细胞密度为1×109/L,种6孔板,实验设正常对照组、(1、2、5、10) μg/mL脂多糖组,免疫细胞化学方法检测NF-κBp65、iNOS及TNF-α的水平.结果 (1、2、5、10) μg/mL脂多糖可显著诱导产生NF-κBp65 (P ＜0.05),2～10 μg/mL时可显著诱导iNOS的生成(P＜0.01),5～ 10μg/mL时可显著诱导TNF-α的生成(P＜0.05).结论 5～ 10μg/mL脂多糖可同时诱导产生NF-κBp65、iNOS及TNF-α,模型性能稳定,可用于多细胞因子途径的抗炎药物筛选.     

白芍总糖苷对RA大鼠足爪组织中NF-κB/p65蛋白表达的抑制作用

目的:探讨白芍总糖苷(TGP)对类风湿性关节炎(RA)大鼠足爪组织中核转录因子NF-κB/p65蛋白表达的抑制作用和对血清中炎性细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-10等水平的影响。方法:建立Ⅱ型胶原诱导的RA大鼠模型。用免疫组化染色法检测足爪组织中NF-κB/p65蛋白的表达。用ELISA法检测RA大鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-10的含量。结果:TGP能以剂量依赖性地下调NF-κB/p65蛋白的表达,降低RA大鼠血清中TNF-α、IL-1β的水平。结论:TGP对RA大鼠炎症的抑制作用,可能与其下调NF-κB/p65蛋白的表达,抑制促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β的产生有关。     

Vasostatin-1上调脐静脉内皮细胞表达HO-1减轻软脂酸所致炎症反应

目的研究vasostatin-1(VS-1)对软脂酸诱导调脐静脉内皮细胞所致炎症反应和氧化应激的影响,并探讨其潜在的机制。方法体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),用100 nmol/L VS-1预孵育2 h,Western blot检测HUVECs中血红素氧合酶-1(HO-1)的表达,酶学法测定其活性的变化。随后检测VS-1处理前后Nrf2的核转位情况,并采用siRNA沉默其表达观察其对HO-1表达的影响。在研究VS-1对软脂酸所致的炎症反应时,首先以VS-1孵育细胞2 h,随后加入100μmol/L软脂酸作用12 h。ELISA测定IL-6和TNF-α的分泌;荧光探针测定胞内活性氧类(ROS)的产生;DNA结合实验测定NF-κB活性的变化。结果 100 nmol/L VS-1孵育HUVECs细胞6 h即可诱导HO-1的表达并上调其酶活性,并持续至18 h。同时,VS-1也能上调细胞核内Nrf2的水平并增加其DNA结合活性;采用Nrf2 siRNA沉默其表达后,HO-1的表达水平和酶活性显著下降;软脂酸处理细胞后,细胞核内p65水平显著增高,细胞培养上清中IL-6和TNF-α含量以及胞内ROS含量明显增多,NF-κB的DNA结合活性也明显增强。而经100 nmol/L VS-1孵育后,NF-κB的活性有所降低,IL-6、TNF-α和ROS含量均有所减少;采用HO-1抑制剂SnPP共同孵育细胞后,VS-1对细胞因子以及ROS的抑制效应有所减弱。结论 VS-1上调脐静脉内皮细胞表达HO-1,从而减轻软脂酸所致炎症反应。     

