p53抑制剂对热化疗损伤结肠上皮细胞p53、Bax和MDM2表达的影响

目的探讨p53抑制剂PFT-α(pifithrinalpha,PFT-α)对热化疗诱导原代培养结肠上皮细胞凋亡及p53靶基因Bax和MDM2表达的影响。方法原代培养结肠上皮细胞分为正常对照组、热化疗组和PFT-α加热化疗组,运用顺铂联合温热(43℃)处理结肠上皮细胞30min,对比加入不同浓度的PFT-α后,AnnexinV-FITC/PI染色,流式细胞仪检测细胞凋亡。MTT法分析PFT-α对热化疗杀伤DLD1细胞的影响。Westernblot检测结肠上皮细胞的p53、Bax和MDM2蛋白表达。结果热化疗导致结肠上皮细胞发生凋亡,Bax和MDM2蛋白表达明显高于对照组。PFT-α作用于顺铂联合温热处理结肠上皮细胞后,细胞凋亡率下降呈剂量依赖性,同时p53在结肠上皮细胞胞核/胞质表达比例下降,Bax和MDM2的表达逐渐降低。热化疗杀伤肿瘤细胞的效应并未受到低剂量PFT-α影响。结论PFT-α对热化疗损伤结肠上皮细胞具有保护作用,其机制可能与改变p53核转位和抑制促凋亡基因Bax和MDM2的表达相关,抑制p53可作为克服热化疗抗肿瘤治疗副效应的新策略。     

p53抑制剂对热化疗损伤结肠上皮细胞p53、Bax和MDM2表达的影响

目的 探讨p53抑制剂PFT-α（pifithrin alpha，PFT-α）对热化疗诱导原代培养结肠上皮细胞凋亡及p53靶基因Bax和MDM2表达的影响。方法 原代培养结肠上皮细胞分为正常对照组、热化疗组和PFT-α加热化疗组，运用顺铂联合温热（43℃）处理结肠上皮细胞30min，对比加入不同浓度的PFT-α后，Annexin V-FITC／PI染色，流式细胞仪检测细胞凋亡。MTT法分析PFT-α对热化疗杀伤DLD1细胞的影响。Western blot检测结肠上皮细胞的p53、Bax和MDM2蛋白表达。结果 热化疗导致结肠上皮细胞发生凋亡，Bax和MDM2蛋白表达明显高于对照组。PFT-α作用于顺铂联合温热处理结肠上皮细胞后，细胞凋亡率下降呈剂量依赖性，同时p53在结肠上皮细胞胞核／胞质表达比例下降，Bax和MDM2的表达逐渐降低。热化疗杀伤肿瘤细胞的效应并未受到低剂量PFT-α影响。结论 PFT-α对热化疗损伤结肠上皮细胞具有保护作用，其机制可能与改变p53核转位和抑制促凋亡基因Bax和MDM2的表达相关，抑制p53可作为克服热化疗抗肿瘤治疗副效应的新策略。     

PFT-α对结肠上皮细胞凋亡和周期的影响及机制探讨

目的探讨p53抑制剂(p-fiftythreeinhibitor-alpha,PFT-α)对结肠上皮细胞凋亡、周期的影响及机制。研究PFT-α对热化疗损伤结肠上皮细胞的影响。方法顺铂联合温热处理原代培养结肠上皮细胞30min,对比加入不同浓度PFT-α后,AnnexinV-FITC/PI染色,流式细胞仪检测细胞凋亡。PI染色检测细胞周期。Westernblot检测结肠上皮细胞CyclinB1和Cdc2(Tyr15)表达。结果不同浓度PFT-α作用于热化疗处理的结肠上皮细胞后,细胞凋亡率下降且呈剂量依赖性。流式细胞仪细胞周期分析显示在运用PFT-α后,结肠上皮细胞的G2/M延长,CyclinB1和Cdc2(Tyr15)蛋白表达随PFT-α的剂量升高而逐渐增强。结论PFT-α可能通过促进CyclinB1蛋白表达,Cdc2(Tyr15)磷酸化水平升高,降低CyclinB1/Cdc2活性,细胞停滞于G2/M期,减轻热化疗对结肠上皮细胞的损伤。     