PPARγ配体4i通过抑制NF-κB和MAPK信号通路抑制小鼠巨噬细胞炎性细胞因子的产生

目的探讨新型过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)配体4i的体外抗炎作用及机制。方法取对数生长期RAW264. 7小鼠腹腔巨噬细胞,经100 ng/m L脂多糖(LPS)诱导,采用ELISA检测10μmol/L 4i对巨噬细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)分泌的影响;采用Western blot法检测4i对核因子κBp65(NF-κBp65)、核因子κB抑制蛋白α(IκBα)、c-Jun氨基端激酶(JNK)、胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、p38丝裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)活性的影响,加入不可逆的PPARγ拮抗剂GW9662(5μmol/L)探讨PPARγ在NF-κB和MAPK相关蛋白表达中的作用;采用SYBYL 8. 1软件进行分子对接分析探讨4i与PPARγ蛋白的结合特性。结果 4i显著抑制TNF-α和IL-6的产生呈时间依赖性;不同程度抑制NF-κBp65、IκBα、JNK、ERK1/2和p38MAPK蛋白的磷酸化水平,且抑制作用被GW9662所逆转; 4i能与PPARγ受体较好地结合。结论4i通过激活PPARγ抑制NF-κB和MAPK信号通路相关蛋白的活化,抑制TNF-α、IL-6等的产生,发挥抗炎作用。     

模型大鼠在电磁脉冲作用下大脑额叶皮层TNF-α、IL-1β、IL-6和NFκBp65表达的变化

目的:研究电磁脉冲(electromagnetic pulse,EP)作用下大鼠大脑额叶皮层TNF-α、IL-1β、IL-6和NFκBp65表达的变化并讨论其意义。方法:成年雄性SD大鼠随机分为四组:对照组、EP照后1 h组、EP照后6 h组和EP照后24 h组。通过HE染色、ELISA和Western Blot方法,确定EP(400 k V/m,200个脉冲)连续辐照3 d后在不同组大鼠大脑额叶皮层神经元的组织学变化、额叶皮层肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和鱼核因子-κBp65(NF-κBp65)表达的变化。结果:(1)HE染色结果显示:经EP辐照6 h后,大脑额叶皮层内异常神经元数目增多,异常神经元细胞核边移,胞质与细胞核深染。(2)ELISA结果显示:EP辐照后,大脑额叶皮层内TNF-α水平随时间逐渐升高,以辐照后6 h明显(P0.05),但24 h后逐渐恢复。各实验组IL-1β和IL-6含量均较对照组明显升高,辐照后1 h升高最明显(P0.05)。(3)Western Blot结果显示:与对照组相比,EP辐照6 h后大脑额叶皮层内NFκBp65表达明显增高(P0.05)。结论:电磁脉冲照射可以引起大鼠大脑额叶皮层神经元损伤和炎性反应使IL-1β和IL-6含量增高,其机制可能是通过诱导NFκB活化并启动炎性反应,从而引起大脑额叶皮层神经元损伤。     