GADD45β基因表达诱导对不同p53状态的肝癌细胞作用

目的：体外合成GADD45β基因全序列表达质粒后，研究GADD45β基因表达诱导对呈不同p53状态的肝癌细胞的作用及可能机制。方法：采用RT-PCR法获得GADD45β基因全序列，插入pDrive穿梭克隆载体和pIRES2-EGFP荧光表达载体后大量扩增获得DNA，结合p53全基因表达质粒pp53-EGFP转染HepG2、Hep3B细胞后，以[^3H]胸腺嘧啶脱氧核苷掺入法(^3H—Tdr)和细胞克隆形成法分析DNA合成变化及细胞生长能力；以双抗体夹心ELISA法测定TGF-β1表达变化。结果：成功合成GADD45β基因全序列和表达质粒，通过流式细胞仪收集转染阳性的荧光表达细胞能显著提高转染效率；转染GADD45β后．具有野生型p53基因的HepG2细胞的细胞克隆形成能力和DNA合成能力明显受到抑制，细胞凋亡明显增加，TGF-β1的表达亦明显受抑。与之相反，缺失p53基因的Hep3B需要同时共转染p53基因后，方出现抑制效应。结论：GADD45β基因能够有效抑制肝癌细胞的生长．其功能需要完整p53基因的辅助和(或)调控。GADD45表达和（或)功能异常，导致p53介导的DNA损伤修复途径异常或阻断，是肝脏细胞恶性转化及形成肿瘤的可能机制。     

PFT-α对结肠上皮细胞凋亡和周期的影响及机制探讨

目的探讨p53抑制剂（p-fifty three inhibitor—alpha，PFT-α）对结肠上皮细胞凋亡、周期的影响及机制。研究PFT-α对热化疗损伤结肠上皮细胞的影响。方法顺铂联合温热处理原代培养结肠七皮细胞30min，对比加入不同浓度PFT-α后，Annexin V—FITC／PI染色，流式细胞仪检测细胞凋亡。PI染色检测细胞周期。Western blot检测结肠上皮细胞Cyclin B1和Cdc2（Tyr15）表达。结果不同浓度PFT-α作用于热化疗处理的结肠上皮细胞后，细胞凋亡率下降且呈剂量依赖性。流式细胞仪细胞周期分析显示在运用PFT-α后，结肠上皮细胞的G2／M延长，CyclinB1和Cde2（Tyr15）蛋白表达随PFT—α的剂量升高而逐渐增强。结论PFT-α可能通过促进CyclinB1蛋白表达，Cde2（Tyr15）磷酸化水平升高，降低CyclinB1／Cde2活性，细胞停滞于G2／M期，减轻热化疗对结肠上皮细胞的损伤。     

H2O2诱导肝细胞凋亡时p53、bcl—2 mRNA的表达及其意义

目的 探讨H2O2诱导人类正常肝细胞系（L02细胞）凋亡时p53、bcl-2 mRNA表达的意义及丹参有效成分Rxa对其表达的影响。方法 以正常L02细胞为对照（L组）,以10μmol/L H2O2诱导L02细胞凋亡为细胞模型（LH组）,观察Rxa处理（LaH组,Rxa 2mmol/L）对p53、bcl-2 mRNA表达（原位杂交结合图像分析处理）的影响。结果 LH组2－6h p53 mRNA表达随凋亡细胞指数增高而增强,6－8h表达下降;bcl-2 mRNA表达弱。相比较LaH组各时限检测点p53 mRNA表达均低于LH组,bcl-2 mRNA表达较强（P＜0．01）。结论 Rxa可通过p53的细胞周期调控、DNA损伤修复作用和bcl-2的抗凋亡作用减轻L02细胞过氧化损伤。     

H_2O_2诱导肝细胞凋亡时p53、bcl-2mRNA的表达及其意义

目的　探讨H2 O2 诱导人类正常肝细胞系 (L0 2细胞 )凋亡时p5 3、bcl 2mRNA表达的意义及丹参有效成分Rxa对其表达的影响。方法　以正常L0 2细胞为对照 (L组 ) ,以 10 μmol/LH2 O2 诱导L0 2细胞凋亡为细胞模型 (LH组 ) ,观察Rxa处理 (LaH组 ,Rxa 2mmol/L)对 p5 3、bcl 2mRNA表达 (原位杂交结合图像分析处理 )的影响。结果　LH组 2～ 6hp5 3mRNA表达随凋亡细胞指数增高而增强 ,6～ 8h表达下降 ;bcl 2mRNA表达弱。相比较LaH组各时限检测点p5 3mRNA表达均低于LH组 ,bcl 2mRNA表达较强 (P <0 .0 1)。结论　Rxa可能通过 p5 3的细胞周期调控、DNA损伤修复作用和bcl 2的抗凋亡作用减轻L0 2细胞过氧化损伤。     

ATM/H2AX与冷冻精子DNA损伤修复

精液冷冻保存是辅助生殖领域中的一项重要技术,但冷冻本身可引起精子DNA损伤,其中过量活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成起主要作用;而DNA损伤精子仍可以受精形成胚胎,影响生殖结局。蛋白激酶ATM(ataxia-telangiectasia mutated)是DNA损伤的信号感受器,可启动级联反应磷酸化多种蛋白分子调控DNA损伤修复和细胞周期检查点。在ATM的下游分子中,组蛋白H2AX(histone H2AX)被磷酸化激活后参与了DNA损伤精子受精后的修复,与ATM相互作用共同调控胚胎发育过程的细胞周期。ATM/H2AX参与DNA损伤修复以及细胞周期检查点信号转导,以及在氧化应激性DNA损伤修复中的潜在作用,提示其可能参与了冷冻精子氧化应激性DNA损伤的修复过程。     

小鼠乳腺癌中p53与bcl-2/bax基因表达的相关性研究

目的探讨p53基因和bcl-2/bax基因在乳腺癌发病机制中的作用以及它们之间的相互关系。方法以小鼠乳腺癌BCML-TA299可移植模型为研究对象,用免疫组织化学染色法观测α-干扰素(INF-α)干扰后p53基因与bcl-2/bax表达的关系。结果实验性乳腺癌BCML-TA299治疗组荷瘤鼠生存期较对照组延长,且随着时间的推延治疗组肿瘤的体积明显低于对照组的肿瘤体积;治疗组与对照组比较,肺转移率低。对照组p53蛋白阳性表达率为92.01±0.48,而治疗组中p53呈阴性表达。对照组瘤组织bcl-2蛋白表达为50.21±0.52,bax蛋白表达为12.08±0.13;治疗组瘤组织bcl-2蛋白表达为12.01±0.2,bax蛋白表达为48.19±0.57。对照组p53蛋白表达与bcl- 2呈正相关,而与bax呈负相关(P<0.05);治疗组中p53呈阴性表达,bcl-2和bax表达与对照组结果相反。结论bcl-2和bax的表达受p53调节。p53、bcl-2/bax在乳腺癌发病机制中起着较重要的作用。     

DNA修复蛋白磷酸化组蛋白H2AX在胃癌中的表达及其意义

DNA双链断裂(DSBs)是真核生物后果最严重的DNA损伤之一[1].如果DSBs不能及时而准确地修复,可能导致基因突变、基因组不稳定、细胞凋亡甚至癌症的发生[2].磷酸化H2AX(γ-H2AX)是启动DSBs修复的关键因子,其在维持基因组稳定性方面具有重要作用[3].已有研究结果表明γ-H2AX在多种肿瘤中异常表达,但在胃癌中的研究不多本研究旨在观察γ-H2AX在胃癌的表达,并探讨其临床意义. 一、材料和方法 1.一般资料:收集2006年1月至2008年10月于广西医科大学胃肠腺体外科进行手术切除的胃癌标本30例,其中男16例,女14例;年龄≤60岁18例,年龄＞60岁12例,平均年龄53岁.所有患者术前未接受化疗、放疗、免疫治疗以及其他针对肿瘤的治疗.按照国际抗癌联盟1997年TNM分期标准进行肿瘤分期.γ-H2AX抗体、β-肌动蛋白(β-actin)抗体购自美国Abcam公司;SP即用型试剂盒购自北京中杉金桥生物公司.     