流体切应力对内皮细胞IL-8基因表达的影响及信号转导

目的流体切应力对于维持血管的稳定有着重要的作用.另外在一些病理情况下,例如动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病的发病过程中,流体切应力也扮演着关键角色.我们以往的实验结果证实:以低流体切应力(4.2dyne/cm2)处理培养的人脐静脉内皮细胞1 h,其IL-8mRNA的表达上调;处理2 h其表达量上调更为明显.在本实验中我们将进一步阐明流体切应力对培养的人脐静脉内皮细胞IL-8基因表达、蛋白生成的影响及其信号转导途径.方法分别用实时定量RT-PCR及定量三明治ELISA检测IL-8基因表达及蛋白生成;通过基因转染及流式细胞数检测IL-8报告基因pEGFP1-IL8USCS经流体切应力作用后的激活情况;用免疫荧光化学染色观测对照和层流切应力处理以后NF-κB核转移情况;将对照和层流切应力处理后的内皮细胞裂解物进行I-κB和磷酸化的I-κB的免疫印迹实验,以检测切应力诱导的I-κB磷酸化和降解的情况;RT-PCR、Northern杂交和免疫荧光细胞化学染色观察TLR-4和TLR-2在人脐静脉内皮细胞上的表达;用RT-PCR技术从血管内皮细胞扩增胞内区段缺失突变TLR-4 cDNA克隆于真核表达质粒pcDNA3,构建重组TLR-4胞内缺失突变基因真核表达质粒pcDNA3-mTLR4,与pEGFP1-IL8USCS共转染内皮细胞,流式细胞术观察mTLR4对切应力诱导IL-8报告基因表达的影响.结果和讨论(1)未用切应力处理的内皮细胞没有IL-8基因的表达;切应力处理内皮细胞后,1 h IL-8 mRNA表达增加,2 h IL-8 mRNA表达量至最高值,3 h IL-8 mRNA表达量开始下降,4 h后IL-8 mRNA持续相对高表达;各实验组(2.23、4.20、6.08 dyne/cm2)均表现出相同的IL-8 mRNA随时间的变化规律,即IL-8的表达对切应力有时间依赖性.(2)未用切应力处理的内皮细胞没有IL-8基因的表达;切应力处理内皮细胞后,低切应力时IL-8 mRNA表达量明显增加,高切应力时IL-8 mRNA表达量较低.IL-8 mRNA的表达量与内皮细胞所施加的切应力强度呈反变关系;不同的切应力作用时间(1、2 h)均表现出相同的IL-8 mRNA随切应力强度的变化规律.提示流体切应力诱导内皮细胞表达IL-8,不仅与切应力的作用时间有关,而且IL-8的表达量与切应力作用强度有关,两者之间具有明显的直线负相关.直线回归方程:1 h时为y=7.57-0.11x,相关系数r=-0.97;2 h时为y=7.92-0.10 x,相关系数r=-0.96.(3)未用切应力处理的内皮细胞只有极少量的IL-8蛋白质生成;切应力处理内皮细胞1 h后,IL-8蛋白质生成量增加,处理5 h后IL-8蛋白质生成量增加至最高值,处理8 h后IL-8蛋白质生成量下降,10 h后IL-8蛋白质生成量维持在一个较高的水平.各实验组(2.23、4.20、6.08 dyne/cm2)均表现出相同的IL-8蛋白质生成量随切应力作用时间的变化规律.提示流体切应力确实可以诱导内皮细胞生成IL-8,并且IL-8的生成量与切应力的作用时间有关,呈双相性变化.(4)未用切应力处理的内皮细胞只有极少量的IL-8蛋白质生成;切应力处理内皮细胞后,低切应力(2.23 dyne/cm2)时IL-8蛋白质生成量明显增加,为高切应力(19.29 dyne/cm2)时IL-8蛋白质生成量的约6(作用5h)或7倍(作用6h).IL-8蛋白质生成量与内皮细胞所施加的切应力强度呈反变关系;直线回归方程:5 h时为y=760.12-36.06x,相关系数r=-0.978;6 h时为y=781.87-36.66x,相关系数r=-0.980.(5)pEGFP1-IL8USCS转染细胞,层流切应力刺激3 h后IL-8报告基因绿色荧光蛋白表达增强.(6)NF-κB p65免疫荧光细胞化学染色显示,切应力刺激0.5 h,胞核即出现阳性反应,刺激1.5 h后,胞核呈强阳性染色.(7)细胞裂解物免疫印迹显示,刺激10 min时磷酸化IκB即显著增强,1 h后磷酸化IκB印迹强度降到无,而IκB随刺激时间延长而逐渐降低,0.5和1 h后降至测不到IκB.(8)免疫荧光细胞化学染色显示脐静脉血管内皮细胞膜表达TLR-4.RT-PCR和Northern杂交显示,人脐静脉血管内皮细胞表达TLR-2和TLR-4 mRNAs;当切应力刺激1 h后,TLR-4 mRNA表达明显增强.pcDNA3-mTLR4和pEGFP 1-IL8USCS共转染细胞,层流切应力刺激3 h后荧光蛋白表达未明显增强.本实验中我们采用的切应力为2.23、4.20、6.08 dyne/cm2,这些切应力与动脉血管分叉处等低切应力区生理切应力大小相似,在这些低切应力区,血管内皮细胞可分泌IL-8,IL-8转而激活中性粒细胞和单核细胞,调控它们和内皮细胞的黏附,这将触发一系列的病理变化,例如:动脉粥样硬化等.结论流体切应力诱导内皮细胞IL-8 mRNA的表达及IL-8蛋白的生成,在感染及动脉粥样硬化等病理过程中扮演着重要角色.