环氧合酶-2、p53在骨肉瘤中的表达及临床意义

[目的]探讨环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,cox-2)蛋白、p53蛋白在骨肉瘤、骨软骨瘤组织中表达的差异性、相关性及临床意义.[方法]回顾本科1998～2004年间骨肉瘤患者档案,筛选术后石蜡切片40例作为试验组.男24例,女16例;年龄8～38(18.68±6.47)岁.筛选同期骨软骨瘤患者术后石蜡切片20例作为对照组.男13例,女7例;年龄9～27(17.95±4.77)岁.应用免疫组化(S-P)进行染色.光镜下观察染色切片,cox-2蛋白染色以组织胞浆内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞;p53蛋白染色以胞核内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞.随机观察5个高倍视野,依照阳性细胞所占比例分为"-"阳性细胞所占比例＜5%;" "阳性细胞所占比例5%～25%;" "阳性细胞所占比例26%～50%;" "阳性细胞所占比例＞50%.分别统计两者的阳性表达情况,所得数据应用SAS v6.12统计软件处理.采用chi-square test进行x2检验,α=0.05为水准,分别统计两者在骨肉瘤、骨软骨瘤组织细胞中阳性表达的差异性.采用Spearman等级相关分析法检验两者在骨肉瘤中阳性表达之间的相关性,α=0.05为水准.[结果]骨肉瘤组织中cox-2、p53蛋白的阳性率分别为67.5%和55.0%,显著高于对照组骨软骨瘤组织(P＜0.05).cox-2、p53蛋白在骨肉瘤中的表达密切相关(rs=0.58,P＜0.05).[结论]在骨肉瘤中,cox-2、p53参与了骨肉瘤的发生、发展,两者密切相关,相互协同.临床上联合检测两者对骨肉瘤的早期诊断和预后有重要意义.     

失重环境对大鼠肝细胞凋亡的影响

目的 探讨失重环境对大鼠肝细胞凋亡的影响.方法 成年雄性Wistar大鼠84只,按随机数字表法分为失重组和对照组,每组又分别设1～7 d共7个时相点,每时相点失重和同步对照各6只大鼠.采用尾悬吊法建立失重动物模型,应用TUNEL法原位检测失重大鼠肝组织中凋亡细胞,免疫组织化学PV-6001法检测大鼠肝组织p53表达.对结果进行方差分析.结果 各组悬尾大鼠肝组织中均可见阳性染色细胞,细胞核呈黄棕色颗粒,少数细胞质淡染;失重1～5 d组凋亡细胞指数明显高于对照组(F=77.608,P<0.05),失重6 d和7 d组细胞凋亡指数与对照组接近.p53阳性染色颗粒均位于细胞核内,呈颗粒状、弥漫性或混合型等多种表现,悬吊早期大鼠肝组织中p53表达阳性指数明显高于对照组(F=113.063,P<0.05),失重1 d组最为明显,悬吊后期和对照组标本中见少量阳性染色细胞.结论 肝细胞凋亡和p53表达变化与失重应激反应和失重耐受有密切关系.     

p53上调促凋亡因子在胃癌组织中的表达及其临床意义

目的 研究p53 上调促凋亡因子(p53 up-regulated modulator of apoptosis,PUMA)在胃癌绀织中的表达及其与临床病理学指标的关系.方法 应用组织芯片和免疫组化Envision方法 检测84例胃癌及配对的癌旁正常胃黏膜组织中PUMA和p53蛋白表达;分析PUMA表达与临床病理学指标的关系;分析PUMA表达与p53表达的相关性.结果 PUMA在胃癌组织中的阳性率(33%)低于癌旁正常胃黏膜组织(62%),两者之间筹异有统计学意义,P<0.01;PUMA的表达与肿瘤浸润深度、pTNM分期及预后有关(P<0.05).p53在胃癌组织中的表达(45.2%)显著高于癌旁正常胃黏膜组织(0),两者之间差异有统计学意义,P<0.01;PUMA与p53表达有显著的相关性(P<0.05).结论 PUMA低表达与胃癌浸润深度、胃癌中、晚期及预后不良相关,有可能成为胃癌预后的预测指标.     

p53蛋白对瘢痕疙瘩成纤维细胞端粒酶活性的抑制作用

目的探讨p53蛋白对瘢痕疙瘩成纤维细胞中端粒酶活性的影响,明确p53蛋白与端粒酶活性之间的相互关系。方法将取自于瘢痕疙瘩患者的瘢痕疙瘩组织标本随机分成A、B两组。A组：采用腺病毒介导法,将野生型p53基因转染至瘢痕疙瘩成纤维细胞中;B组：未将野生型p53基因转染至瘢痕疙瘩成纤维细胞中。用间接免疫荧光和Western blot两种方法检测A、B两组成纤维细胞中p53蛋白的表达,用TRAP-ELISA法检测A、B两组成纤维细胞中端粒酶活性。结果A组的成纤维细胞中p53蛋白的表达明显高于B组;而端粒酶活性明显低于B组,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论p53蛋白能够抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞中端粒酶的活性。     

瘢痕中缺氧诱导因子-1α的表达及其与凋亡的关系

目的 探讨瘢痕内缺氧环境减轻的机制。方法 采用免疫组化法检测烧伤后肉芽、不同时期瘢痕和正常皮肤中缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）、p53的表达，采用权重方法分别对各组瘢痕的HIF-1α、p53表达结果进行量化，分析各自规律及相互间关系。结果 随着瘢痕的成熟，HIF-1α表达强度逐渐减弱，p53表达强度在1年内逐渐增强，相互间具有负相关性（P〈0．01）。结论 p53在瘢痕成熟过程中起重要作用，HIF-1α可能通过协同p53诱导细胞凋亡，减少耗氧来减轻缺氧环境。     

瘢痕疙瘩家系p53基因高发突变区基因突变检测的实验研究

目的探讨瘢痕疙瘩家系样本中有无p53基因高发突变区的基因（外显子4—8）突变以及与瘢痕疙瘩发病的关系。方法采用PCR及基因测序技术，以家系患者的瘢痕疙瘩组织及其周围正常皮肤、外周静脉血为研究对象。以家系中外来正常成员外周静脉血为正常对照，检测p53基因外显子4—8的基因序列。结果所有被检测样本的p53基因外显子4—8均未发现突变。结论瘢痕疙瘩家系样本中。p53基因突变与散发性瘢痕疙瘩患者的p53基因突变有很大的区别。提示p53基因可能与瘢痕疙瘩家系的发病无关。     

Survivin、VEGF和p53在乳腺癌组织中的表达及相关性研究

目的:研究凋亡抑制基因Survivin、血管内皮生长因子(vascular endothelial groth factor, VEGF)、p53蛋白在乳腺癌组织中的表达,并探讨其临床意义.方法:用免疫组织化学SP法,对60例乳腺癌组织(A组)、22例乳腺良性增生组织(B组)及10例乳腺癌旁正常组织(C组)中的Survivin、VEGF及p53蛋白进行检测.结果:Survivin阳性表达率在A组和B组分别为76.7%(46/60) 和18.2%(4/22),在C组不表达(P＜0.05);Survivin表达与乳腺癌病理组织学分级、HER2表达有关.VEGF阳性表达率在A组和B组分别为73.3%(44/60)和31.8%(7/22),在C组为10%(1/10)(P＜0.05);VEGF表达与乳腺癌淋巴结转移、病理组织学分级、HER2表达及临床分期有关.p53阳性表达率在A组和B组分别为51.7%(31/60)和13.6%(3/22),在C组不表达(P＜0.05);p53表达与乳腺癌肿瘤大小、淋巴结转移、病理组织学分级、HER2表达及临床分期均有关.在乳腺癌组织中Survivin的表达与VEGF、p53的表达呈正相关.结论:Survivin、VEGF及p53 在A组的表达明显高于B组和C组,并与转移和病理分级等生物学特征有关,在乳腺癌发生、发展中可能起重要作用,Survivin有望成为乳腺癌基因治疗的新靶点.     

乳腺浸润性导管癌钼靶X线表现与腋窝淋巴结转移及p53蛋白表达的关系

目的 探讨乳腺浸润性导管癌X线征象与腋窝淋巴结转移、p53蛋白表达的关系.方法 观察72例浸润性导管癌的X线征象及腋窝淋巴结转移状况,应用免疫组织化学检测p53表达,分析乳腺癌X线征象与腋窝淋巴结转移、p53表达的关系.结果 淋巴结转移组p53阳性表达率56.7%,较未转移组31.4%高(P＜0.05);≥2 cm组和血管增粗组p53阳性表达率、淋巴结转移率分别为66.7%、70.0%和56.4%、66.7%,均较＜2 cm组28.6%、38.1%和血管正常组30.3%、33.3%高(P均＜0.01);毛刺组淋巴结转移率70.8%高于无毛刺组41.7%(P＜0.05).结论 乳腺癌X线征象可评价腋窝淋巴结转移及p53表达,为临床诊治及预后判断提供参考.

Abstract：

Objective To investigate the relationship among the mammography signs, the axillary lymph node ( LN) metastasis, and the p53 expression of infiltrating ductal breast carcinoma. Methods Mammography signs and axillary LN metastasis were analyzed in 72 cases of infiltrating ductal carcinoma. Immunohistochemistry was used to detect p53 expression in tumor specimens. The relationship among the mammography signs, the axillary LN metastasis and the p53 expression was assessed. Results The positive rate of p53 expression was 56. 7% in the patients with axillary LN metastasis, which was higher than 31.4% in the patients without axillary LN metastasis ( P ＜ 0. 05 ). The rate of axillary LN metastasis and p53 expression were 66. 7% and 70. 0% in the tumors larger than 2 cm, 56. 4% and 66. 7% in the tumors with more vascular signs, 28. 6% and 38. 1% in the tumors less than 2 cm, 30. 3% and 33. 3% in the tumors with normal vascular signs (P ＜0. 01) , respectively. The rate of axillary LN metastasis in the patients with spinulation was 70. 8% , which was higher than 41.1% of patients without spinulation (P ＜0.05). Conclusion Mammography signs of breast cancer can evaluate the axillary LN metastasis and p53 expression, and also can provide objective reference for clinical diagnosis, treatment and prognosis of breast carcinoma.     

新型增殖性腺病毒的构建及对肝癌细胞的抑制

目的 构建携带p53基因新型增殖性腺病毒CNHK600-p53,研究其对肝癌细胞株抑制效应是否优于Ad-p53.方法 PCR扩增p53基因,利用酶切连接方法 将其插入CNHK600载体,PCR鉴定.经293细胞包装成病毒,抽提病毒DNA,PCR鉴定.氯化铯密度梯度离心法纯化病毒,TCID50 方法 测病毒滴度.病毒增殖实验检测病毒在不同细胞增殖能力.四甲基偶氮唑盐(methyl-thiazolyl tetrazolium assay,MTT)法观察CNHK600-p53、Ad-p53两种病毒分别对肝癌细胞株的抑制率.结果 成功构建新型增殖性腺病毒载体CNHK600-p53;293细胞包装成病毒,PCR方法 鉴定无野生型病毒存在;病毒滴度为1.99×10~（10）pfu/ml;CNHK600-p53在肝癌细胞HepG2、SMMC-7721内复制能力明显高于正常肝细胞HEL-1和L02.对6种肝癌细胞(PLC/PRF5、SMMC7721、HepaG2、BEL-7402、BEL-7404、QGY-7703)而言,随着MOI值的不断增高.其对肝癌细胞的抑制作用也不断增强;在相同MOI情况下,CNHK600-p53组较Ad-p53组的细胞抑制率高(P＜0.05).当细胞抑制率达到80%以上时.两组之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 利用新型增殖性腺病毒CNHK600一p53较 Ad-p53能更有效的抑制肝癌细胞,可能成为肝癌的基因治疗更有效的一种基因治疗手段.